Od. Irene Mérida odontólogo general U.C.V Para efectos de referencia bibliográfica este trabajo debe ser citado de la siguiente manera:

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1 P á g i n a 1 BIOINGENIERÍA Y SU APLICACIÓN EN LA ORTODONCIA Od. Irene Mérida odontólogo general U.C.V Para efectos de referencia bibliográfica este trabajo debe ser citado de la siguiente manera: Mérida I. "BIOINGENIERÍA Y SU APLICACIÓN EN LA ORTODONCIA". Revista Latinoamericana de Ortodoncia y Odontopediatria "Ortodoncia.ws edición electrónica Abril Obtenible en: Consultada, / / RECONOCIMIENTO: Agradezco al Dr. Oscar Quirós por el apoyo brindado para la realización de este trabajo. RESUMEN La odontología clínica está incursionando en una nueva era en donde el enfoque terapéutico es el uso de terapia génica, terapia celular, ingeniería tisular y la medicina regenerativa ampliando el arsenal de posibilidades para nuestros pacientes. Una línea de investigación fundamental en ingeniería tisular y medicina regenerativa son las células madres. Como parte de los nuevos avances de la odontología a nivel mundial, científicos e investigadores del mundo aplican la bioingeniería para lograr reconstrucciones maxilofacial, regeneraciones óseas, hasta reconstrucciones de nuestras piezas dentales, con nuestras propias células madre como parte de tratamientos innovador. El objeto del presente artículo es hacer una revisión de varios estudios realizados sobre la bioingenieria y su aplicación en la ortodoncia. PALABRAS CLAVE: bioingenieria, células madres, ortodoncia ABSTRACT The dental clinic is moving into a new era in which the focus is the therapeutic use of gene therapy, cell therapy, tissue engineering and regenerative medicine by expanding the array of possibilities for our patients. One of the fundamental research areas is in tissue engineering and regenerative medicine is stem cells. As part of new developments in dentistry worldwide, scientists and researchers all around the world apply bioengineering to achieve maxillofacial reconstructions, bone regeneration and reconstructions of our teeth among others, with our own stem cells as part of innovative treatments. The purpose of this article is to review several studies on the use of stem cells and their application in orthodontics. KEY WORDS: bioengineering,stems cells, orthodontics. INTRODUCCION La demanda de tratamiento médico y odontológico ocasionado por la pérdida de tejidos, o por el daño de órganos en el macizo craneofacial secundarios a trauma, defectos congénitos y enfermedades adquiridas representan un grave problema de salud para la población.aunque en términos generales los tejidos humanos tienen potenciales limitados de regeneración, los recientes hallazgos encontrados en la investigación con células madre e ingeniería de tejidos, proveen nuevas técnicas para ser aplicados en los

2 P á g i n a 2 tejidos dentales y cráneofaciales. MARCO TEÓRICO Definición de células madres son células clonogénicas,con un amplio potencial de autorrenovación (definida como la capacidad de generar al menos una célula hija con características similares a la célula de origen manteniéndose al mismo tiempo en un estado indiferenciado)así como la elevada capacidad de proliferación (posibilidad de la célula para dividirse sin cambiar su fenotipo celular indiferenciado y su potencial de diferenciación (potencial para modificar el fenotipo de la célula de origen en distintos tipos celulares diferentes al tejido embrionario original en varias líneas celulares como medula ósea,sangre periférica, cerebro, piel, pulpa dental y ligamento periodontal entre otros.(1,2,3) Estas células se pueden clasificar según su origen en embrionarias o de tejido adulto, y por su potencialidad de diferenciación en células totipotenciales capaces de producir un individuo completo, pluripotenciales que tienen la potencialidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias,y por último, las células multipotentes, que son capaces de diferenciarse en diferentes tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria.(4) Células madres embrionarias Un huevo fertilizado representa una célula madre fundamental porque este es totipotencial y en el puede desarrollarse un organismo completo, en el desarrollo temprano, el huevo totipotencial fertilizado experimenta una serie de rápidas divisiones celulares antes de que la célula comience a especializarse. en el estado de desarrollo del blastocito,un compartimiento llamado masa celular interna,comienza a tomar forma, las células dentro de la masa celular interna han sido llamadas celulas stem embrionarias.(5) Células madres adultas Son células indiferenciadas que se encuentran entre células diferenciadas de tejidos específicos y órganos, estas células madres pueden renovarse a ellas mismas y diferenciarse a producir el mayor tipo de células especializadas de los tejidos u órganos. Son en su mayoría células multipotenciales. Su rol principal es mantener y reparar tejidos donde se encuentran.(6) Células madres mesenquimatosas Son células capaces de diferenciarse siguiendo líneas específicas de diferenciación pudiendo ser epiteliales, musculares y nerviosas. el proceso de génesis de los tejidos mesenquimatosos es conocido como el proceso mesengénico el cual se presenta en gran actividad en el proceso de crecimiento y formación de los diferentes órganos hasta que estos llegan a su maduración completa. Se pueden diferenciar en tejido conectivo, células musculares, adiposas dado el hecho de que se disponen de poblaciones de células madres que debido a su capacidad de autoregeneración, generan el hueso, medula ósea, cemento, dentina, ligamento periodontal y pulpa dental es posible preveer la restauración completa de tejidos duros en la cavidad oral usando las propias células madres de cada paciente para de esa forma evitar complicaciones de histocompatibilidad y/o rechazo inmunológico.(5) Actualmente las fuentes de células madres son: carcinoma embrionario, medula ósea, sangre periférica, blastómeros, masa celular interna, cresta germinal interna, pulpa dentaria, ligamento periodontal, sangre del cordón umbilical, piel,retina y tejido adiposo.(7) Ventajas de las células madres embrionarias Son flexibles Son fácilmente adquiribles.(6)

