MICROSCOPIO: BASES Y APLICACIONES

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1 FORMAS Y TIPOS CELULARES OBJETIVOS MICROSCOPIO: BASES Y APLICACIONES Conocimiento y manejo del microscopio óptico común Realización de preparaciones microscópicas sencillas. Observación de células procariotas y eucariotas (animales y vegetales) La unidad de organización de los seres vivos es la célula. Esta puede ser estudiada bajos distintos aspectos: morfológico, químico y fisiológico. A cada uno de estos aspectos le corresponden métodos de estudios particulares. METODOS DE ESTUDIOS MORFOLOGICOS Los estudios morfológicos se realizaron mediante el uso de denominados microscopios instrumentos de aumento El microscopio de luz es un sistema óptico de lentes convergentes que cumplen Ia función de aumentar Ia irnagen de un objeto. CARACTERISTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO Entre los instrumentos ópticos conocidos con el nombre de microscopio se incluyen los llamados microscopios simples o lupas, compuestos por una sola lente, o un solo sistema de lentes convergentes; y los microscopios compuestos, cuya parte óptica consta de dos lentes, o dos sistemas de lentes convergentes: ocular y objetivo. El micoscopio simple da una imagen aumentada, derecha y virtual. El microscopio compuesto da una imagen aumentada, invertida y virtual. DESCRIPCIÓN DEL MICROSCOPIO COMPUESTO En el microscopio distinguimos un sistema óptico, destinado a la iluminación y obtención de una imagen muy aumentada del objeto examinado; y un sistema mecánico, cuya finalidad es la de sostener convenientemente los elementos ópticos y los preparados que se examinan. Sistema mecanico Recibe también el nombre de estativo o montura del microscopio. Consta de pie, columna, tubo, mecanismo de movimiento y platina. PIE Soporte sobre el cual se apoya el microscopio. La COLUMNA es un vástago articulado con el pie. TUBO Es un tubo hueco que separa los dos grupos de lentes (ocular y objetivo). Mecanismo de movimiento:

2 TORNILLO DE ENFOQUE (MACROMÉTRICO) Acerca o aleja rápidamente el objetivo a la preparación para hacer un enfoque aproximado. Se usa sólo con los objetivos de menor aumento. TORNILLO MICROMÉTRICO Permite enfocar con precisión, moviendo muy lentamente el objetivo REVÓLVER PORTAOBJETIVOS Permite colocar en posición de trabajo a los distintos objetivos con que cuenta el microscopio. Presenta unas ranuras que facilitan la fijación del objetivo en la posición correcta. PLATINA Es la superficie sobre la cual se colocan las preparaciones. Tiene un orificio en su centro para permitir el paso de la luz. En algunos microscopios está dotada de un sistema con dos tornillos que permiten el desplazamiento preciso de la preparación. PINZAS Sirven de sujeción de la preparación sobre la platina. TORNILLO DEL CONDENSADOR Permite subir o bajar el condensador respecto a la platina para mejorar la iluminación. Parte Optica: esta parte consta de los siguientes elementos: Dos sistemas de lentes convergentes centradas: Objetivo y Ocular. Condensador. Diafragma. Fuente luminosa. 1. Objetivo: Llamado asi porque se halla próximo al objeto a examinar. Es un sistema de lentes ubicadas en la parte inferior del tubo. Existen dos tipos de objetivos: los objetivos secos y los objetivos a inmersión. Los objetivos secos son aquellos en los que entre la lente y el objeto existe una pequeña capa de aire. Este tipo de objetivos son los de menor aumento. Los objetivos a inmersión son aquellos en los cuales se interpone entre Ia lente y el objeto un liquido (aceite de cedro) el cual tiene un índice de refracción que es semejante al del cristal de la lente. 2. Ocular: es llamado de ésta forma porque se halla próximo al ojo del observador. Está formado por un sistema de lentes convergentes. Los microscopios pueden tener dos modelos de oculares: modelos de un solo ocular (monocular) o modelos con dos oculares (binoculares). Su función es la de aumentar la imagen proyectada por el objetivo. 3. Condensador: recibe la luz y la intensifica, permitiendo una mayor claridad de Ia imagen. 4. Diafragma: su función es la de graduar la cantidad de luz que reciba el objeto. 5. Fuente luminosa: es una lámpara que se encuentra al pie del microscopio. Habitualmente los microscopios la tienen incorporada. En el caso nuestro, la luz es provista por un foco, que es captada por un espejo que posee una cara plana y otra cóncava, que proyectan el haz de rayos que iluminan el objeto, dirigiéndolo hacia el eje óptico. Formación de la imagen en el Microscopio

