MANIPULACIÓN DE CÉLULAS Y TEJIDOS PARA TRANSPLANTE Vicente Mirabet. Banco de Órganos y Tejidos de la Comunidad Valenciana.

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1 MANIPULACIÓN DE CÉLULAS Y TEJIDOS PARA TRANSPLANTE Vicente Mirabet. Banco de Órganos y Tejidos de la Comunidad Valenciana. INTRODUCCIÓN Ya en las civilizaciones más antiguas, el hombre imaginó el concepto de injerto o trasplante de tejidos. Así, cuenta la mitología griega que el gigante Tifón seccionó los tendones de manos y pies a Zeus, en la titánica contienda mantenida por ambos. Después, los escondió bajo la piel de un oso en una caverna, aunque Hermes y Pan los encontraron, reimplantándolos de nuevo al Señor del Olimpo que, con la fuerza renovada, logró vencer al gigante, aplastándolo con el Etna. Con la llegada de la era cristiana, los mitos y las leyendas dieron paso a los milagros. El propio Jesucristo reimplantó la oreja del centurión que lo custodiaba, que había sido seccionada por la espada de San Pedro en Getsemaní. San Antonio de Padua y San Marcos colocaron de nuevo en su posición anatómica un pie y un brazo, respectivamente, arrancados como consecuencia de sendas mutilaciones. Aunque, sin lugar a dudas, la referencia más frecuentemente citada y representada corresponde al milagro de San Cosme y San Damián que, durante el reinado de Diocleciano ( ), se aparecieron al sacristán de la iglesia erigida en sus nombres y sustituyeron su pierna derecha enferma por la de un etíope sepultado aquel mismo día. Al despertar de su sueño, el sacristán había sanado. En un contexto más racional, mucho antes, en un documento fechado el año 800 a.c. en la India, se atribuye a un cirujano llamado Sushruta la realización de rinoplastias reconstructivas utilizando colgajos pediculados. Aunque fueron muchas las aportaciones de este autor tanto a la Medicina como a la Cirugía, esta cita en concreto representa uno de los primeros hitos relacionados con el campo del trasplante. Por otro lado, considerando que la amputación de la nariz era una de las penas impuestas a los reos de la época, no resulta extraño que ésta fuera una de las técnicas quirúrgicas desarrolladas por tan insigne cirujano. Más adelante, ya sobre la base del conocimiento hipocrático del hombre, se fueron añadiendo nuevos argumentos acerca del trasplante de tejidos. Así, en el siglo XVI, Tagliocozzi realizó autotrasplantes de piel para reconstrucciones faciales y, en 1822, Berger amplió el uso clínico del autotrasplante de piel. No obstante, no es hasta 1869 cuando se atribuye al cirujano suizo Reverdin el éxito del aloinjerto cutáneo humano. Paralelamente, Thiersch y Ollier describieron el injerto dermoepidérmico y, poco después, se añadió el de piel completa bajo el impulso de Hamilton, Whatson y Lefort, entre otros. En 1880, el escocés MacEwen efectuó el primer autotrasplante de hueso en humanos. Por otro lado, en 1908, Lexer aportó las primeras series de aloinjertos osteoarticulares. Otras referencias de interés en el campo del trasplante son: el de córnea, efectuado en 1906 por el oftalmólogo austriaco Zirn; el de segmentos vasculares, realizado por Yamanouchi en 1911; el de conductos valvulados cardíacos, desarrollado por Murray, Shaw, Wheelock, Barrett-Boyes y Ross a mediados del siglo XX; y el de precursores hematopoyéticos de médula ósea, realizado por Thomas en Paralelamente a los avances en el campo quirúrgico, se han ido introduciendo otros en disciplinas directamente relacionadas con el trasplante.