3 P á g i n a 3 Desventajas Es difícil controlar su crecimiento Es éticamente controversial el uso de embriones humanos Es rechazado por el sistema inmunológico del cuerpo humano.(6) Ventajas de las células madres adultas Son inmunes al ataque del sistema inmunológico Son en parte especializadas Son de naturaleza flexible por lo tanto pueden formar otros tipos de tejidos.(6) Desventajas Son muy raros por naturaleza porque no han sido hallados todos los tipos aun Son muy extrañas Se desvanecen por naturaleza ya que no viven lo suficiente.(6) Caracterización de células madres en el complejo pulpodentinal Una posible fuente de células madres mesenquimatosas (MSCs) se encuentra en la pulpa dental, este es un tejido conectivo de baja vascularidad rodeado por dentina, conformado por una población heterogénea de células como: periodontoblastos, fibroblastos, células estromales, células endoteliales y perivasculares, células nerviosas, entre otras; estas células mantienen la homeótasis de los diferentes tejidos dentinales mineralizados. La mayoría de las células pulpares son postmitóticas; sin embargo, algunas de estas células aún se dividen y forman capas de nuevas células pulpares con habilidad de diferenciación a odontoblastos y formación de dentina. (8) Estas células, junto con los vasos sanguíneos se encuentran en matrices extracelulares creando un microambiente ideal para permitir procesos de reparación. Diferentes estudios, han buscado definir el fenotipo de células madres mesenquimales de pulpa dental (DP-MSC), el crecimiento in vitro en comparación con MSCs de médula, y su plasticidad in vitro por lo menos en tres tipos de células: osteoblastos, condroblastos y adipositos (18 Gronthos y col; caracterizaron estas células por medio de marcadores específicos de MSCs y observaron su capacidad de autoregeneración, diferenciación a múltiples linajes y su capacidad clonogénica; hallando DPSCs capaces de formar dentina asociada con tejido pulpar in vivo(19). Loara y colaboradores, por medio de la expresión de mrna de Dentina sialofosfoproteína (Dspp) y metaloproteínasas de la matriz 20 (MM20) confirmaron la diferenciación de DPSCs en odontoblastos al ser estimuladas por proteínas morfogenéticas óseas. (9) Otros estudios como los publicados por Shi y col. Muestran la expresión de marcadores de MSCs como STRO-1 y CD46 en ligamento periodontal además de una diferenciación de este tejido en odontoblastos, cementoblastos, adipositos y células productoras de colágeno in vitro; al ser transplantadas en ratones inmunosuprimidos muestran la formación de estructuras dentales que pueden contribuir a una eventual reparación.(10) En el Instituto Unidad de Investigación Básica Oral (U.I.B.O) de la Universidad El Bosque estamos realizando un proyecto de investigación con el propósito de determinar la presencia de células madres en muestras de pulpa dental humana. La caracterización de estás células la realizamos identificando la expresión de los marcadores CD 117, FGFR3, CD 90, STRO-1, CD34, CD44 y CD45 mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo. Los resultados previos obtenidos revelan un inmunomarcaje del 13.2 % de células CD117 +, mientras un porcentaje del 17.5 % de células FGFR3+ (61). Estos resultados demuestran la presencia de células precursoras en la pulpa dental, probablemente de la línea hematopoyética o mesenquimatosa. Se requieren estudios de caracterización adicionales de las células que expresan el fenotipo FGFR 3+ / CD 117+ con otros marcadores específicos de células Madres como STRO-1, CD-90, SH2, SH3, flujo, técnicas de biología molecular como RT-PCR para analizar el nivel de expresión de ARNm de genes propios de células madres mesenquimales (hmsc's) o células

4 P á g i n a 4 madres Hematopoyéticas(hHSC's).(10) Estos trabajos de investigación son el pilar fundamental para desarrollar nuevos tratamientos en el futuro basados en células madres. En efecto, existen varios ensayos clínicos con terapia celular basados en células madres que en este momento se efectúan en sujetos humanos. Estas estrategias terapéuticas novedosas tendrán aplicación en la práctica clínica odontológica.(10) Donde se pueden encontrar las células madres Los tejidos adultos como la médula ósea, la pulpa dental, el ligamento periodontal, el tejido adiposo, el cerebro, el corazón y los músculos, contienen células madre. Sin embargo el contenido de células madre varía de un tejido a otro. Las embrionarias (S humanas pueden ser aisladas a partir de fetos en estadios tempranos (etapa de blastocito, fase celular interna) y se pueden diferenciar in Vitro, en varios tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas, miocitos cardíacos y esqueléticos, y adipocitos.(11) Actualmente las fuentes más usadas para extraer células madre de tejidos adultos son las células madre mesenquimales (MSC) humanas, que están presentes en el estroma de la médula ósea, constituyendo una población totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas, y su papel es contribuir a la regeneración de los tejidos mesenquimáticos (hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón, tejido adiposo y estroma). Se ha podido aislar, cultivar y diferenciar MSC humanas, con rasgos típicos de osteocitos, condrocitos o adipocitos, respectivamente.(11) Los trabajos de Verfaille y Prosper demuestran que es posible la obtención de células madres adultas,mesenquimales de medula ósea y Zuk pa y cols 2001,los obtienen de tejido adiposo. Parece ser que estas células adultas insertadas en un medio favorable, son capaces de sufrir un proceso denominadote transdiferenciacion, siendo entonces capaces de generar células de tejidos de hojas embrionarias diferentes a su origen, esto es que vuelven a ser multipotenciales. Estas células madres adultas no presentan ninguno de los problemas tanto éticos como inmunológicos que hacían tan difícil la utilización de las embrionarias, por obtenerse del propio paciente.(11) el Dr. Del Olmo ha aplicado esta técnica a problemas clínicos concretos con gran éxito en el año 2003, Rel Ogawa y cols 2006 han utilizado células madres obtenidas por técnica de liposucción del tejido en la regeneración del tejido óseo y en su vascularización, Martínez-Estrada o y cols 2005 describen la existencia en las células de tejido adiposo de una población de células madres estromales muy primitivas capaces de producir endoteliales y en consecuencia de participar en el proceso de vascularización.(11) Como obtener células madres Obtención de la pulpa Posterior a la extracción del órgano dentario, se procedió a obtener pulpas dentales. el órgano dentario se fracturo por medio de la utilización de una pieza de alta velocidad para garantizar no dañar el tejido pulpar.la muestra pulpar se extrajo de la cavidad y se colocaron en medio DMEM frio estéril.(2) Aislamiento de células madres Para llevar el aislamiento de células madres, las pulpas dentales se colocaron en una solución de 3mg/ml de colagenasa tipo 1 y 4 mg/ml de dipasa durante 10 minutos. Pasado el tiempo de digestión se lavaron con medio DMEM con suero fetal bovino al 10% por 3 minutos.(2) Los extractos digeridos de las pulpas dentales se dejaron crecer en cajas de cultivo de 6 pozos en presencia del medio de cultivo modificado. eagle s suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) una solución de antibióticos (penicilina 100 ul/ml) estreptomicina (100 ul/ml) y fungisona (0,3 N g/ml),100 Mm de aminoácidos no esenciales y 100 Mm de piruvato de sodio, hasta obtener colonias clonogénicas, aproximadamente de 2 a 5 semanas de cultivo. el medio de cultivo antes mencionado se cambió cada tercer día para garantizar el crecimiento celular.(2)