3 La imagen en un microscopio se forma por Ia transmisión de los rayos provenientes de una fuente luminosa a través del objeto. Los rayos luminosos atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el diámetro del haz lumínico que penetra por el condensador. Este último, está formado por un sistema de lentes convergentes que concentra y proyecta el haz lumínico sobre el objeto a examinar, a través de la abertura de la platina. El objetivo recoge la luz que atravesó el objeto examinado y proyecta una imagen real, invertida y aumentada que se forma dentro del tubo y que es recogida por el ocular que es la segunda lente, la cual forma una imagen virtual, invertida y aumentada del objeto examinado. Se tienen dos lentes: Objetivo y ocular y un objeto. Este objeto lanza un rayo paralelo sobre el lente objetivo que pasa por el foco y un rayo que pasa por el foco y se refleja paralelo, formando con el choque de estos 2 rayos la imagen 1, que entra a ser objeto para el lente ocular (2do lente), esta imagen 1 que es "objeto" refracta un rayo por el centro del lente y otro rayo paralelo que pasa por el foco formando asi con las prologanciones de estos rayos la imagen 2, que es la imagen final observada por nosotros. Aumento: E s l a p r o p o r c i ó n e n t r e e l t a m a ñ o d e l a i m a g e n o b s e r v a d a a l microscopio y el tamaño real del objeto. El aumento total puede calcularse como el producto del aumento del ocular por el del objetivo. Cada lente objetivo lleva inscripto su aumento: 5X, 10X, 40 X o 100X. (el signo X significa aumento ) La imagen aumentada producida por el objetivo, es tomada por el ocular, y magnificada nuevamente. La imagen definitiva (que es invertida, respecto a la original) resulta del producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Por ej: OCULAR 10x OBJETIVO: 40x AUMENTO TOTAL: 1Ox40=400X Profundidad de campo o de foco o poder de penetración:

4 Es el espesor del preparado que se observa con nitidez, es decir, profundidad de planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos medianos o grandes, al m ov er e l tornillo micrométrico, podemos observar sólo pequeños espesores con nitidez, mientras que por encima y por debajo de esta zona la imagen se desvanece. La profundidad de foco guarda relacion inversa con el aumento: es menor cuanto mayor es el aumento utilizado. Con aceite de inmersión la profundidad de campo es muy escasa. Poder de resolución (PR): E s l a c a p a c i d a d d e l a s l e n t e s d e d i s t i n g u i r o r e s o l v e r (mostrar separados) con nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia mínima que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, en vez de verlos como uno solo. Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que separa los puntos entre sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto mayor sea el poder resolutivo del objetivo, más finos serán los detalles de la preparación que puedan distinguirse. Puede determinarse en base a la longitud de onda de la luz utilizada (λ) y directamente proporcional a la apertura numérica (AN). El valor de AN varia con cada objetivo y esta inscripto con números decimales pequeños en cada uno de ellos. El PR se puede estimar indirectamente calculando el limite de resolución. Limite de resolucion (LR) : Es la distancia mínima que puede existir entre dos puntos para que puedan ser distinguidos como tales. Nuestras posibilidades de estudiar los componentes de los distintos niveles de organización de la materia viva están limitados por el poder de resolución del ojo humano, que puede distinguir dos puntos separados por 0,1mm o mas, del microscopio óptico cuyo, limite de resolución es de 0,2 µm y del microscopio electrónico que alcanza un límite resolutivo de aproximadamente 4 A. Por ejemplo: si fotografiamos con el microscopio óptico dos líneas que están a menos de 0,2mm de distancia entre si, la fotografía podría ampliarse indefinidamente, pero las líneas siempre se verían como una soal. LR= λx0.61/an El límite de resolución es INVERSAMENTE PROPORCIONAL al poder de resolución, es decir que al aumentar el poder de resolución se pueden diferenciar puntos que estan separados entre si a distancias cada vez menores (a mayor PR, menor LR) 1 CENTÍMETRO (cm) = 10-2 METROS (metros) = 1/100 m 1 MILÍMETRO (mm) = 10-3 METROS (m) = 1/1000 m = 1/10 cm 1 MICRÓMETRO (µm) = 10-3 cm = 1/1000 cm 1 NANÓMETRO (nm) = 10-9 (metros) m = 1/ m = 1/ cm 1 METRO = 10 2 cm = 10 3 mm = 10 6 µm = 10 9 nm 1Anstrong = 1 Å = 1/10 nm = 10-8 cm