2 Así, podemos citar: la descripción de los grupos sanguíneos por Landsteiner en 1901; la identificación de las propiedades inmunosupresoras de la ciclosporina, por Borel en 1972; los trabajos de Dausset, Snell y Benacerraf en la década de los 50 sobre los antígenos de histocompatibilidad (HLA); y los estudios de Medawar, en esa misma década, sobre la tolerancia inmunológica de los tejidos trasplantados. Prueba evidente de la importancia de estos acontecimientos en la historia reciente es que un buen número de los autores citados han sido galardonados con el premio Nobel. El interés creciente por el trasplante de células y tejidos llevó a la necesidad de incrementar la disponibilidad de homoinjertos. Por otro lado, el imperativo ético de preservar la salud de los pacientes, exigió el establecimiento de pautas destinadas a garantizar la seguridad de los productos y los procedimientos aplicados sobre los mismos, incorporando normas para la gestión de la calidad. Estos argumentos resultaron definitivos para suscitar el interés por el desarrollo de medidas para el almacenamiento de los tejidos durante cierto tiempo, en condiciones que aseguraran la integridad de sus propiedades biológicas. La consecuencia directa fue la creación de bancos de tejidos. El frío es un mecanismo bien conocido como medio de conservación en la naturaleza. Es por eso que los investigadores en el campo del almacenamiento de productos de origen biológico, fijaron su atención en la observación de seres vivos presentes en los ecosistemas fríos. De este modo, diversas especies de ranas, peces, insectos y gusanos, proporcionaron evidencias acerca de las distintas estrategias evolutivas de adaptación al entorno congelado. En 1665, Boyle publicó New experiments and observations touching cold, en el que este prolífico investigador ya describía el efecto del frío sobre determinados seres vivos. En el último cuarto del siglo XIX, los estudios de Cailletet, Pictet, Omnes y Dewar aportaron metodologías para la licuación de gases, estableciendo un marco idóneo para la consecución de muy bajas temperaturas. Más recientemente, en 1949, de modo accidental, Polge descubrió el efecto crioprotector del glicerol. En 1963, Mazur comentó en una serie de experimentos los efectos de la congelación sobre las células proponiendo la «hipótesis de los dos factores». Este entorno propició el desarrollo de la Criobiología. Ésta es una ciencia multidisciplinar que engloba el estudio del comportamiento físico y biológico de los seres vivos, analizando las interacciones de las células y tejidos con el medio ambiente, a bajas temperaturas. El frío ha sido y es todavía en la actualidad el método más utilizado para la conservación de células y tejidos. Seguidamente, repasaremos algunos de los conceptos básicos relativos al trasplante de células y tejidos. BANCO DE TEJIDOS Según la definición que se recoge en el Real Decreto 1301/2006, que regula este tipo de actividades, se entiende por banco de tejidos o establecimiento de tejidos «aquella unidad donde se lleven a cabo actividades de procesamiento, preservación, almacenamiento o distribución de células y tejidos, después de su obtención y hasta su utilización clínica». Es responsabilidad del banco de tejidos asegurar la calidad de sus productos, proporcionando seguridad y eficacia clínica. En España, la actividad de los bancos de tejidos adquiere relevancia en el último cuarto del siglo XX. Especialmente reseñable, por su carácter pionero, es la creación de bancos de homoinjertos óseos en algunos servicios de Traumatología y Cirugía Ortopédica, para su autoabastecimiento. No en vano, la primera referencia acerca de la creación de bancos de tejidos en nuestro país data del año 1951, y corresponde a un banco de hueso en Madrid. Este tipo de bancos, para uso exclusivo del propio servicio que obtiene los tejidos y generalmente destinados a la conservación de un solo tipo de tejido, son los llamados «bancos quirúrgicos». Además del tejido músculo-esquelético ya

3 reseñado, los más habituales hacen referencia a la conservación de piel en Unidades de Quemados y la de córneas en servicios de Oftalmología. El proceso evolutivo del desarrollo de los bancos de tejidos llevó en un buen número de casos a la adopción de criterios de centralización, con el objetivo de rentabilizar los recursos disponibles y aportar un carácter multidisciplinar. En este afán por conseguir una mayor eficiencia, algunos bancos quirúrgicos «salieron» de los hospitales, unificando sus actividades, integrándose una buena parte de ellos en los centros regionales de transfusión sanguínea, creados a su vez como consecuencia de la entrada en vigor del Real Decreto 1945/1985, que desarrollaba el Plan Nacional de Hemoterapia. Esta medida aportó importantes ventajas derivadas de las disponibilidades de uso común, por ejemplo: sistemas de promoción y organización de la donación, experiencia