5 P á g i n a 5 Obtención de la cresta iliaca La obtención del aspirado medular se realizó mediante punción en cresta iliaca bajo sedación y anestesia local, el lipoaspirado se obtuvo en las mismas condiciones de zona periumbilical mediante aspiración manual con canula hueca. aplicando técnica húmeda, el abordaje quirúrgico para el implante de células madres pluripotenciales fue incisión crestal y descargas verticales.(9) Como era de esperar cuando las células adquieren apariencia fibroblastoide en cultivo expresan marcadores (CDS) específicos de mesenquimales (CD90,CD44,CD105,etc) y son negativas para algunos marcadores hematopoyeticos que si se expresan al inicio.(9) Obtención de tejido adiposo La obtención de células madres mesenquimales de tejido adiposo se realizó mediante lavados y tratamiento enzimático de lipoaspirado y posterior puesta en cultivo de las mismas según técnica original descrita por Zuk pa y cols. a estas células se le ha llamadopla (procesed lipoaspirate adipose cells) o también ADAS (adipose derived adult ítems cells).(9) Célula madre pluripotente inducida (ips) Las células ips son células adultas reprogramadas a comportarse como células madre embrionarias. Si bien las células IPS son un descubrimiento emocionante, estas células nunca podrían ser utilizadas en los pacientes porque el uso de virus para reprogramar las células adultas predispone las células a cáncer. Como resultado, estas células no pueden reemplazar el uso de células madre embrionarias. Hay un acuerdo generalizado entre los investigadores principales de células madre, incluidos los científicos que desarrollaron células IPS, que la investigación debe continuar en todos los tipos de células madre incluidas las derivadas de embriones.(12) En el trabajo dirigido por Shinya Yamanaka de la Universidad de Kioto en Japón y publicado en la revista 'Cell' los investigadores han producido células similares pero no idénticas a las células madre embrionarias a las que denominan células madre pluripotentes inducidas (ips, según sus siglas en inglés). Estas células son consideradas "pluripotentes" por su capacidad para diferenciarse en la mayoría de los tipos de células. Los científicos han utilizado cuatro componentes químicos que ya emplearon el año pasado para conseguir ips a partir de células de ratón adulto.(13) Las células tienen muchas de las características físicas, de crecimiento y genéticas típicas de las células madre embrionarias y pueden diferenciarse para producir otros tipos de tejido, incluyendo las neuronas y el tejido cardiaco.(13) Los investigadores han utilizado los factores de transcripción oct3/4, Sox2, c-myc y Klf4, que controlan la actividad de otros genes y participan en el desarrollo embrionario y la identidad de las células madre embrionarias, para generar células ips de fibroblastos tomados de la piel humana.(13) Las células ips eran indistinguibles de las células madre embrionarias en su apariencia y conducta en cultivos celulares, además expresaban los mismos marcadores genéticos que utilizan los investigadores para diferenciarlas, así como patrones similares de actividad genética.(13) Las ips se diferenciaban para formar tres capas germinales en el cultivo celular. Esas primeras capas germinales en los embriones suelen dar lugar a todos los tejidos y órganos del cuerpo. Además, las células ips podían dar lugar a neuronas mediante un método utilizado ya en las células madre embrionarias humanas, así como a células de músculo cardiaco. Después de 12 días de diferenciación, los cúmulos de células de las placas de laboratorio comenzaron a palpitar.(13) Las células madre embrionarias, derivadas de la masa celular interna de blastocitos de mamíferos, bolas de células que se desarrollan después de la fertilización y dan lugar al desarrollo del embrión, tienen la capacidad para crecer de forma indefinida mientras mantienen su pluripotencia.(13)