5 El nivel de observación se halla limitado por el poder de resolución del microscopio utilizado. El poder de resolución de cada microscopio, determina entonces, un limitado rango de dimensiones dentro del cual deber estar la estructura biológica en estudio para que pueda ser discriminada. Existen distintos tipos de microscopios en la actualidad entre los cuales podemos nombrar: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Se basa en que una sustancia natural de las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos. Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA (MI) Permite determinar las diferencias ópticas de las estructuras celulares. Además se calcula el peso seco de una célula o de una estructura observada. Tiene la ventaja de reflejar cambios de color en las células vivas. El MI da imágenes tridimensionales (efecto 3D), lo que con un procesador adecuado nos permite medir el grosor de las muestras observadas. MICROSCOPIO DE FONDO CLARO Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen. El campo del microscopio está intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen más oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos. MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

6 La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucléicos, y proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada célula. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE Se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros. Se usa una iluminación por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto. Una muestra microscópica normalmente se visualiza porque su densidad varía de unas zonas a otras. Con iluminación de campo claro es muy difícil ver detalles de una muestra completamente transparente, (todas las zonas son de la misma densidad). Sin embargo, no todas tienen el mismo índice de refracción. MICROSCOPIA ELECTRONICA El avance trascendental en la Biología celular lo constituyó el desarrollo del microscopio electrónico. El microscopio electrónico utiliza en lugar de un haz de luz (fotones), haces de electrones de una longitud de onda (0.05 A).Esta longitud de onda resulta veces inferior a la de la luz empleada habitualmente (5500A) y logra un aumento y resolución muy superior a la de los microscopios comunes u ópticos y permite estudiar la ultraestructura o morfología submicroscópica de la célula.

7 La microscopía electrónica de transmisión se basa en la dispersión de electrones que inciden y pasan a través del objeto de manera que la imagen refleja la falta de electrones que fueron dispersados. Es el instrumento indicado para el estudio de la ultraestructura de la célula, es decir la morfología detallada de los componentes de la misma. Esta capacidad es consecuencia de su gran poder de resolución, que resulta de su notable disminución en la longitud de onda que utiliza. La microscopía electrónica de barrido (scanning) utiliza los electrones que se reflejan en la superficie del objeto y producen una imagen tridimensional. Una de sus mayores cualidades del ME de barrido es su capacidad de enfocar simultáneamente elementos ubicados en distintos planos, es decir, tienen mucha profundidad de foco, con lo cual se logra la imagen tridimensional. DIFERENCIAS ENTRE EL MICROSCOPIO OPTICO Y EL MICROSCOPIO ELECTRONICO MO ME Imagen dada por Interferencia de rayos Dispersión de electrones luminosos Fuente Luz (fotones) Filamento de tungsteno Elementos Lentes: ocular, objetivo, Bobinas electromagnéticas condensador Estudian células Vivas o muertas Muertas Observación de la muestra Coloreada o no Sin coloración o con aumento de contraste con técnicas especiales Límite de 2500 A a 0.25 micrómetros 10 A a 2 A resolución Longitud de onda 5500 A (término medio) A Aumento 500X a 1500X 20000X a X con lente intermedia X o más con aumento fotográfico Nivel de observación Estructuras Ultraestructura La observación por transmisión (de fotones o electrones) exige que los objetos a estudiar respondan a ciertas condiciones de espesor y contraste. Para que la luz o los electrones puedan atravesarlos, el espesor no debe exceder de 10 micrómetros y 0.1 de micrómetro respectivamente. Nivel de observación Macroscópico Límite inferior 0.1 mm Microscópico Límite inferior 0.1 micrómetro ( m) Submicroscópico Límite inferior 10 A Microscópico Límite inferior 1 A Instrumento Dimensión Nivel de estructura biológica Ojo y lente simple Desde 0.2 mm Órgano Microscopio común Varios tipos de microscopios Microscopio de polarización Microscopio electrónico Desde 100 m hasta 0.2 Desde 1 m hasta 0.1 Desde 1000 A hasta 10 A Tejidos Células Bacterias Componentes celulares Virus Macromoléculas Difracción de rayos X Desde 10 A hasta 1 A Moléculas y átomos