en las pruebas de laboratorio, requisitos reglamentados, normativa legal y hábito de inspección técnica, protocolos de control de calidad, manuales técnicos, y sistemas de comunicación. De hecho, un banco de sangre es un banco de tejidos. En cualquier caso, ya sea desde centros de transfusión, centros hospitalarios o bien como instituciones sanitarias independientes, se aprecia una clara tendencia a la multidisciplinaridad en los servicios prestados por parte de estas unidades, dando lugar a los llamados «bancos regionales». En ellos, además de procesar diferentes tipos de tejidos, se atiende las necesidades de los servicios quirúrgicos de los diferentes centros de su entorno asistencial. La centralización, entendida como concentración de recursos técnicos y conocimiento experto, es una medida que aporta eficiencia para este tipo de actividades. Actualmente, hay diferentes tipos de células y tejidos que pueden ser almacenados: tejido músculo-esquelético (hueso, tendón y cartílago), piel, válvulas cardíacas, segmentos vasculares, glándula paratiroides, corteza ovárica, membrana amniótica, córnea, células precursoras hematopoyéticas (médula ósea, sangre periférica, cordón umbilical), concentrados de hematíes, etc. Paralelamente, el número de especialidades médico-quirúrgicas que se benefician de su disponibilidad ha ido creciendo: Traumatología y Cirugía Ortopédica, Hematología y Hemoterapia, Oftalmología, Cirugía Plástica y Quemados, Cirugía Maxilofacial, Dermatología, Cirugía Torácica, Cirugía General, Cirugía Vascular, Cirugía Cardíaca, Neurocirugía, Endocrinología, etc. El marco de actuación de los bancos de tejidos en España está regulado por el anteriormente citado Real Decreto 1301/2006, desarrollado como transposición del texto contenido en la Directiva 2004/23/ce del Parlamento Europeo y del Consejo relativa al establecimiento de normas de calidad y de seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos. Nuestro país ha sido el principal impulsor del desarrollo del marco regulador en el entorno continental. No en vano, la contrastada eficacia del denominado «modelo español» de trasplantes, ha permitido a nuestro país representar un papel preponderante en el concierto mundial, no sólo en el caso de los órganos sino también en los tejidos.

4 COORDINACIÓN DE ACTIVIDADES Cuando se habla de trasplante de tejidos, hay que tener presente que se trata de un concepto que engloba diferentes actividades. Siguiendo el orden temporal en el que se suceden las distintas acciones a considerar, en primer lugar se encuentra la coordinación hospitalaria de trasplantes. Ésta es, sin duda, la pieza clave en el éxito del anteriormente citado «modelo español» de trasplantes. El coordinador de trasplantes es el principal responsable de llevar a buen término el proceso de la donación. El perfil del coordinador de trasplantes responde a las siguientes características: Profesional del ámbito sanitario. Experto en la selección de donantes. Experto en el diagnóstico de la muerte encefálica. Experto en Patología Médica. Competente y atento durante el proceso de solicitud de la autorización familiar. Conocedor de los trámites administrativos y burocráticos relacionados. Con disponibilidad permanente. Una ajustada selección del donante aportará eficiencia en el desarrollo posterior de otros procedimientos, tanto desde el punto de vista de la bioseguridad como de la eficacia clínica. Con este fin, una vez conocida la historia médico-social del potencial donante y, después de contrastar los diferentes criterios de selección, se tomará la decisión sobre la continuidad del proceso. Se pueden obtener tejidos para trasplante tanto de pacientes vivos, como de personas fallecidas. El ejemplo más frecuente para el primer caso es el de aquellas personas que, como consecuencia de una cirugía de cadera en la que su cabeza femoral resultará como residuo quirúrgico, en lugar de destinarla a la «basura», acceden a donarla. También se puede citar como ejemplo de este tipo de donación, la obtención de tejidos de un paciente con la finalidad de un eventual uso clínico para ese mismo paciente. Llegados a este punto, conviene distinguir las distintas modalidades de trasplante en función de la relación donante receptor: Autólogo: cuando tiene su origen en otro sitio del cuerpo que lo recibe. Alogénico: el que se realiza entre individuos de la misma especie, pero de distinto genotipo. También citado como homoinjerto. Singénico: el que se realiza entre individuos de la misma especie y con el mismo genotipo. Xenogénico: Si donante y receptor son de especies diferentes. Por otro lado, hay otros tejidos que se obtienen de personas fallecidas. En estos casos, para que la donación pueda hacerse efectiva, hay que asegurarse de que el difunto no hubiera expresado en vida su oposición a la donación y, además, contar con la autorización familiar. Seguidamente, se muestra una tabla con algunos de los tejidos más relevantes y el tipo de donante del que se pueden obtener. Donante Vivo Donante Fallecido Tendones Ligamentos Calota Craneal* Huesos Completos Corteza Ovárica* Piel Glándula Paratiroides* Vasos Sanguíneos Membrana Amniótica Córneas Cartílago Fascia Lata Hueso Esponjoso Válvulas Cardíacas *Autotrasplante