6 P á g i n a 6 Estas propiedades hacen creer a los investigadores que las células madre embrionarias humanas podrían tener muchas aplicaciones científicas y clínicas, sobre todo en el posible tratamiento de pacientes con enfermedades y lesiones como la diabetes juvenil y traumas en la médula ósea.(13) Perspectivas del uso de la bioingenieria en la ortodoncia La ortodoncia en su práctica clínica trata solucionar los problemas de mal oclusión llevando la los dientes a posiciones optimas, lo mismo puede decirse a la posición de los maxilares; siendo evidente que hay que afrontar limitaciones debido a las múltiples circunstancias la Los avances en técnicas de terapia génica, tecnología del ADN recombinante, terapia celular y observación de expresión génica de las células madres durante su proliferación in vivo y ex vivo, ofrece una alternativa terapéutica funcional para mejorar el estado del paciente.(14) La regeneración tisular involucra el reemplazo de tejidos afectados con células idénticas que pueden ser generadas a partir de la estimulación de células madres mesenquimaticas. Debido a su capacidad de transdiferenciación en condiciones apropiadas, las células madres aisladas del complejo craneofacial podrían ser candidatas para el diseño de estrategias terapéuticas novedosas con aplicaciones en la práctica clínica.(14) Actualmente, la investigación en células madres se consideran como una de las líneas de investigación más atractiva para modular la reparación y regeneración de tejidos u órganos como el tejido dental y periodontal.(15) La obtención de células madres en diferentes tejidos como médula ósea, complejo pulpo dentinal, cordón umbilical, entre otros; del propio paciente, serán necesarios para permitir una completa regeneración funcional de los tejidos de la cavidad oral, eliminando los problemas de rechazo inmunológico, debido que el trasplante es autólogo. (16,17) La perspectiva de las células madres usadas a futuro inmediato en los tratamientos ortodóncico está dirigido regenerar tejidos perodontales, regeneraciones óseas que permitan la rehabilitación oral completa del paciente eliminando los posibles rechazos inmunológicos del implante, pero a un futuro lejano la bioingeniería con los avances en terapias genéticas creara estructuras dentarias completas, reconstrucciones de Las MSC o células progenitoras multipotentes adultas (MAPC),mediante la diferenciación de los diferentes fenotipos celulares permitirán la restauración de las células involucradas en el daño dental dentina, esmalte y aun mas mantener la vitalidad pulpar después de un proceso cariogènico.(18) La bioingeniería promete a futuro la resolución de múltiples problemas clínicos y situaciones, factores predisponentés a la instalación de una maloclusion como lo es la pérdida del diente a causa de la caries dental, al igual factores hereditarios como la anodoncia, mediante la creación de estructuras dentarias completas formada con células madres recolectadas hueso o de pulpa dental del propio paciente podrán ser usadas, para reparar el hueso craneofacial o regenerar tejido dental, enfermedades degenerativas, traumas, enfermedades infecciosas,sindromes y/o maloclusiones esqueleticas.(19) Las anomalías craneofaciales son frecuentes en la población que asiste a la consulta odontológica. Estas patologías pueden afectar severamente la apariencia, función y aspecto psicológico de un paciente. Aunque se han realizado investigaciones (injertos autólogos, alógenos, materiales prostodonticos) para corregir estos defectos, todos poseen limitaciones inherentes como la morbilidad del sitio donador,enfermedades virales de transmisión, incompatibilidad inmunológica, rechazos en la estructura y/o la forma de los injertos y resultados estéticos deficientes.(20) Las estrategias actuales incluyen la utilización de injertos autologos y sintéticos. aunque muchos de estos avances son buenos, presentan limitaciones como por ejemplo, la insuficiente cantidad de tejidos donantes para realizar los injertos, la mala morfología de los injertos (mayor problema de los injertos), además de grandes reabsorciones encontradas luego de los implantes. con respecto a los materiales sintéticos, el cuerpo siempre trata de encapsular todo objeto extraño produciendo su rechazo, por lo cual se ha llegado a la pregunta de cuál es el material ideal de reemplazo para la perdida de los tejidos? el

7 P á g i n a 7 estándar de oro seria el mismo tejido natural, por lo cual, se ha llegado a la ingeniería de un tejido nuevo a partir del mismo preexistente.(20) Las estrategias se fundamentan en la combinación de materiales artificiales con moléculas bioactivas que inducen la formación tisular o el crecimiento de células en un laboratorio. Las moléculas bioactivas usadas más frecuentemente son factores de crecimiento o proteínas de la matriz extracelular. Esta combinación puede ser realizada mediante procedimientos conductivos, inductivos y de trasplante de células.(20) 1. estrategias conductivas: utilización de materiales de manera pasiva como las membranas para guiar la regeneración tisular.(20) 2. estrategias inductivas: colocación de células o factores como las proteínas morfo genéticas óseas (BMPs) que se activan en el sitio del defecto induciendo la formación de los tejidos.(20) 3. estrategia de trasplante celular: trasplante directo de células producidas en el laboratorio. el odontólogo toma una biopsia la envía al laboratorio allí es colocada en moldes prefabricados, que generan tejido para implantarlo posteriormente en el paciente.(20) Un fallo muy común en las tres técnicas,es el uso del material polimérico el cual sirve como medio de transporte de las células o tejidos fabricados, ya que estos al degradarse van a formar ácidos que afectan el sitio de injerto, por esta razón se están investigando nuevos materiales para realizar la movilización de estos injertos.(20) A lo largo de los últimos años se han estudiado diferentes materiales biodegradables. El principal uso de la cerámica ha sido en la ingeniería de tejidos de hueso, donde modelos porosos con hidroxiapatita han sido utilizados para llevar células osteoprogenitoras derivadas del periostio del hueso medular. Los polímeros sintéticos han sido utilizados de gran manera como materiales para los modelos debido a sus buenas características de procesamiento. Estos materiales tienen un rango de degradación corto (días) o largo (meses). Normalmente, los modelos poliméricos se encuentran en forma de mallas fibrosas, esponjas porosas o hidrogeles.(20) Los materiales para los modelos juegan un papel importante en la estabilidad mecánica, no solo de células individuales sino también en la construcción completa del tejido antes de la síntesis de la nueva matriz extracelular. Es deseable la biocompatibilidad de las propiedades mecánicas del material y de aquellas del tejido.(20) Recientemente se han desarrollado nuevas estrategias para reemplazar los tejidos afectados, teniendo en cuenta la forma como el cuerpo realiza normalmente los procesos de ingeniería de tejido.(20) 4. modelo endógeno: crear nuevo hueso a partir del conocimiento de procesos naturales. un ejemplo muy común es el estudio de la distracción osteogénica en la cual se investigan los procesos moleculares que están involucrados para poder utilizar diferentes estrategias en la formación de nuevo hueso.(20) 5. estrategia de recombinación con bases proteicas: el mayor esfuerzo realizado en esta estrategia se ha basado en la colocación de factores de crecimiento exógenos, para aumentar la inducción de hueso o la cicatrización de un tejido. muchos trabajos se han enfocado en suplir con factores de crecimiento exógenos para aumentar la inducción de hueso o la cicatrización de un tejido. en modelos animales, los factores de crecimiento han sido administrados localmente para aumentar la reparación de defectos craneofaciales de tejido óseo en cráneo, proceso zigomático, procesos alveolares, procesos periodontales y mandibulares. entre las numerosas proteínas osteogénicas y angiogenicas que han sido investigadas están: el factor de crecimiento transformante Bs (TGF-