8 Con el microscopio óptico se pueden observar: La forma general de la mayoría de las células procariontes La forma general de las células eucariontes Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleolo/s, cromosomas, mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilios, centríolos, vacuolas, pared celular. Estas estructuras se identifican con claridad utilizando alguna técnica accesoria de preparación de la muestra. No se pueden observar con el M.O. Las bacterias más pequeñas La estructura interna de las células procariotas La estructura de las organelas eucariotas La membrana plasmática Los conjuntos membranosos como retículo endoplasmático rugoso (RER) y aparato de Golgi, aunque por ciertas técnicas puede revelarse su ubicación Los ribosomas

9 ACTIVIDAD N1: El area le proveerá de un preparado fijo con una letra impresa en el portaobjetos, para su observación. 1) Ajuste preliminar e iluminación del campo. a) Usar el tornillo macrométrico para elevar el tubo o bajar la platina con el fin de que los objetivos no la toquen al hacer girar el revólver. b) Girar el revólver de modo que el objetivo de menor aumento (el más corto) quede alineado por el ocular. c) Abrir el diafragma todo lo posible y seleccionar la iluminación correcta. Para ello utilizar el condensador y el diafragma, y mover el espejo de manera que capte la luz del foco que tiene sobre la mesada. 2. Enfoque. a) Usar el tornillo macrométrico y elevar el tubo o mover la platina hasta que haya un espacio de aproximadamente 1 cm entre el objetivo de menor aumento y la superficie de la platina. b) Colocar el portaobjetos sobre la platina y sostener con las pinzas. Mirar a través del ocular y elevar lentamente hasta obtener una visión clara. c) Realizar un enfoque fino de la estructura con el tornillo micrométrico hasta observar con total nitidez. d) Hacer girar el revólver y el portaobjetivo de modo que el objetivo de gran aumento quede alineado con el ocular (asegurándose que el extremo del objetivo no toque el cubreobjeto. Si esto ocurre debe repetirse toda la secuencia). e) Si el preparado no se observa con nitidez usar el tornillo micrométrico para el enfoque final. f) Si se va a usar el objetivo de inmersión (el más largo) depositar una gota de aceite de cedro sobre el portaobjeto. Bajar lentamente el objetivo hasta tocar el preparado y enfocar con el micrométrico. 3. Práctica. a) Observe el portaobjetos que presenta la letra A y describa tal coma lo ve a simple vista y a través del microscopio óptico. b) Observe el preparado que posee la letra F. Describa su posición tal como lo ve a simple vista y a través del microscopio óptico. c) Mire a través del ocular y mueva el portaobjetos hacia delante lentamente. Hacia que lado se mueve la letra? d) Mueva el portaobjetos hacia la derecha. En que dirección se desplaza la letra? e) Como es la imagen que recibe su ojo con respecto al objeto?....