5 La responsabilidad del proceso de extracción recae en profesionales expertos en las diferentes especialidades quirúrgicas relacionadas con los tejidos. El equipo quirúrgico debe asegurar la idoneidad de los procedimientos empleados, especialmente en lo que a los procesos de disección y toma de muestras para control de calidad se refiere. Además, en el caso de donantes fallecidos, se tomarán las medidas oportunas para paliar la ausencia de los tejidos extraídos. A continuación, es el banco de tejidos el que se va a encargar de asegurar las condiciones adecuadas de conservación, para garantizar que los tejidos no pierden las propiedades biológicas que los hacen clínicamente útiles. La duración del período de almacenamiento viene condicionada principalmente por el tiempo necesario para conocer la totalidad de los resultados que comprenden el control de calidad (marcadores víricos, cultivos microbiológicos, estudios histológicos, etc.). Además, para atender aquellos casos en los que el tejido debe ajustarse a las características físicas del paciente receptor, conviene disponer de piezas con diferentes dimensiones (diámetro, longitud, etc.), lo que implica la necesidad de acumular un stock suficiente. El fin último de todas las acciones que hasta este momento se han citado no es otro que el del trasplante. Para ello, bien desde la coordinación de trasplantes del hospital o bien desde el propio servicio quirúrgico que demanda los servicios del banco, se establece el contacto oportuno para concertar todos aquellos detalles relativos a la intervención y garantizar la idoneidad de las piezas disponibles. Como se observa, todos los actores implicados participan en el proceso de un modo interrelacional. La información fluye en direcciones diferentes y en ambos sentidos entre todos ellos. Considerando que el banco de tejidos termina por ser el nexo de la relación donante-receptor, no es infrecuente que el banco de tejidos actúe como centro de referencia para el sistema de información necesario para la gestión de datos relativos a las actividades de donación conservación trasplante. ALMACENAMIENTO Dos son las «cadenas» que hay que mantener durante los procedimientos de manipulación de células y tejidos: la de la asepsia, para minimizar el riesgo de contaminación; y la de la temperatura, asegurando las condiciones más adecuadas en cada paso del procesamiento. En lo que respecta a la asepsia, el uso de cabinas de flujo laminar facilita un medio ambiente libre de partículas. Dependiendo de la dirección del flujo de aire, se puede distinguir: horizontal (imagen superior) y vertical (imagen inferior). El primer tipo resulta más adecuado para la manipulación de piezas de cierto tamaño (por ejemplo, un fémur), ya que permiten una mayor libertad de movimientos. Las de flujo vertical incorporan una pantalla en el frontal que, si bien aporta una mayor seguridad a la hora de procesar muestras fuera del envase, también permiten menos movilidad. Hay una serie normas generales a seguir para la correcta utilización de este tipo de dispositivos: Evitar las corrientes de aire: puertas, ventanas, ventilación, hablar, estornudar, toser, movimientos bruscos, etc. No tocarse la cara. Lavarse las manos las veces que sea necesario. Si se usan guantes, al sacarlos de la zona de trabajo estéril, desecharlos. La cabina se limpiará cuidadosamente y se conectará al menos 10 minutos antes de iniciar el trabajo. El material a utilizar en su interior debe estar libre de partículas. Si es necesario, se limpiará su superficie con una gasa estéril impregnada en alcohol al 70%. Evitar la utilización de: papel, madera, cartón, lápices, gomas de borrar y aquellos materiales que emitan gran cantidad de partículas. Al introducir un nuevo material en la cabina, esperar un mínimo de

6 unos 3 minutos antes de continuar trabajando. Si se utiliza un mechero, evitar los de llama continua, ya que el calor generado puede provocar turbulencias y una llama excesiva puede quemar el filtro de la cabina o dañar sus superficies. Tener presente que, cuando el flujo de aire encuentra un obstáculo, no recupera su laminaridad hasta una distancia 2.5 veces el diámetro de dicho objeto. En la actualidad, la normativa exige también que las cabinas de flujo se sitúen en un medio ambiente controlado. Con este fin, se han creado las «salas limpias». El trabajo en estos recintos exige ampliar las medidas de seguridad comentadas en el caso de las cabinas de flujo, por ejemplo, en lo que respecta a la indumentaria del operador. En el cuadro siguiente se resumen las