8 P á g i n a 8 Bs), la activin A, las BMPs, el factor de crecimiento fibroblastico (FGF-1, FGF-2), factores de crecimiento parecidos a la insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y hormonas de crecimiento (GH). en esta forma se ha utilizado BMP2 recombinante sobre esponjas de colágeno por medio de CT scan y de histología, para aumentar el proceso alveolar en pacientes que requieren aumento óseo de los defectos de la paredes bucales luego de las exodoncias. también se añaden factores de crecimiento directamente a PLA/PGA biodegradables para la fijación ósea en cirugías craneofaciales.(20) 6. los procedimientos inductivos: activan células cercanas al tejido por medio de señales específicas. estos procedimientos se han fortalecido gracias al descubrimiento de factores de crecimiento osteogénicos y angiogénicos. las proteínas de la matriz extracelular (MEC), también inducen neoformacion ósea cuando son colocadas en el sitio del defecto. estas proteínas tienen la capacidad de dirigir la función de las células residentes y por lo tanto pueden promover la regeneración tisular. por ejemplo, una preparación de proteínas del esmalte derivadas de tejidos de cerdos es utilizada para regenerar tejidos periodontales en humanos, la laminina (otra proteína de MEC) está siendo probada por su habilidad para mejorar la adhesión a los implantes dentales. para que la inducción tisular sea exitosa clínicamente, los factores biológicos de inducción deben activarse en los sitios deseados por el tiempo necesario. por esta razón uno de los objetivos de la bioingeniería es diseñar nuevos sistemas de liberación controlada. se ha demostrado que las células incorporan el DNA liberado y producen cantidades suficientes de proteínas inductivas que promueven la neoformación de tejidos.(20) 7. estrategias basadas en genes: el objetivo es iniciar la cascada de expresión génica que permita el reclutamiento celular, la diferenciación, la producción de matriz y el ensamblaje ordenado de estructuras para la regeneración de tejidos. las estrategias genéticas se han mejorado durante los últimos años y los modos de transmisión se pueden dividir en virales y no virales. dentro de los modos virales, los adenovirus han sido utilizados para los métodos basados en la transferencia genética como medio de transporte para los genes, ya que presentan gran habilidad para infectar las células con los nuevos genes, y además poseen una alta eficiencia de transfección y una gran capacidad transgenica. se han empleado adenovirus para transportar potentes factores angiogénicos (VEGF) y osteoinductores (BMPs) en ratas. los modos no virales como la transferencia génica mediada por genes liposomicos han sido muy poco utilizados ya que presentan una baja eficiencia en la transferencia de genes.(20) 8. estrategias basadas en células: cuando un tejido es incapaz de cicatrizar un defecto, o cuando un tejido u órgano debe ser diseñado in Vitro, se necesitan de bloques de células vivas para sus requerimientos. para que una célula sea funcional en la ingeniería de tejidos craneofaciales, debe seguir ciertos criterios, tales como ser capaz de formar múltiples tejidos, no ser inmunogénica, ser de rápida y fácil expansión en cultivos y ser accesible con mínima morbilidad para el sitio donante.(20) 9. construcción compleja de tejidos/órganos: depende del sitio donde se va a fabricar el tejido u órgano.(20) a. biorreactivos in Vitro: utiliza moldes tridimensionales con complejos celulares para trasplantes eventuales.(20) b. recipientes heterotopicos: utiliza células propias para transplantes heterotopicos.(20) c. donador exógeno: utiliza animales como donantes de órganos o tejidos.(20)

9 P á g i n a 9 Use of stem cells for tooth formation in vitro and ex vivo. A tooth germ can be created in vitro after co-culture of isolated epithelial and mesenchymal stem cells. This germ could be implanted into the alveolar

10 P á g i n a 10 bone and finally develop into a fully functional tooth. Construction of a bioengineered tooth. The association of tooth-derived stem cells with defined scaffolds in the presence of growth factors allows the creation of tooth specific constructs such as crown and root of missing parts of an injured tooth. These biological constructs could be used in dental clinics as substitutes for metal implants, crowns and restorative dental materials

11 P á g i n a 11 Apical papilla. (A) An extracted human third molar depicting three immature roots with two pieces of apical papilla being removed from their apices (arrow heads) and one piece of apical papilla being peeled away from the root end but not completely detached (arrow). (B) A developing root tip with attached apical papilla was cultured in vitro for 3 days before being processed for hematoxylin and eosin (H&E) staining. Odontoblasts (black arrows), apical cell-rich zone (open arrowheads), and apical papilla tissue are indicated. (C) Magnified view of the area indicated by the yellow rectangle. From: J Endod. Author manuscript; available in PMC 2009 March 9. Published in final edited form as: J Endod June; 34(6): doi: /j.joen Aplicación de la bioingeniería en la ortodoncia Consolidación de la fractura y para rellenar defectos óseo después de la extracción por indicación ortodóncica Reparación de defectos óseos alveolares creados después de las extracciones para el tratamiento de ortodoncia Reparación de fisuras alveolares Distracción osteogénica o alargamiento óseo Aumento de reborde alveolar para implante en ortodoncia Inducción de hueso para corregir problemas periodontales para el tratamiento de ortodoncia Fase de investigación Fabricación de dientes Fabricación de esmalte Fabricación de dentina Fabricación de pulpa Ingeniería de hueso Los defectos óseos secundarios a una lesión, enfermedad y/o desordenes congénitos representan un problema importante de salud. Las estrategias actuales que se encuentran dirigidas a sustituir los defectos óseos, incluyen la utilización