10 Actividad N2: PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Célula procariótica Las células procariotas pertenecen al reino Monera. Dentro de este reino encontramos a las bacterias que fueron las primeras células en aparecer sobre la tierra, precediendo a las eucariotas Pueden adoptar distintas formas y por ello tomar nombres particulares, estando en forma solitaria o en agrupaciones. Forma de las bacterias - Cocos: tienen forma esférica. Los cocos que forman racimos se conocen como estafilococos. Otros aparecen en cadena, son los estreptococos. - Bacilos: tienen forma de bastones. La mayoría de los bacilos aparecen en forma individual, pero pueden aparecer en pares, diplobacilos, o en cadena, estreptobacilos. - Espirilos: cuando tienen forma helicoidal. - Vibrios: tienen forma de coma. Finalidad: Estudio de las formas y agrupaciones bacterianas Materiales: cultivo bacteriano en suspensión. Coloque una gota de la suspensión bacteriana directamente sobre el portaobjetos. Aplique sobre ella con mucho cuidado un cubreobjetos, coloque en el microscopio y luego utilice el tornillo micrométrico hasta enfocar. b) Observe y dibuje los tres tipos morfológicos fundamentales de bacterias: Cocos, Bacilos, Espirilos, aislados o agrupados: Diplococos, Estreptococos, Estafilococos, Sarcinas, Estreptobacilos. Celula eucariotica

11 Finalidad Observación de levaduras Hemos elegido para esta parte del trabajo práctico las levaduras, hongos eucariontes unicelulares que se utiliza para conseguir una fermentación industrial (Saccharomyces cerevisiae) y que es un organismo capaz de respirar aeróbica o anaeróbicamente Pueden hallarse aisladas o en pequeños grupos. Algunas presentan brotes que han sido originados por el proceso de gemación (reproducción sexual). Materiales: Levadura fresca de panadería Tubo de ensayo Porta y cubreobjeto Método 1. Tomar una pequeña porción de levadura y colocarla en un tubo de ensayo 2. Agregar agua tibia en cantidad suficiente como para conseguir una suspensión muy diluida. 3. Colocar una gota de la suspensión en un portaobjeto y cubrir con el cubreobjetos. 4. Observar primero con bajo aumento y luego con el mayor, sin usar el de inmersión Resultados: 1) Dibujar una parte del campo con las levaduras a pocos aumentos. 2) Dibujar a gran aumento, señalando, si lo observa, núcleo y brotes. Diagnostico: Aumento;... Aumento:.. Cuestionario:

12 1) Identifica sobre el siguiente dibujo cada uno de los componentes del microscopio descritos más arriba: 2) Indica qué partes del microscopio están relacionadas con cada una de las siguientes funciones: Sirven para aumentar el tamaño aparente del objeto que estamos observando Sirven para iluminar correctamente la preparación Sirven para sujetar o mover otras partes del microscopio 3) Las preparaciones se montan empleando unos pequeños vidrios como los que aparecen en los siguientes dibujos. Señala cómo se llama cada uno de ellos.

13 4) Determina el aumento total con el que estás observando si empleas la combinación de ocular y objetivo que aparece en el dibujo siguiente: Aumento del ocular: Aumento del objetivo: Aumento total: 5) Para observar una preparación microscópica no basta con situarla en la platina y poner los ojos en el ocular, sino que hay que seguir un procedimiento cuyos pasos se deben seguir con meticulosidad. A continuación se indican estos pasos, pero están desordenados; señala poniendo el número que le corresponda delante, el orden en el que debe realizarse este procedimiento. Asegúrate de que está puesto el objetivo de menor aumento y que éste está suficientemente alejado de la platina. Coloca la preparación de tal manera que el objeto de observación quede situado en el centro del orificio de la platina y, por supuesto, con el cubreobjetos hacia arriba. Dibuja los objetos observados. El dibujo debe ser fiel a lo que observamos pero podemos suprimir detalles innecesarios para simplificarlo (por ejemplo, si hay muchas células semejantes en el campo de visión, no es necesario dibujarlas todas, sino que bastará si nos fijamos en algunas y las dibujamos con precisión). Junto a estos dibujos debe ir una indicación de los aumentos con que se ha realizado la observación y el tipo de coloración. Mirando a través del ocular, y con el objetivo de menor aumento puesto, asegúrate de que el campo de observación está uniformemente e intensamente iluminado. Para conseguirlo deberás orientar correctamente el espejo hacia la fuente

14 de luz (o encender la lámpara del microscopio si la lleva incorporada) y abrir a tope el diafragma. Mirando lateralmente el microscopio acerca el objetivo de menor aumento (el más corto) a la preparación para después, mirando a través del ocular, enfocar (con el tronillo macrométrico) alejándolo Moviendo muy lentamente la preparación centra la zona más interesante en el campo de visión. Si no lo haces así, al cambiar a un aumento mayor puede que no consigas ver nada ya que cuanto mayor es el aumento, menor es el campo de visión. Pasa al objetivo siguiente girando el revólver y corrige ligeramente el enfoque con el tornillo micrométrico. En todo momento tienes que asegurarte de que al girar el revólver has anclado el objetivo perfectamente en su posición (existe un pequeño tope que te lo indica). Vuelve a poner el objetivo de menor aumento, levanta el tubo y retira la preparación. 6-Teniendo en cuenta la escala de medidas que vimos anteriormente; En qué unidades se medirán estructuras pertenecientes a cada uno de los siguientes niveles? -Nivel macroscópico -Nivel microscópico -Nivel ultramicroscópico 7- Qué instrumentos le permiten observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores? 8- Cuál es el límite de resolución de: -ojo humano -microscopio óptico -microscopio electrónico 9 ) Con qué instrumento observaría? a) estructura interna del cloroplasto b) los diferentes estratos de la piel c) la forma de las neuronas d) la membrana plasmática en detalle e) eritrocitos Es posible observar presencia o ausencia de núcleo celular al microscopio óptico? 11.- En la tabla que se dibuja más abajo se detallan algunas características específicas de los tipos de microscopios estudiados. Analice cada una y coloque una cruz en el casillero apropiado al tipo/s de microscopio/s que corresponde CARACTERISTICA M. óptico M E de transmisión Tiene el mayor poder de resolución Pueden observarse células vivas ME de barrido

15 Permite visualizar detalles de la superficie celular Se pueden ver ribosomas aislados Pueden observarse células enteras Puede observarse la estructura interna de una célula procariota La observación mejora con el uso de colorantes Puede visualizarse una membrana plasmática cortada transversalmente Trabaja en alto vacío Su límite de resolución es de 0.25 micrones Su límite de resolución es de 100 A aproximadamente Su límite de resolución es de 10 A aproximadamente 12) En qué unidades se medirán estructuras tales como las siguientes (Expresa para cada una de ella su tamaño aproximado y luego ordénalas de mayor a menor dimensión) : a- hígado b- un paramecio c- un glóbulo rojo d- un glóbulo blanco e- una bacteria f- una mitocondria g- un cloroplasto h- una neurona i- el espesor de una membrana j- la molécula de ADN 13).- Qué instrumentos permitirían observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores? 14) En el siguiente cuadro, señale con qué instrumento óptico o electrónico podrá observar cada estructura TIPOS CELULARES O ESTRUCTURAS Microtúbulos Estructuras subcelulares Virus Micoplasmas, ricketsias Bacterias y algas cianofíceas Levaduras Protozoos y algas unicelulares Células vegetales en general Células animales en general Ovulo humano Ovulo de avestruz Acetabularia (alga ) DIAMETRO PROMEDIO 4 nm nm- m 10 nm m 0.1 m-1 m 0.5 m -5 m 5 m m m m 100 m 75 mm mm INSTRUMENTO ORGANELAS CITOPLASMATICAS.- NUCLEO

16 OBJETIVOS -Observar y reconocer al MO diferentes morfologías celulares y localización de diferentes organelas. -Esquematizar lo observado a través de la observación e interpretación de microfotografía electrónica -Conocer la ultraestructura de los componentes celulares BASES TEORICAS Las bases teóricas que figuran en las guías de TP tienen como función introducir a los alumnos en el conocimiento del tema a fin de lograr su mejor desempeño durante el mismo, no pudiendo suplir, al conocimiento que deberá lograr mediante la consulta bibliográfica de cada caso. En el TP Nº 1 se puso de manifiesto que dado que las células deben cumplir múltiples papeles en la enorme gama de seres vivos diferentes, existe también una gran diversidad celular. Hay, una gran variedad de tamaños y formas celulares y en cada caso la estructura final y la presencia o desarrollo de estructuras especiales es generalmente consecuencia del proceso de diferenciación que permite a las células cumplir con una función particular. El siguiente cuadro sinóptico presenta un resumen de las diversas estructuras que presentan las células animales y vegetales C Cubiertas celulares glucocálix cutículas pared celular(vegetales) Membrana plasmática E Sistema vacuolar citoplasmático Retículo endoplásmico Aparato de Golgi L Citoplasma Organelas citoplasmáticas Envoltura nuclear Lisosomas U Mitocondrias Ribosomas Plástidos (vegetal) Peroxisomas Citoesqueleto L Citosol A Nucleo envoltura nuclear carioplasma o matriz nuclear cromatina (cromosoma en división) nucléolo Toda célula durante su vida pasa por dos períodos,uno de división y otro de interfase o no división

17 Durante el período de interfase toda célula eucariota presenta tres componentes o compartimentos especiales. Ellos son: A.-Membrana Plasmática B.-Citoplasma C.-Núcleo Cada uno de estos componentes contiene a su vez diversas estructuras o subcomponentes,tal como se ven en el cuadro precedente. De todos ellos nos dedicaremos a: 1)Retículo endoplásmico rugoso 2)Aparato de Golgi 4)Plástidos Todas estas estructuras se consideran organelas, ya que para ello cumplen los siguientes requisitos: a)están presentes durante toda la vida de la célula o la mayor parte de ella b)presentan una morfología relativamene constante c)cumplen una función particular Fijación: Tratamiento químico o físico que mata rápidamente las células y conserva sus estructuras evitando la aparición de fenómenos de autólisis o desintegración. La observación por transmisión sólo proporciona datos si ciertas regiones del objeto absorben la luz más que otras,es decir, si este objeto presenta contrastes. En general, los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes unos con respecto a otros, por lo cual se deben emplear ciertos artificios para aumentarlos. Es posible amplificar las diferencias muy pequeñas que existen entre las diversas regiones de la célula, recurriendo a montajes ópticos que utilizan la naturaleza ondulatoria de la luz, es el caso del microscopio de contraste de fases y del microscopio de interferencia. Por otra parte, se pueden crear artificialmente contrastes a nivel de ciertas estructuras celulares, para lograrlo, se realizan combinaciones, entre sus constituyentes químicos y productos que absorben ciertas longitudes de onda de luz, llamados colorantes. Como las células vivas poseen un espesor medio de 10 µm sólo pueden estudiarse en microscopios lumínicos, células aisladas o reunidas formando una capa delgada. En la mayoría de los casos las condiciones de espesor se logran efectuando cortes de no más de 5 m, para evitar que la superposición de estructuras haga la imagen confusa. Para efectuar cortes con micrótomo es necesario endurecer la muestra (por congelación, inclusión en parafina, etc.) previa fijación. Tratamiento químico o físico que mata rápidamente las células y conserva sus estructuras evitando la aparición de fenómenos de autólisis o desintegración. La observación por transmisión sólo proporciona datos si ciertas regiones del objeto absorben la luz más que otras, es decir, si este objeto presenta contrastes.

18 En general, los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes unos con respecto a otros, por lo cual se deben emplear ciertos artificios para aumentarlos. Es posible amplificar las diferencias muy pequeñas que existen entre las diversas regiones de la célula, recurriendo a montajes ópticos que utilizan la naturaleza ondulatoria de la luz, es el caso del microscopio de contraste de fases y del microscopio de interferencia. Por otra parte, se pueden crear artificialmente contrastes a nivel de ciertas estructuras celulares, para lograrlo, se realizan combinaciones, entre sus constituyentes químicos y productos que absorben ciertas longitudes de onda de luz, llamados colorantes. TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica. Hematoxilina Se utiliza en histología para teñir los componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que da una coloración violeta. Tiñe intensamente los núcleos de las células, dado que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos. Eosina La eosina es un colorante basófilo (tiene afinidad por las sustancias alcalinas), de uso ampliamente extendido en el ámbito industrial, desde la industria textil hasta el estudio biológico e histológico. El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos Azul y Púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma. Resultados Núcleo celular: Azul Citoplasma: Rosa Musculatura: Rojo, rosa o fucsia Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado Fibrina: Rosa ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (PAS) La técnica de Schiff, es una reacción colorimétrica que se usa comúnmente en citoquímica. Utiliza PAS, ácido peryódico de Schiff, o leucofucsina. La reacción oxida los grupos funcionales diol en glucosa y otros azúcares, creando aldehídos que reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura-magenta. Es una tinción utilizada para detectar glucógeno y otros polisacáridos en los tejidos permite la tinción de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, células caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que están rodeados por hidratos de carbono, etc.

19 Tincion con Nitrato de plata (técnica de Ramón y Cajal). En esta tincion las proteinas son detectadas por la reduccion diferencial de los iones plata que se unen a las cademas laterales de aminoacidos. Donde hay muchas proteínas, t iñe de color marron. Tincion con azul de toluidina: Es un colorante Básico, es decir que reacciona con los grupos anionicos de los componentes del tejido a estudiar. Son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el ph. PARTE PRACTICA: OBSERVACION DE DIFERENTES TEJIDOS Y LOCALIZACION DE ORGANELAS. Célula vegetal Finalidad: *Realización de la preparación microscópica. *Observación de los componentes celulares típicos de una célula vegetal y las características del tejido elegido Materiales: *Cebolla. *Acido acético al 50% *Lugol, azul de metileno o hematoxilina. *Pinzas, tijera, escalpelo, portas y cubres, cuentagotas. Método: 1) Interesa como material, la epidermis interna de una escama de bulbo de cebolla. Para obtenerla, se corta una cebolla en dos mitades. Se separa manual-mente en cascos, sacando entre cada dos cascos una capa fina y translúcida, que es, precisamente, la epidermis interna, y se lleva a una cubeta de agua (o cápsula de Petri) para que se desenrolle. 2) Cortar dos trozos de esta epidermis. 3) Un trozo se coloca entre porta y cubre con una gota de agua, cuidando que quede bien extendido y sin burbujas de aire 4) El otro trozo se sumerge en ácido acético al 50% durante 1 ó 2 minutos (fijación); luego en el colorante elegido, durante 2 min y posteriormente se coloca entre porta y cubre para su observación. Observación: (Recordar que para observar preparados sin teñir, debe reducirse la entrada de luz, y en todos los casos, comenzar con aumentos débiles) Las células de la epidermis de la cebolla, poligonales y grandes, se hallan íntimamente adheridas unas con otras. La pared se destaca muy clara teñida por el colorante. En las células vivas se ven los núcleos aplanados (con 2 o más nucleolos) adosados a la pared. A medida que las células van degenerando, el núcleo se redondea y tiende a situarse en el centro.

20 El citoplasma tiene un aspecto bastante claro, en él se distinguen algunas vacuolas grandes, débilmente coloreadas. En algunas ocasiones se observa que la preparación tiene a manera de mosaico, otros estratos de células; estas proceden de las capas más internas de las hojas que facilmente han podido ser arrancadas al desprender la epidermis. Para la observación es más adecuado utilizar las zonas constituidas por un único estrato epidérmico. Es característica de las epidermis vegetales que sus células carezcan de cloroplastos, con excepción de las células estomáticas. 1) Dibujar un trozo de epidermis de cebolla a pocos aumentos. 2) Dibujar una célula a gran aumento, señalando pared celular, vacuolas y núcleo. Diagnóstico:... Coloración:... Aumento:... Plástidos Objetivo: Reconocer cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos en material vegetal fresco Características: Estas organelas exclusivas de la célula vegetal y algas eucariontes, pueden diferenciarse en plástidos incoloros o leucoplastos y plástidos coloreados cromoplastos y cloroplastos. A.-Los leucoplastos están rodeados por una doble membrana, no contienen pigmentos y se caracterizan por acumular sustancias de reserva. B.-Los cromoplastos también están limitados por una doble membrana y presentan pigmentos diferentes de la clorofila.su función es dar color a las flores y frutos,a fin de dotarlos de una coloración atractiva para los animales que intervienen en la polinización y dispersión defrutos y semillas. C.-Los cloroplastos, de importancia fundamental para la célula vegetal, ya que en

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