características de los diferentes grados de ambiente, en función del número máximo de partículas permitido por m 3, de acuerdo con su tamaño: Grado En Reposo En Funcionamiento 0,5 µm 5 µm 0,5 µm 5 µm A B C D No definido No definido A la hora de establecer un método para el almacenamiento de células y tejidos, como ya se ha comentado anteriormente, la utilización de bajas temperaturas sigue siendo en la actualidad uno de los más utilizados. En el cuadro siguiente, se resumen las características más relevantes de los diferentes sistemas utilizados. Refrigeración Entre 1ºC y 10ºC Congelación Simple Entre -30ºC y -80ºC Criopreservación Entre -140ºC y -196ºC Liofilización Temperatura Ambiente Cultivo 37ºC Temperatura Ventajas Incovenientes Viabilidad Celular Características Estructurales Inmunogenicidad Propiedades Biomecánicas Caducidad Corta Sustancias Bioactivas Procesamiento sencillo Características estructurales Propiedades Biomecánicas Sustancias Bioactivas Caducidad media Viabilidad Celular Características Estructurales Propiedades Biomecánicas Sustancias Bioactivas Caducidad Larga Almacenamiento Sencillo Caducidad Media Viabilidad Celular Expansión Celular Ingeniería Tisular Control Exhaustivo Células No Viables Inmunogenicidad Procesamiento Complejo Inmunogenicidad Células No Viables Procesamiento Complejo Alteración Propiedades Biomecánicas Procesamiento Complejo Inmunogenicidad Con la refrigeración de los tejidos refrigerados, podemos asegurar una aceptable viabilidad celular, así como el mantenimiento de las características estructurales, sus propiedades biomecánicas e incluso la presencia de las sustancias bioactivas (factores de crecimiento, citocinas, etc.) propias del tejido. No obstante, es necesario contar con un medio de cultivo adecuado que garantice la viabilidad y funcionalidad celular. Lógicamente, la viabilidad celular puede tener como consecuencia un mayor riesgo de respuesta inmunológica, cuando se utiliza el tejido como aloinjerto. Por otro lado, actualmente sólo se ha conseguido mantener los tejidos en estas condiciones durante unas pocas semanas, sin menoscabo de su eficacia clínica. La congelación simple hace referencia a la introducción directa de los tejidos en un congelador. Puede embeberse la pieza en una solución fisiológica o bien prescindir de ella. Es necesario disponer de recipientes que mantengan la integridad a temperaturas bajas y, lógicamente, de aparatos congeladores. Hay que tener presente que si bien no se alteran

7 significativamente las características estructurales de la pieza, la viabilidad celular sí se ve seriamente comprometida. No obstante, esta aparente desventaja facilita que el homoinjerto sea mejor tolerado desde el punto de vista inmunológico. Dependiendo de la temperatura de almacenamiento, la caducidad puede ir desde los 6 meses (-30ºC) hasta unos 5 años (-80ºC). Con la criopreservación, además asegurar cierto grado de viabilidad celular, también se consigue un largo período de caducidad, ya que se emplean temperaturas muy bajas para el almacenamiento. Esto se consigue con el uso de nitrógeno, proporcionando una temperatura de -196ºC en la fase líquida y entre -140ºC y -170ºC en la fase vapor. Los productos a almacenar tienen que ser envasados en recipientes adecuados para resistir estas temperaturas. Las bolsas de kapton-teflon se encuentran entre las más utilizadas para este fin. A la hora de diseñar un protocolo con este fin, hay que establecer medidas para contrarrestar los potenciales efectos nocivos del proceso. Básicamente, estas medidas tienen su fundamento en la «hipótesis de los dos factores» descrita por Mazur, que se citó al comienzo del texto. Por una lado, se utilizan soluciones criprotectoras. Éstas están compuestas generalmente por un medio isotónico con sustancias nutritivas al que se añade una sustancia con propiedades protectoras para la integridad celular. Las más utilizadas son el dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol. Además, para proporcionar una cinética de enfriamiento óptima para el tipo celular que se desea preservar, se emplean aparatos para el descenso térmico programado, como el que se ve en la figura de la izquierda. Una velocidad de congelación demasiado lenta tiene como consecuencia una deshidratación celular que puede llegar al límite de volumen crítico de reversibilidad para este efecto. Esta deshidratación tiene su origen en un proceso osmótico generado al congelarse el entorno extracelular, con lo que algunos solutos se añaden a la fracción que todavía se mantiene en estado líquido, incrementando así la concentración de ésta, que resulta superior a la del interior celular, con lo cual el agua sale de la célula por ósmosis. Cuando, por el contrario, la velocidad de enfriamiento es excesiva, el factor de riesgo se debe a la presencia de cristales de hielo que pueden destruir la célula. Los crioprotectores antes citados ejercen