12 P á g i n a 12 de injertos autólogos, heterólogos y biomateriales sintéticos. Aunque estos injertos devuelven la estabilidad y la función del tejido, todavía existen algunas limitaciones.(21) recientemente se ha utilizado rhbmp-2 (proteína morfogenética ósea recombinante junto con células mesenquimatosas provenientes de medula ósea del ratón embebidas en B- tricálcico fosfato (MCS/B- TCP), en la colocación de implantes quirúrgicos y se ha demostrado la neo formación ósea. esta investigación propone también la distracción ósea como una herramienta eficaz en la recientemente se ha utilizado rhbmp-2 (proteína morfogenética ósea recombinante junto con células mesenquimatosas provenientes de medula ósea del ratón embebidas en B- tricalcico fosfato (MCS/B-TCP), en la colocación de implantes quirúrgicos y se ha demostrado la neo formación ósea. esta investigación propone también la distracción ósea como una herramienta eficaz en la producción de tejidos duros por bioingeniería, ya que la estimulación mecánica genera señales de inducción que generan la formación de nuevo hueso.(21) Regeneración de parte de una mandíbula Las malformaciones en la mandíbula de más de cinco centímetros se tratan habitualmente con un autotransplante de tejido y hueso del propio paciente. la técnica es ampliamente implantada pero tiene un efecto secundario que limita de forma significativa su eficacia : la obtención del implante produce una nueva lesión en el esqueleto del afectado que reduce su calidad de vida. Para curar una herida hay que producir otra.(20) En lugar de obtener una muestra de tejido del paciente a partir de la cual obtener el implante, los investigadores escanearon la estructura ósea del afectado mediante tomografía computarizada en tres dimensiones. con el apoyo de distintas herramientas informáticas, determinaron las dimensiones exactas que debía tener una estructura adaptada a la mandíbula.(20) Los datos recopilados se utilizaron para fabricar una malla de titanio que se rellenó con bloques de hueso, 7 mg de una proteína recombinante humana (BMP7) utilizada para estimular el crecimiento óseo y 20 ml de medula ósea del propio afectado, formada por células madres pluripotenciales.(20) En una primera fase la estructura se implanto bajo la axila derecha,en el musculo altísimo del dorso. el propio cuerpo del paciente, de 56 años se utilizó para incubar y sintetizar una prótesis que reemplazara su mandíbula deteriorada. Siete semanas después, se extrajo el implante y se colocó en el lugar para el que había sido diseñado, en sustitución del hueso dañado por el tratamiento contra un tumor. a las 4 semanas el paciente fue capaz de comer su primera comida solida después de 9 años.(20)

13 P á g i n a 13 Regeneración de un cóndilo mandibular Empleando células madres adultas mesenquimales extraídas de la medula ósea de ratas y valiéndose de sustancias químicas y factores de crecimiento, investigadores indujeron la diferenciación de las células madres en otras capaces de generar cartílago y hueso. las células fueron separadas en dos capas integradas y encapsuladas en un material biocompatible con textura de gel. Posteriormente fueron moldeadas en forma de cóndilo articular por medio de un molde realizado a partir de la articulación temporomandibular de un cadáver humano.(20) Transcurridas varias semanas, el equipo encontró que las estructuras creadas mantenían la forma del cóndilo mandibular con su tejido interior de tipo óseo y su capa de tejido cartilaginoso en la superficie. Además varios análisis confirmaron que los nuevos tejidos generados eran hueso y cartílago.(20) Insuficiencia maxilar Martínez-Estrada han aplicado implantación de células pluripotenciales obtenidas a partir de tejido adiposo (células mesenquimales ) y de aspirado medular (células nucleadas) en la rehabilitación funcional y estética del aparato estomatognático de pacientes con insuficiencia ósea maxilo-mandibular. Estas células se han utilizado mezcladas con una matriz ósea y plasma rico en plaquetas (prp) para proporcionar soporte y factores de crecimiento osteoconductivos. Se interpuso una membrana de fibrina del propio paciente para evitar la dispersión del relleno y mediante incisión del periostio se liberó el colgajo que fue suturado sin tensión. A las 8 semanas los pacientes conservaron radiológicamente el injerto en altura.el escáner demostró a los 90 días que el crecimiento óseo se había producido tanto en sentido horizontal como en el vertical.(21) Creacion de una raiz dental Investigadores de University of Southern California han conseguido generar nuevas raíces dentales en cerdos gracias a células madres procedentes de dientes humanos. el hallazgo se ha reportado a la revista plos one y podría tener aplicaciones clínicas potencialmente impactantes en cirugía dental. Seria por tanto una mejor opción para sustituir los dientes perdidos por piezas más biocompatibles que las actuales implantes metálicos. El equipo está dirigido por Songtao Shi y se centra en el uso de células madres que

14 P á g i n a 14 se pueden encontrar en la papila apical de la raíz dental. Este tejido está conectado a la punta de la raíz del diente y es el responsable del desarrollo del mismo. Anteriormente este equipo ya había conseguido recolectar células madres de la pulpa dental, estos investigadores estudiaron el comportamiento de las células madres procedentes de la papila apical tanto en Vitro como en modelos animales (ratones) estas células madres fueron consideradas por los investigadores como más jóvenes (menos diferenciados) que las procedentes de la pulpa dental y por consiguiente más apropiadas para una mejor regeneración de tejidos. Concretamente son capaces de regenerar todos los tejidos de la raíz dental así como dentina y cemento. Una vez identificadas las células madres apropiadas para crear una nueva raíz,estos investigadores reemplazaron un incisivo de un cerdo enano (tiene una estructura dental parecida a la humana) por una estructura en forma de raíz dental de material cerámico (hidroxiapatite/tricalcium phosphate o HA/TCP) que hacía de andamio y de vehículo portador de células madres de papilas apicales procedentes de los terceros molares jóvenes de entre 18 y 20 años de edad. Tres meses más tarde de implantar estas células los investigadores pudieron encajar en la cuenca del antiguo incisivo una corona sintética de porcelana sobre la nueva raíz remineralizada que contaba con nuevos ligamentos desarrollados del mismo. Pudieron demostrar además que los nuevos tejidos formados eran humanos. Después de 6 meses de la implantación los investigadores comprobaron que, aunque el nuevo diente no era tan resistente como los naturales tenían la suficiente calidad como para cumplir su función. Este sistema es preferible al sistema habitual del implante de titanio porque la bioraíz tiene una capa de ligamentos entre el hueso de la mandíbula y la raíz. Este tiene, tanto labores de adherencia y como de amortiguación a la masticación. Los implantes son susceptibles de aflojarse o de producir infecciones como gingivitis o periodontitis debido a la relación no natural entre el hueso y el implante de titanio.(3) Los trabajos publicados demuestran que los tejidos presentes en la pulpa de los dientes temporales y permanentes pueden ser usados para generar dentina y hueso alveolar, mientras que los presentes en el diente en el estado de brote pueden ser usados en la bioingeniería para recrear la totalidad de la corona dental formada por esmalte, dentina y pulpa y todo esto con una correcta anatomía. Según Sloun et al la identificación y aislamiento de una población progenitora odontogénica en la pulpa dental adulta se reportó primero por Gronthos et al. en el año 2000 estos autores describieron la identificación de las células madres pulpares por virtud a sus habilidades clonogénicas, tasas proliferativas rápidas y capacidad de formar tejidos mineralizados ambos in vivo e in Vitro.(3)

15 P á g i n a 15 Isolation of Stem Cells from Root Apical Papilla (SCAP Cominedhuman SCAP/PDLSCmediatedtissueregeneration. Swine SCAP/PDLSC-mediated root/periodontal structure as an artificial crown support for the restoration of tooth function in swine. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine Songtao Shi Creación de pulpa dental Las células madres de la pulpa se encuentran según Bluteau et al en 2008 en dos sitios diversos sugeridos: pulpa propiamente dicha (Horada et al 1999 Mitsiadis et al 2007) y zona rica en células ( Shi y Gronthos 2003) según Sloan et al. Refieren que en el año 2009 se encontraron en los siguientes capas: zona pobre en células (zona basal de weil),zona rica en células,pulpa propiamente dicha.(3) como se crea la pulpa dental? se utilizan células madres de la pulpa dental adulta o células madres de dientes deciduos,junto con células endoteliales microvasculares humanas (para diseñar vasos sanguíneos funcionales) que son inoculados en un deposito hecho de colágeno,un material reabsorbibles y luego son implantados en el tejido subcutáneo de ratones inmunodeficientes, después de un periodo de 14 a 28 días, los autores observaron que el tejido pulpar diseñado se asemeja a la pulpa dental normal. Cuando hay piezas con ápices incompletos y sufren trauma, son piezas dentales muy frágiles, lo ideal en estos casos es hacer una inducción del cierre apical y su posterior tratamiento endodóntico convencional, con la bioingeniería podríamos dar lugar a la creación de nuevo tejido pulpar que permitiría la finalización del desarrollo radicular i prevenir perdidas prematuras de dientes.(3) Creación de dentina La creación de la dentina tiene mucho que ver con la creación de la pulpa ya que a partir de células

16 P á g i n a 16 madre de la pulpa esta genera dentina reparativa y a su vez propiamente dentina.(3) Gronthos et al en el año 2000 encontró que las células madres pulpares son trasplantadas con hidroxiapatita mas fosfato tricalcico en ratones inmunocomprometidos, estas células generan estructuras similares a la dentina, con fibras colágenas perpendiculares a la superficie mineralizada, tal como ocurre normalmente in vivo, en presencia de la sialoproteina dentinal, Iohara et al en el año 2004, demostraron que la dentina desmineralizada puede inducir la diferenciación de las células madres pulpares en odontoblastos, lo cual resulta en formación de dentina.(3) Los odontoblastos pueden sobrevivir a lesiones leves, tales como atrición o caries de aparición temprana y secretan una matriz de dentina reparativa, sin embargo un trauma mayor como una caries avanzada, procedimientos restauradores pueden conducir a la muerte de los odontoblastos. (3) Numevar-Nino et Al, refieren que Gronthos et al caracterizaron estas células por medio de marcadores específicos y observaron su capacidad de autoregeneración, diferenciación a múltiples linajes y su capacidad clonogénica, hallando células madres pulpares capaces de formar dentina asociada con tejido pulpar in vivo.(3) El concepto de inducir dentina reparativa para tratar perdida de este tejido debido a la progresión de caries no es nuevo, el polvo dentinario desmineralizado posee una capacidad intrínseca de inducir la mineralización. Cuando se aplica directamente a las áreas de la exposición pulpar, la dentina desmineralizada induce a la formación local de tejidos mineralizados. Se usa depósitos hechos de colágeno con la dentina desmineralizada y esta ase coloco en lugares con exposición pulpar, dando lugar a la producción de dentina reparativa en un periodo de 2 a 4 meses. (3) Reparación de dentina estimulada por células madres. Tomada de: [Tooth Regeneration in Operative Dentistry. Operative Dent. 2006] (14). Creación del esmalte Es considerado el material más duro y resistente del mundo biológico a diferencia del hueso, el esmalte dental de un organismo adulto no contiene células por lo que no es capaz de regenerarse y cualquier deterioro que sufre resulta irreversible. el esmalte está formado principalmente por material inorgánico 96% y solo 4% de material orgánico y agua.(3) Actualmente se ha diseñado un esmalte sintético que imita la formación de estos prismas dando la apariencia de un esmalte natural pero estos prismas ya no son compuestos de hidroxiapatitasino por la bioingeniería estos prismas diseñados se llaman nanoapatitas. Las células que forman el esmalte (los ameloblastos), experimentan apoptosis en cuanto elaboran la matriz del esmalte, de manera que no quedan ameloblastos una vez terminado el proceso de amelogenesis. Por lo tanto, la formación de esmalte no es posible en dientes ya erupcionados, porque las células progenitoras Ya no están presentes. Los nanobastones de hidroxiapatita resultan ser similares en tamaño y composición a los cristales del esmalte natural.estos nanobastones tienen un fuerte potencial a servir como una plataforma para el desarrollo de materiales restaurativos fluibles diseñados para restaurar el esmalte.(3)