su efecto principalmente mediante las siguientes acciones: Desciende el punto de congelación. Regulan la cinética de deshidratación. Estabilizan la membrana plasmática. Reducen la lesión mecánica. Aseguran las fuerzas hidrofílicas. Si importante es asegurar un proceso de congelación adecuado, no menos lo es proporcionar unas condiciones estables durante el tiempo de almacenamiento y, además, descongelar los tejidos siguiendo las pautas indicadas por el banco. Una deficiente descongelación puede, por ejemplo, favorecer la aparición de fenómenos de recristalización que tendrán como consecuencia efectos tanto a nivel de la integridad tisular como la viabilidad y funcionalidad celulares. Por todo ello, la criopreservación es un procedimiento complejo que requiere, por un lado, una inversión importante para dotarse de los dispositivos necesarios y, por otro, personal entrenado en la utilización de esta tecnología y con experiencia en las actividades relativas a la donación y trasplante de tejidos. La liofilización es un proceso que consiste en el paso del estado sólido al gaseoso sin pasar por el líquido. Así pues, el producto se somete a un proceso de congelación y, posteriormente, se induce la evaporación de la parte líquida que se ha congelado. Se

8 consigue por tanto una deshidratación. Éste es un procedimiento que se utiliza principalmente para el almacenamiento de tejido óseo. Se conserva la matriz estructural, pero se pierde la viabilidad. La principal ventaja es que el producto obtenido puede ser almacenado a temperatura ambiente. No obstante, hay que dotar al laboratorio de un dispositivo liofilizador adaptado a las necesidades del banco y, dependiendo de las condiciones ambientales durante la manipulación del tejido, puede ser necesario someter el producto final a un proceso de esterilización secundaria (generalmente, se utiliza la radiación gamma). Además, las propiedades biomecánicas de los tejidos se ven alteradas, por lo que este método de preservación es útil para tejidos de relleno o de sostén (como el hueso esponjoso, por ejemplo) pero no cuando se trata de elementos que van a estar sometidos a esfuerzos mecánicos (como los huesos largos, por ejemplo). El cultivo celular, por su parte, consiste en el crecimiento de las células fuera del organismo, utilizando soluciones nutritivas específicas y unas condiciones ambientales controladas. De este modo, a partir de una pequeña biopsia de tejido, se puede obtener gran cantidad de células. Ya en 1880, Roux fue capaz de cultivar tejidos de embrión de pollo durante algunos días, utilizando una solución salina. En 1907, Harrison demostró que el crecimiento in vitro de tejidos animales era posible. Un lustro después, las experiencias de Burrows y Carrel cultivando explantes de tejidos de animales adultos, proporcionaron una base científica par el desarrollo de líneas celulares. No fue hasta 1952 cuando Gey estableció la primera línea celular de origen humano (denominada HeLa, ya que procedía de una paciente llamada Henrietta Lacks). Pocos años después se formularon soluciones nutritivas para el cultivo celular que todavía hoy permanecen vigentes, como por ejemplo las propuestas por Eagle y Dulbecco. Hoy en día se han diseñado procedimientos para el cultivo y expansión de la mayor parte de las células que se encuentran en los tejidos humanos. A la hora de afrontar la realización de un cultivo, el primer paso consiste en obtener un fragmento de tejido que contenga la estirpe celular que va a ser objeto de interés. Aunque pueda parecer obvio, es conveniente asegurarse bien de este extremo, ya que una elección incorrecta puede condicionar el resultado de nuestro trabajo. Seguidamente, hay que decidir la modalidad de cultivo, que va estar condicionada por las características propias de las células y las disponibilidades del laboratorio. En general, podemos distinguir tres tipos de cultivo: Explante: consiste en la colocación de pequeños fragmentos de tejido sobre la superficie de cultivo, de modo que se permite a las células «pasar» al recipiente, adherirse y comenzar el crecimiento. Esta metodología requiere una mínima manipulación del tejido por parte del operador. Suspensión: como su propio nombre indica, en este caso las células se mantienen sumergidas en un medio líquido pero no hay adhesión a la superficie del recipiente que las contiene. Requiere una digestión previa del tejido para deshacer la matriz y aislar las células (salvo que las células se encuentren ya suspendidas, como sucede en la sangre, por ejemplo). Combinando los dos métodos anteriores, podemos realizar cultivos a partir de una suspensión celular, pero con adhesión al recipiente de cultivo. De este modo conseguiremos mayor eficiencia, ya que ofreceremos la oportunidad de crecer a mayor número de elementos formes que con el explante. No obstante, las células deben tener la capacidad para adherirse al sustrato.

9 Esta propiedad de adherirse a determinados soportes puede servir para seleccionar de un modo sencillo estirpes celulares específicas, retirando con el sobrenadante las células no adherentes. Otra opción con carácter selectivo es la centrifugación, pudiendo «ordenar» las células en estratos en función de su diferente densidad. Algo más laboriosa resulta la selección mediante el uso de anticuerpos específicos que incorporan esferas microscópicas con propiedades paramagnéticas (pudiendo ser atrapadas con un imán). Quizá el mayor grado de complejidad en lo que a métodos selección celular se refiere podemos encontrarlo en el empleo de citómetros de flujo que nos van a permitir, bien con la ayuda de marcadores específicos (basados en procesos inmunológicos) o bien en función de características morfológicas de la propia célula (como el tamaño, por ejemplo), refinar significativamente la fase de aislamiento de una determinada estirpe celular (aun cuando ésta se encuentre en desventaja proporcional frente a otras). A la hora de decidir el medio nutritivo a utilizar, no resulta difícil consultar referencias acerca de la composición más adecuada para las células que van a ser objeto de cultivo. Diferentes empresas cuentan con catálogos que contienen esta información, con datos detallados de la formulación en cada caso. Estas soluciones nutritivas basales se suplementan con diferentes productos. En la mayor parte de los casos se incorpora suero, en una proporción entre el 10% y el 20%, que si bien inicialmente solía ser de origen bovino, cada vez con más frecuencia se está empleando el humano. Lógicamente, la importancia de utilizar productos homólogos reviste especial trascendencia cuando pensamos en la posibilidad del trasplante. Por otro lado se pueden añadir también citocinas para estimular el crecimiento celular: factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteína morfogenética ósea (BMP), etc. En la actualidad hay una gran cantidad de factores disponibles para este fin. En este momento, una vez aisladas las células y preparado el medio de cultivo, podemos iniciar el «cultivo primario». Éste es, sin duda, un paso de especial trascendencia, ya que después de extraer las células de su entorno natural, las colocamos en uno creado artificialmente. Si el diseño de nuestra metodología es correcto, en 1 ó 2 semanas conseguiremos una «monocapa» sobre la superficie del recipiente y procederemos al «cultivo secundario». Este subcultivo puede realizarse con una densidad notablemente inferior a la del primario, ya que las células están adaptadas a las condiciones in vitro. De este modo, se puede alcanzar un notable grado de expansión de la población celular inicial. Un número elevado de células facilitará la consecución de resultados satisfactorios a la hora del trasplante. También disponiendo de una gran cantidad de células podremos afrontar el siguiente reto, la realización de «cultivos histotípicos». Esto es lo que se ha que se denomina ingeniería tisular, que consiste en la utilización de matrices tridimensionales en interacción directa con las células para obtener en el laboratorio análogos titulares, que en algunos casos reproducen fielmente las características de los tejidos in vivo. Como soportes para este fin se emplean diferentes tipos de materiales, algunos se pueden obtener del propio individuo (fibrina, por ejemplo), mientras que otros proceden de fuentes alternativas (ácido algínico, de algas pardas, por ejemplo). En cualquier caso, deben ser sustancias bicompatibles y bien toleradas desde el punto de vista inmunológico. Si a todos estos avances añadimos la posibilidad de emplear células con capacidad para generar diferentes tipos de tejidos, las «células madre», podemos hacernos una idea del gran potencial que esta tecnología supone para el futuro en el campo del trasplante. Actualmente, ha sido posible aislar células madre a partir de diferentes tejidos: médula ósea, cordón umbilical, sangre periférica, grasa,

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