17 P á g i n a 17 la creación de esmalte sintético a base de nsnoparticulas presentan el siguiente proceso: se coloca la hidroxiapatita en un contenedor con agua y solvente, se espera un tiempo y a su vez el agua se va evaporando, las nanohidroxiapatitas van transformándose en prismas que se asemejan a los prismas de hidroxiapatita, el esmalte sintético es similar al esmalte natural solo hay una diferencia: es mas resistente y contiene flúor.(3) Creación de diente completo Una estrategia que refieren los autores son el uso del método de agregación celular o desarrollo biológico que consiste en la unión de células mesenquimales y células epiteliales para formar una pieza dentaria e ingeniería tisular (bioingeniería) que consiste en cultivar en depósitos de colágeno (scaffold) células de odontoblastos. Ameloblastos y de ligamento periodontal para la creación de una nueva pieza dentaria.(3) Se inoculo células madres de incisivos y molares en la capa sub-renal de ratones con bioingeniería, llegando a la conclusión que un incisivo siendo una pieza uniradicular es más fácil de recrear que una pieza multiradicular.(3) Articulación temporomandibular (ATM). Aunque muchas patologías congénitas y adquiridas afectan la ATM, existen pocas alternativas terapéuticas para estos pacientes. La bioingeniería de tejidos ha demostrado ser una herramienta novedosa en la regeneración de la ATM. Kim y col generaron cartílago de formas triangulares, cuadradas y transversales utilizando condrocitos embebidos en matrices de ácido poliglicólico con estas formas específicas. (22) Ciertas formas de corales naturales contienen poros y una estructura tridimensional similar a la de los huesos humanos, por esta razón estas formas han sido utilizadas como moldes de matriz para ingeniería de tejidos óseos y periodontales. (23) Actualmente la bioingeniería del cóndilo y de los defectos óseos de la ATM se está realizando mediante la utilización de matrices tridimensionales creadas exactamente para cada paciente con diseños asistidos por computador. (22) Células ips a partir de las células de la encía El equipo de investigación de la Universidad de Osaka, en colaboración con otros centros, logró obtener células ips (células madre pluripotenciales inducidas) a partir de la encía extirpada quirúrgicamente en la enfermedad periodontal, en los implantes dentales, etc. De esta manera, se podrá dar un destino provechoso a la encía extirpada reduciéndose la agresión al paciente en comparación al método convencional en el cual se extirpa la muestra de la mejilla, y en el futuro, podría formar parte del "banco de células ips".(24) Hiroshi Egusa, profesor adjunto de la Universidad de Osaka, se centró en la singularidad de que las células de la encía poseen una mayor tasa de proliferación y una mayor capacidad de curación respecto a las células de la piel. Con el consentimiento de un paciente masculino (24 años) que ingresara al Hospital de Odontología de la Universidad de Osaka, se extrajo una muestra de unos 3 mm del tejido de la encía. Al incorporar los cuatro genes necesarios para producir células ips a las células de la encía, en

18 P á g i n a 18 colaboración con el profesor Shinya Yamanaka de la Universidad de Kyoto, se obtuvo células nerviosas, células cartílaginosas y células intestinales, entre otras. Además, en una experiencia con ratones, pudo comprobarse que la producción de células ips es siete veces más eficiente que hacerla a partir de las células de la piel.(24) De un tejido que se descartaba originalmente, pudo obtenerse células ips eficientemente y con menor agresión para el paciente."- comentó el profesor Egusa. En un futuro, se espera que pueda conducir a la regeneración de los huesos maxilares y de los dientes, así como para el esclarecimiento deenfermedades.(24) Figure 6. Generation of human GF-derived ips cells. (A) Resection of gingival tissue from the adult patient during dental implant surgery. The resected gingival tissue (inset: scale bar; 1 mm) is generally treated as biomedical waste. (B) Fibroblasts (arrow) and epithelial cells (arrowhead) migrated out of the human gingival tissue (asterisk). Scale bar; 100 mm. (C) The morphology of established hgfs (Passage 4). Scale bar; 60 mm. (D) The morphology of a colony derived from hgfs 26 days after transduction of the four factors. Scale bar; 500 mm. (E-I) Morphology of (E and F) clonal hgfderived ips cells (clone 547A-1), (G) human dermal fibroblast-derived ips cells (DF-iPS cells) and (H and I) human KhES-3 ES cells. Scale bars; 500 mm for E, G and H, and 50 mm for F and I. doi: /journal.pone g00s BIBLIOGRAFÍA 1. Munevar N. J.C., Becerra A., Bermúdez Aspectos celulares y moleculares de las células madres involucradas en la regeneración de tejidos con aplicaciones en la práctica clínica odontológica. acta odontológica venezolana.(2008) 46 :3. 2. Magallanes Fabián M.,Carmona B.,Álvarez M.A.aislamiento y caracterización parcial de células madres de pulpa dental. Rev. odontológica mexicana (2010). 14 (1 ) :

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20 P á g i n a 20 stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat Med 2002; 8: (75) 19. Arinzeh T.L., Peter S.J., Archambault M.P., van den B.C., Gordon S., Kraus K., Smith A., Kadiyala S., Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defe ct, J. Bone Joint Surg. Am., 85-A: , Martínez J.,Muerie M. Garrido,R. Domínguez-Mompell M.,Pérez J. Revisión bibliográ?ca sobre las nuevas técnicas de ingeniería de tejidos aplicables a la Odontología anat. patologica. Univ. Rey Juan Carlos 21. Velilla L. injerto en bloque de hueso de banco.una alternativa terapéutica en la insuficiencia maxilar.2009.gaceta dental Kim CK, Choi EJ, Cho KS, et al: Periodontal repair in intrabony defects treated with a calcium carbonate implant and guided tissue regeneration. J Periodontol. 1996; 67: Chen F, Mao T, Tao K, Chen S, Ding G, Gu X. Bone Graft in the Shape of Human Mandibular Condyle Reconstruction via Seeding Marrow-Derived Osteoblasts Into Porous Coral in a Nude Mice Model. J Oral Maxillofac Surg. 2002; 60: Hiroshi E., Keisuke O., Hiroki K.,Guannan Y., Sho F., Makio S., Takuya M., Shinya Y., Hirofumi Y. Gingival Fibroblasts as a Promising Source of Induced Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. (Asahi) 2011(9) 25. Hiroshi E., Keisuke O., Hiroki K.,Guannan Y., Sho F., Makio S., Takuya M., Shinya Y., Hirofumi Y. Gingival Fibroblasts as a Promising Source of Induced Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. (Asahi) 2011(9) 26. Kaigler D, Mooney D. Tissue engineering s Impact on dentistry. J Dental Educat ; 65(5): Kim CK, Choi EJ, Cho KS, et al: Periodontal repair in intrabony defects treated with a calcium carbonate implant and guided tissue regeneration. J Periodontol. 1996; 67: Chen F, Mao T, Tao K, Chen S, Ding G, Gu X. Bone Graft in the Shape of Human Mandibular Condyle Reconstruction via Seeding Marrow-Derived Osteoblasts Into Porous Coral in a Nude Mice Model. J Oral Maxillofac Surg. 2002; 60: