11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N 5/ Agente: García-Cabrerizo y del Santo, Pedro

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N /06 A61K 3/28 A61P 19/04 A61P 21/00 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Usos para células madre mesenquimatosas humanas no autólogas. Prioridad: US Titular/es: Osiris Therapeutics, Inc. 01 Aliceanna Street Baltimore, Maryland , US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Bruder, Scott, P.; McIntosh, Kevin, R.; Marshak, Daniel, R. y Mosca, Joseph, D. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: García-Cabrerizo y del Santo, Pedro ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCIÓN Usos para células madre mesenquimatosas humanas no autólogas. Esta solicitud es una continuación en parte y una prioridad de las reivindicaciones de la solicitud de patente de los EE.UU. con número de serie 09/ , presentada el 13 de marzo de El documento US.91.6 se refiere a células madre mesenquimatosas humanas, modificadas genéticamente, transfectadas con material genético exógeno que codifica para una proteína que ha de expresarse. Cuando se utilizan estas células madre mesenquimatosas modificadas genéticamente en un tratamiento celular alogénico, el paciente ha de estar inmunodeprimido. El documento WO 97/137 describe un método para aumentar la formación ósea en un individuo en el que se administran células madre mesenquimatosas humanas al individuo con una matriz o material cerámico. El documento WO 97/137 no dice nada con respecto al uso de células madre mesenquimatosas no autólogas sin utilizar una matriz cerámica. El documento WO 97/418 se refiere a la regeneración de la piel usando una capa de soporte. Cell Transplantation, Vol. 7, págs , 1998, describe el uso de médula ósea enriquecida con condrocitos autógenos derivada de una fuente de células mesenquimatosas para la regeneración de cartílago articular. El documento GB A se refiere a la reparación del cartílago y los huesos utilizando condrocitos. La presente invención se refiere al uso de células madre mesenquimatosas (MSC) humanas alogénicas para la fabricación de una preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1. Según el uso de la presente invención, las células madre mesenquimatosas se obtienen de un paciente distinto del paciente que se está tratando, es decir, las células madre mesenquimatosas no son autólogas. Más particularmente, según el uso de la invención, un paciente se trata con células madre mesenquimatosas humanas alogénicas. Tal como se utiliza el término en el presente documento, una célula madre mesenquimatosa humana alogénica es una célula madre mesenquimatosa obtenida de un ser humano distinto del receptor al que están destinadas las células madre mesenquimatosas. Aunque las células madre mesenquimatosas expresan moléculas de MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) en su superficie, los solicitantes han encontrado que las células madre mesenquimatosas son inmunológicamente neutras y, por tanto, pueden utilizarse tal como se describe en el presente documento sin inducir una respuesta inmunológica adversa en el receptor de las células. Además, los solicitantes han encontrado que no es necesario que el donante de las células madre mesenquimatosas sea compatible con el receptor. Según la presente invención, se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas son invisibles para el sistema inmunológico. Normalmente, cocultivar células de diferentes individuos (células alogénicas) da como resultado la proliferación de células T, que se manifiesta como una reacción mixta de linfocitos (MLR). Sin embargo, cuando las células madre mesenquimatosas humanas están en contacto con linfocitos T alogénicos, in vitro, no generan una respuesta inmunológica mediante las células T, es decir, las células T no proliferan, lo que indica que las células T no responden a las células madre mesenquimatosas incompatibles. Este descubrimiento fue inesperado porque las células madre mesenquimatosas humanas expresan todas las moléculas de superficie que las convierten en inmunogénicas, es decir, expresan moléculas alogénicas del MHC de clase I y clase II. También se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas reducen activamente la respuesta de las células T alogénicas en las reacciones mixtas de linfocitos, de una manera dependiente de la dosis. Además, se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas procedentes de diferentes donantes no muestran especificidad de respuesta reducida con respecto al tipo de MHC. Por tanto, no es necesario que las células madre mesenquimatosas sean compatibles con una población de células diana en la reacción mixta de linfocitos, con el fin de reducir la respuesta proliferativa de las células T alorreactivas con las células madre mesenquimatosas. Breve descripción de los dibujos Figura 1. Falta de alorreactividad frente a las células madre mesenquimatosas. Las células T procedentes de A proliferaron de una manera dependiente de la dosis cuando se mezclaron con diferentes cantidades de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) procedentes de B. Las células T procedentes de A no proliferaron en respuesta al contacto con células madre mesenquimatosas procedentes de B, aun cuando las células madre mesenquimatosas se manipularon para proporcionar una activación completa de células T (se realiza la transducción de las células madre mesenquimatosas con las moléculas coestimuladoras B7-1 o B7-2). Figura 2. Las células madre mesenquimatosas inhiben activamente la reacción mixta de linfocitos entre linfocitos de dos individuos diferentes. Las hmsc- 1 constituyeron una tercera parte junto a las células estimuladoras y que responden en la reacción mixta de linfocitos; hmsc-2 eran autólogas frente a las células estimuladores en la reacción mixta de linfocitos. Por tanto, las células madre mesenquimatosas inhibieron la reacción mixta de linfocitos sin especificidad según el tipo de MHC. Las células madre mesenquimatosas inhibieron la reacción mixta de linfocitos de una manera dependiente de la dosis. Figura 3. Estudio alogénico en perros. El análisis histológico de una muestra autóloga de 6 semanas procesada en DMEM-LG mostró una cantidad sustancial de hueso. Figura 4. Estudio alogénico en perros. El análisis histológico de una muestra alogénica de 6 semanas mostró formación ósea. Figura. Estudio alogénico en perros. El análisis histológico de una muestra alogénica de 6 semanas procedente de un donante diferente al mostrado en la figura 4, también mostró formación ósea. Figura 6. Mapa esquemático del plásmido EGFPpOT2 utilizado en el ejemplo 4. Descripción detallada de la invención Las composiciones fabricadas según la presente invención que contienen células madre mesenquimatosas alogénicas son especialmente útiles para facilitar la reparación, reconstrucción y/o regeneración de un defecto de tejido conjuntivo. Según la presente in-

3 3 ES T3 4 vención, las células madre mesenquimatosas alogénicas se utilizan para la fabricación de una preparación farmacéutica para tratar trastornos del esqueleto y de otros tejidos conjuntivos. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de células madre o progenitoras mesenquimatosas alogénicas para la fabricación de una preparación farmacéutica que potencia la producción de células hematopoyéticas. Todavía en otro aspecto de la invención descrita en el presente documento, las células madre mesenquimatosas alogénicas se obtienen por ingeniería genética (o se transducen o transfectan) con un gen de interés. Las células transducidas pueden utilizarse para la fabricación de una preparación farmacéutica que va a administrarse a un paciente que lo necesita, por ejemplo, para tratar enfermedades o trastornos genéticos. La presente invención utiliza células madre mesenquimatosas aisladas y expandidas mediante cultivo que son alogénicas para el receptor al que van destinadas. Aunque la invención no está limitada de ese modo, las células madre mesenquimatosas pueden aislarse, purificarse y expandirse mediante cultivo, es decir in vitro, para obtener un número suficiente de células para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Véanse, Caplan y Haynesworth, patente de los EE.UU. número ; patente de los EE.UU. número ; patente de los EE.UU ; documento WO92/284. Por tanto, en una realización preferida, las células madre mesenquimatosas humanas se obtienen a partir de médula ósea tomada de un individuo alogénico para el receptor. En una realización preferida, la preparación de células mesenquimatosas es sustancialmente pura, es decir, está libre en al menos un 9% de células alogénicas distintas de las células madre mesenquimatosas. Las células madre mesenquimatosas humanas objeto se obtienen a partir de la médula ósea y otras fuentes de células madre mesenquimatosas. Las células de médula ósea pueden obtenerse de la cresta ilíaca, fémur, tibia, columna vertebral, costillas u otros espacios medulares. Otras fuentes de células madre mesenquimatosas humanas incluyen, placenta, cordón umbilical, piel de adolescente y sangre. Las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas aisladas y purificadas pueden hacerse crecer en un estado no diferenciado mediante expansión mitótica en un medio específico. Estas células pueden cultivarse y activarse entonces para que se diferencien en hueso, cartílago y otros diversos tipos de tejido conjuntivo mediante varios factores, incluyendo estímulos mecánicos, celulares y bioquímicos. Las células madre mesenquimatosas humanas poseen el potencial para diferenciarse en células tales como osteoblastos y condrocitos, que producen una amplia variedad de células de tejido mesenquimatoso, así como en tendones, ligamentos y dermis, y este potencial se conserva tras el aislamiento y durante varias expansiones de población mediante cultivo. Por tanto, al poder aislar, purificar, multiplicar enormemente y después activar las células madre mesenquimatosas para que se diferencien en los tipos específicos de células mesenquimatosas deseadas, tales como tejidos esquelético y conjuntivo, tales como hueso, cartílago, tendón, ligamento, músculo, tejido adiposo y estroma de médula ósea, véase la patente de los EE.UU número , existe un proceso sumamente eficaz para tratar trastornos del esqueleto y otros tejidos conjuntivos. Aunque en una realización preferida, las células madre mesenquimatosas se expanden mediante cultivo antes de su uso, también es posible utilizar tales células madre mesenquimatosas sin expansión mediante cultivo. Por ejemplo, las células madre mesenquimatosas pueden derivarse de la médula ósea y utilizarse tras la separación de las células sanguíneas de la misma, sin expansión. Por tanto y por ejemplo, la médula ósea alogénica puede enriquecerse en células madre mesenquimatosas humanas alogénicas eliminando las células sanguíneas e introducirse en un paciente que las necesita, por ejemplo, para reparación esquelética. Por tanto, una realización de la presente invención proporciona diversos usos para la fabricación de una preparación farmacéutica para mejorar la implantación y diferenciación de células madre mesenquimatosas alogénicas. En consecuencia, las células madre mesenquimatosas pueden utilizarse para la fabricación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de trastornos de tejido conjuntivo, por ejemplo, para promover el crecimiento de tejidos conjuntivos. El término tejido conjuntivo se utiliza en el presente documento para incluir los tejidos del organismo que soportan elementos especializados e incluye hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo y tejido adiposo. Según un aspecto preferido de esta realización, las células madre mesenquimatosas alogénicas pueden emplearse en diversos usos para la fabricación de una preparación farmacéutica para tratar trastornos del esqueleto y de otros tejidos conjuntivos. La presente invención utiliza células progenitoras mesenquimatosas alogénicas aisladas que, en determinadas condiciones, pueden inducirse para que se diferencien en, y produzcan diferentes tipos de, tejido conjuntivo deseado, tal como células de formación de hueso o cartílago. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a diversos usos de las células progenitoras o madre mesenquimatosas alogénicas humanas para la fabricación de una preparación farmacéutica para fines terapéuticos. Por ejemplo, las células progenitoras o madre mesenquimatosas humanas alogénicas encuentran uso en: (1) regenerar tejidos mesenquimatosos que han resultado dañados por lesión aguda, expresión génica anómala o enfermedad adquirida; (2) tratar un huésped con tejido mesenquimatoso dañado mediante el tratamiento del tejido dañado con células madre mesenquimatosas alogénicas combinadas con un vehículo biocompatible adecuado para administrar células madre mesenquimatosas al (a los) sitio(s) tisular(es) dañado(s); (3) producir diversos tejidos mesenquimatosos; (4) detectar y evaluar los factores de crecimiento relevantes para la propia regeneración y diferenciación de las células madre mesenquimatosas en linajes mesenquimatosos comprometidos; () detectar y evaluar los factores inhibidores que modulan el compromiso y la diferenciación en linajes mesenquimatosos específicos; y (6) desarrollar linajes celulares mesenquimatosos y someterlos a ensayo para determinar los factores asociados con el desarrollo de tejido mesenquimatoso. La dosis de células madre mesenquimatosas alogénicas varía dentro de límites amplios y naturalmente se ajustará a los requisitos individuales en cada caso 3

4 ES T3 6 particular. El número de células utilizadas dependerá del peso y el estado del receptor y de otras variables conocidas por los expertos en la técnica. La preparación farmacéutica que comprende las células puede administrarse mediante una vía que sea adecuada para el tejido u órgano particular que ha de tratarse. La preparación farmacéutica que comprende las células puede administrarse sistémicamente, es decir, por vía parenteral mediante inyección intravenosa. En la mayoría de los casos, las células madre mesenquimatosas alogénicas se administran al sitio de tratamiento o terapia deseado y pueden dirigirse a un tejido u órgano particular, tal como la médula ósea. Las células pueden suspenderse en un diluyente apropiado, a una concentración de desde aproximadamente 0, hasta aproximadamente x 6 células/ml. Excipientes adecuados para tales disoluciones son aquellos que son biológica y fisiológicamente compatibles con el receptor, tales como la solución salina tamponada. Otros excipientes incluyen agua, soluciones salinas comunes isotónicas, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. La composición para la administración debe formularse, producirse y almacenarse según los métodos habituales que cumplen con una esterilidad y estabilidad apropiadas. La preparación farmacéutica que comprende las células madre mesenquimatosas humanas puede administrarse mediante una implantación subcutánea de células o mediante inyección de las células madre, por ejemplo, en células musculares. La preparación farmacéutica puede utilizarse en un método para reparar una lesión del tejido conjuntivo. El método comprende las etapas de aplicar un extracto que contiene células progenitoras o madre mesenquimatosas alogénicas a una zona de lesión del tejido conjuntivo en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células en el tipo de tejido conjuntivo necesario para la reparación. La preparación farmacéutica puede utilizarse en un método para mejorar la implantación de un dispositivo protésico en el tejido esquelético. El método comprende las etapas de adherir las células progenitoras o madre mesenquimatosas alogénicas a la superficie de conexión de un dispositivo protésico, e implantar el dispositivo protésico que contiene estas células mesenquimatosas en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células en el tipo de tejido esquelético o conjuntivo necesario para la implantación. La preparación farmacéutica puede utilizarse en un método para aumentar la formación ósea en un individuo que la necesita. Por tanto, los métodos de este aspecto son aplicables a defectos del tejido conjuntivo, lo que incluye cualquier lesión o irregularidad en comparación con el tejido conjuntivo normal, que puede producirse debido a traumatismo, enfermedad, la edad, defectos de nacimiento, intervención quirúrgica, etc. Más particularmente, la preparación farmacéutica puede utilizarse en un método para llevar a cabo la reparación de defectos óseos segmentarios, pseudoartrosis, consolidaciones defectuosas o retrasos de consolidación. Tal como se usa en el presente documento, defectos del tejido conjuntivo también se refiere a zonas no dañadas en las que la formación ósea se desea únicamente, por ejemplo, para la mejora estética. Por tanto, las preparaciones farmacéuticas descritas en el presente documento son adecuadas para su uso en intervenciones quirúrgicas ortopédicas, dentales, orales, maxilofaciales, periodontales y otras La presente invención también se refiere al uso de las células madre o progenitoras mesenquimatosas alogénicas para la fabricación de una preparación farmacéutica para corregir o modificar los trastornos del tejido conjuntivo. Por tanto, en otro aspecto, la presente invención describe diversos dispositivos y factores que se han desarrollado con el fin de inducir a las células progenitoras o madre mesenquimatosas alogénicas para que se diferencien en tipos específicos de fenotipos deseados, tales como las células de formación de hueso o cartílago. Por ejemplo, los inventores han encontrado que pueden utilizarse diversos dispositivos cerámicos porosos de tricálcico o hidroxiapatita como vehículos o portadores de las células progenitoras o madre mesenquimatosas alogénicas cuando se implantan en defectos del esqueleto, permitiendo y/o estimulando así la diferenciación de las células en tejido esquelético. Por tanto, una realización de la invención se refiere al uso de una composición cerámica porosa que comprende fosfato tricálcico o hidroxiapatita o combinaciones de los dos, como un vehículo o portador de las células progenitoras o madre mesenquimatosas, que cuando se implanta en defectos del esqueleto, promueve la diferenciación de las células en tejido esquelético. En otra realización, la invención se refiere al uso de una matriz basada en colágeno, celulosa y/o gelatina absorbible en combinación con las células madre mesenquimatosas alogénicas. Esta composición puede utilizarse en la forma de una esponja, tira, polvo, gel, banda u otro formato físico. Pueden emplearse diversos vehículos alternativos para administrar las células madre mesenquimatosas humanas, para reparar el tejido conjuntivo. Las composiciones pueden diseñarse como un parche para el tejido dañado para proporcionar volumen y soporte a la formación de nuevo hueso o cartílago. Las composiciones, métodos y materiales diversos descritos en el presente documento pueden utilizarse, según la presente invención, para estimular la reparación de fracturas recientes, fracturas de pseudoartrosis y para promover la fusión de la columna vertebral. Véase la patente de los EE.UU. número Asimismo, puede llevarse a cabo la reparación del cartílago y de otros tejidos musculoesqueléticos. En el caso de la fusión de la columna vertebral, tales composiciones, métodos y materiales pueden utilizarse posteriormente con o sin instrumentación para promover la fusión de la masa a lo largo de la lámina y las apófisis transversas y, anteriormente, pueden utilizarse para llenar una caja de fusión para promover la fusión intersomática. Las preparaciones farmacéuticas, fabricadas de conformidad con la presente invención, que utilizan células madre mesenquimatosas alogénicas pueden utilizarse para tratar la artroplastia total y la osteoporosis. Según otro aspecto de la invención, las preparaciones farmacéuticas que comprenden células madre mesenquimatosas pueden utilizarse para producir estroma de médula ósea. El estroma de médula ósea proporciona el soporte, así como los factores solubles que dirigen y apoyan la síntesis de las células sanguíneas, es decir la hematopoyesis. En consecuencia, este aspecto de la invención se refiere a un método para potenciar la apófisis de células sanguíneas y la regeneración de tejido de la médula ósea en pacientes en los que la médula ósea está debilitada o destruida, tal

5 7 ES T3 8 como por ejemplo, durante el tratamiento intensivo de quimioterapia y radiación, mediante el empleo de células progenitoras hematopoyéticas derivadas de, por ejemplo, la médula ósea o la sangre periférica. En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona productos para utilizar células madre mesenquimatosas alogénicas para potenciar el injerto de células progenitoras o madre hematopoyéticas. Por tanto, una realización de la presente invención proporciona una preparación farmacéutica para potenciar la regeneración del tejido de la médula ósea utilizando células madre mesenquimatosas alogénicas. El método para potenciar el injerto de células progenitoras o madre hematopoyéticas comprende administrar a un individuo que las necesita, (i) células madre mesenquimatosas alogénicas y (ii) células progenitoras o madre hematopoyéticas, en el que dichas células madre mesenquimatosas se administran en una cantidad eficaz para promover el injerto de tales células progenitoras o madre hematopoyéticas en el individuo. Más particularmente, una realización de la invención se refiere al uso de células madre mesenquimatosas en una preparación farmacéutica que, cuando se administra sistémicamente, migrará o se alojará en la cavidad de la médula ósea y se diferenciará en estroma de médula ósea, regenerando así el estroma de la médula ósea. Las células madre mesenquimatosas alogénicas pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa, en diversos sitios de administración o directamente en el hueso. Una consideración adicional en este aspecto se refiere al momento de la inyección de las células madre mesenquimatosas alogénicas en el paciente en relación con la administración de células progenitoras o madre hematopoyéticas. En una realización, las células madre mesenquimatosas se inyectan simultáneamente con las células progenitoras o madre hematopoyéticas. En otra realización, las células madre mesenquimatosas se administran antes o después de la administración de las células progenitoras o madre hematopoyéticas. Las células madre hematopoyéticas pueden ser autólogas o pueden ser compatibles con las células alogénicas. La presente invención es útil para la fabricación de una preparación farmacéutica para potenciar la eficacia del trasplante de médula ósea como tratamiento contra el cáncer. El tratamiento del cáncer mediante irradiación con rayos X o terapia alquilante destruye el microentorno de la médula ósea, así como las células madre hematopoyéticas. El tratamiento actual es trasplantar la médula ósea al paciente tras la ablación de la médula ósea, que previamente se ha cultivado y crioconservado. Sin embargo, dado que el microentorno de la médula ósea está destruido, el injerto de médula ósea se retrasa hasta que se restablezca el entorno del estroma. Como resultado, un aspecto crítico de la presente invención se refiere a las ventajas de trasplantar células madre mesenquimatosas alogénicas, expandidas mediante cultivo, purificadas y aisladas, para acelerar el proceso de reconstitución del estroma y de regeneración del tejido de la médula ósea. Los modos de administración de la preparación de células madre mesenquimatosas incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa sistémica e inyección directamente en el sitio de actividad deseado. La preparación puede administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración es preferiblemente sistémica. En este aspecto de la invención, la preparación de células madre mesenquimatosas puede administrarse sola; sin embargo, en una realización preferida, las células madre mesenquimatosas se utilizan en la forma de composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de las células madre mesenquimatosas alogénicas y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una realización preferida, la preparación o composición de células madre mesenquimatosas se formula según los procedimientos habituales como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a los seres humanos. Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un anestésico local para paliar cualquier dolor en el sitio de la inyección. En general, los componentes se suministran o bien por separado o mezclados entre sí en la forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un concentrado crioconservado en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla, que indique la cantidad de principio activo. Cuando la composición tenga que administrarse por infusión, puede administrarse con una botella de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición tenga que administrarse mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, de manera que los componentes puedan mezclarse antes de la administración. El método de administración puede modificarse, particularmente (1) aumentando o disminuyendo el intervalo de tiempo entre la inyección de las células madre mesenquimatosas y la implantación del tejido; (2) aumentado o disminuyendo la cantidad de células madre mesenquimatosas inyectadas; (3) variando el número de inyecciones de células madre mesenquimatosas; o (4) variando el método de administración de las células madre mesenquimatosas. La preparación de células madre mesenquimatosas se utiliza en una cantidad eficaz para promover el injerto de las células progenitoras o madre hematopoyéticas en el receptor. En general, tal cantidad es de al menos 1 x 4 células madre mesenquimatosas por kg de peso corporal y, más generalmente, es necesario que sean mas de 3 x 6 células madre mesenquimatosas/kg. Preferiblemente, es de al menos aproximadamente 1 x 6 células madre mesenquimatosas/kg antes de la introducción del injerto y normalmente no es necesario que sean más de aproximadamente 2 x 6 células madre mesenquimatosas/kg. La preparación de células madre mesenquimatosas alogénicas puede administrarse simultáneamente con las células progenitoras o madre hematopoyéticas o durante un periodo anterior a la introducción del injerto de al menos aproximadamente 7 días, pero en general que no supera los días, con un periodo de tratamiento terapéutico habitual de 7 a 14 días. La preparación de células madre mesenquimatosas se administra preferiblemente por vía intravenosa de una a tres veces al

6 9 ES T3 día, y puede ajustarse para que cumplan con la eficacia óptima y la dosificación farmacológica. La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los componentes de la preparación farmacéutica de la invención. Asociada con tal(es) recipiente(s) puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos o biológicos, nota que refleje la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para la administración en seres humanos. La presente invención es particularmente ventajosa porque las preparaciones de células madre mesenquimatosas pueden utilizarse para una variedad de tratamientos, en los que la fuente de células madre mesenquimatosas es distinta al receptor y sin requerir que tal fuente sea compatible con el receptor. Además, tales células madre mesenquimatosas pueden utilizarse sin requerir la administración prolongada de inmunodepresores. Todavía en un aspecto adicional, la presente invención también se refiere al uso de células madre mesenquimatosas humanas alogénicas como células obtenidas por ingeniería genética que llevan en ellas genes de interés, particularmente para la expresión de proteínas fisiológica o farmacológicamente activas o para su uso para la fabricación de una preparación farmacéutica en la terapia genética. Según este aspecto de la presente invención, las células progenitoras o las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas puede utilizarse como células huésped para la expresión de productos génicos exógenos. Estas células expandidas mediante cultivo se alojan en la médula ósea y potencian la recuperación hematopoyética en una práctica de trasplante de médula ósea. Además, estas células pueden manipularse para terapia celular, por ejemplo, pueden expandirse, purificarse, seleccionarse y mantenerse para su uso clínico, mientras todavía mantienen su fenotipo precursor. Parte de esta manipulación es la caracterización de tales células y su crioconservación para el uso futuro. Se contempla que las células madre alogénicas transformadas y los productos de expresión del material genético incorporado pueden utilizarse solos o en combinación con otras células y/o composiciones. Se ha descrito la tecnología utilizada para introducir genes externos en estos cultivos celulares progenitores, por ejemplo, véase la patente de los EE.UU. número.91.6, y proporciona células madre mesenquimatosas transducidas en las que toda la progenie de las células lleva el nuevo material genético. La administración celular de las células transformadas puede llevarse a cabo mediante diversos modos, incluyendo infusión e inyección directa en sitios de periostio, médula ósea, músculo y subcutáneos. En virtud de este aspecto de la presente invención, pueden introducirse genes en las células madre mesenquimatosas alogénicas utilizadas para la fabricación de preparaciones farmacéuticas que después se administran al paciente, en las que la expresión génica realizará su beneficio terapéutico. Ejemplos de tales aplicaciones incluyen genes que desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de las células mesenquimatosas, en el desarrollo tisular, en la remodelación, en la reparación y en la producción in vivo de productos génicos extracelulares Además de la corrección de trastornos genéticos, este aspecto de la presente invención puede introducir, de una manera dirigida, copias adicionales de genes esenciales para permitir el aumento de la expresión de determinados productos génicos. Estos genes pueden ser, por ejemplo, hormonas, proteínas de la matriz, proteínas citocinas de la membrana celular, moléculas de adhesión, enzimas de desintoxicación y proteínas de reconstrucción importantes en la reparación tisular. Las células madre mesenquimatosas normales pueden proporcionarse para tratar células madre mesenquimatosas anómalas. Una aplicación adicional es el uso de genes introducidos para modificar el fenotipo de las células madre mesenquimatosas alogénicas y su progenie diferenciada para aplicaciones terapéuticas específicas. Esto incluye productos génicos extracelulares, moléculas de transducción de la señal, proteínas de la superficie celular, productos de expresión génica extracelular y receptores hormonales. Estados de enfermedad y procedimientos para los que tales tratamientos tienen aplicación incluyen los trastornos genéticos del sistema musculoesquelético, enfermedades del hueso y el cartílago, la médula espinal, estados inflamatorios, enfermedades degenerativas musculares, malignidades y autotrasplante y alotrasplante de médula ósea o de hueso. En una realización, las células madre mesenquimatosas humanas aisladas son preferiblemente células madre mesenquimatosas que se han transformado con al menos una secuencia de ADN que puede expresar aquellos productos de la traducción que pueden empaquetar la secuencia vírica, de manera que sean células productoras de terapia génica. En una realización preferida de este aspecto, las células madre mesenquimatosas humanas se han transformado con una secuencia de ADN que comprende secuencias LTR (repeticiones terminales largas) retrovirales en y, bajo el control de la transcripción del mismo, al menos uno de los genes retrovirales gag, pol o env. En otro aspecto, las células madre mesenquimatosas humanas aisladas también se han transformado con una secuencia de ADN que comprende una secuencia señal de empaquetamiento retroviral y material genético incorporado que va a expresarse bajo el control de un promotor del mismo, de manera que sean retrovirus ineficaces. También se contempla la transfección de células madre mesenquimatosas o células precursoras del estroma comprometidas para iniciar, modular o aumentar la hematopoyesis. Prácticamente todas las lesiones genéticas del tejido o células mesenquimatosas pueden tratarse o corregirse mediante esta tecnología. Un componente clave es la capacidad para administrar estas células madre que llevan genes al tejido apropiado, en las condiciones en que las células madre se extienden y repoblan el espacio tisular. La preparación del paciente para la introducción de las células madre mesenquimatosas alogénicas incluye, pero no se limita a, (a) ablación de la médula ósea por quimioterapia y/o irradiación junto con trasplante de la médula ósea, y (b) infiltración tisular directa de células transducidas sin preparación, particularmente cuando las células transducidas pudieran tener una ventaja de supervivencia, una ventaja durante la diferenciación o una ventaja en la función (tal como podría ser el caso cuando se corrige un trastorno muscular, tal como distrofia muscular con la distrofina o un gen similar).

7 11 ES T Una aplicación adicional es la marcación de las células madre mesenquimatosas preparadas para su utilización in vivo solas o aplicadas a cualquier dispositivo permanente, tal como por ejemplo, un dispositivo ortopédico en el que es de interés marcar las células madre mesenquimatosas para observar su supervivencia, mantenimiento y diferenciación y su asociación con el dispositivo a lo largo del tiempo. Las ventajas proporcionadas por las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas, transfectadas con material genético exógeno que codifica para una proteína que va a expresarse incluyen (a) la capacidad de utilizar células madre mesenquimatosas humanas obtenidas a partir de una variedad de fuentes distintas al individuo en el que se administrarán, es decir, alogénicas para el individuo; (b) la capacidad de administrar estas células madre mesenquimatosas que llevan genes al tejido apropiado en un paciente sin inducir una respuesta inmunológica adversa, minimizando así la necesidad de terapia con inmunodepresores antes de la administración de las células; (c) la capacidad de expandir mediante cultivo las células madre mesenquimatosas humanas para su infusión donde se localizarán en los espacios del tejido mesenquimatoso; (d) la capacidad de expandir mediante cultivo y crioconservar células madre mesenquimatosas humanas que pueden utilizarse como huéspedes para la transferencia génica heredable y estable; (e) la capacidad de recuperar genéticamente células alteradas tras su instalación in vivo; (f) la capacidad de ajustar una terapia genética a una amplia variedad de trastornos, localizando exactamente la alteración genética en el tejido diana; y (g) la capacidad de que los genes recientemente introducidos dentro de las células madre mesenquimatosas humanas y su progenie se expresen de una forma menos restrictiva que en otras células, extendiendo así la aplicación potencial al tratar la enfermedad médica. La estructura y el ciclo vital de los retrovirus los convierten en idealmente adecuados para ser vehículos de transferencia génica. En general, en lo que se refiere a la transferencia génica mediada por retrovirus, véase McLachlin et al., Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 38:91-13 (1990). La transformación de las células madre utilizando retrovirus se ha descrito en la patente de los EE.UU. número También es posible utilizar vehículos distintos a los retrovirus para modificar u obtener por ingeniería genética las células madre alogénicas. La información genética de interés puede introducirse por medio de cualquier virus que pueda expresar el nuevo material genético en tales células, por ejemplo, SV, herpesvirus, adenovirus y virus del papiloma humano. Pueden utilizarse muchos métodos para introducir ADN eucarióticos clonados en células de mamífero en cultivo, lo que incluye transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE-dextrano, fusión de protoplastos y electroporación. El material genético que ha de transferirse a las células madre puede estar en la forma de ácidos nucleicos virales, plásmidos bacterianos o episomas. La presente invención posibilita obtener por ingeniería genética células madre humanas mesenquimatosas alogénicas, de tal manera que produzcan polipéptidos, hormonas y proteínas no producidas normalmente en las células madre humanas en cantidades biológicamente significativas, o producidas en cantidades pequeñas pero en situaciones en las que la producción en exceso conduciría a un beneficio terapéutico. Estos productos se secretarían entonces en el torrente sanguíneo u otras zonas del organismo, tales como el sistema nervioso central. Las células madre humanas formadas de esta forma pueden servir como sistemas de liberación sostenida del fármaco para sustituir a los regímenes actuales que requieren la administración periódica (por ingestión, inyección, infusión prolongada, etc.) de la sustancia que se necesita. Esta invención tiene aplicabilidad en proporcionar hormonas, enzimas y fármacos a los seres humanos que necesitan tales sustancias. Es particularmente valioso proporcionar tales sustancias, tales como hormonas (por ejemplo, hormona paratiroidea, insulina), que son necesarias en dosis sostenidas durante periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, pueden utilizarse para proporcionar la administración sostenida de insulina y, como resultado, no habría necesidad de inyecciones diarias de insulina. Las células madre mesenquimatosas humanas obtenidas por ingeniería genética también pueden utilizarse para la producción de factores de la coagulación, tales como el factor VIII, o para la administración sostenida de distrofina a las células musculares para la distrofia muscular. La incorporación de material genético de interés en células madre mesenquimatosas humanas alogénicas es particularmente valiosa en el tratamiento de enfermedades heredadas y adquiridas. En el caso de las enfermedades heredadas, este enfoque se utiliza para proporcionar células madre mesenquimatosas humanas modificadas genéticamente y otras células que pueden utilizarse como una reserva metabólica. Es decir, tales células madre mesenquimatosas humanas servirían para degradar una sustancia potencialmente tóxica. Por ejemplo, esto podría utilizarse en el tratamiento de trastornos del catabolismo de los aminoácidos incluyendo las hiperfenilalaninemias, debido a un defecto en la fenilalanina hidroxilasa; las homocisteinemias, debido a un defecto en la cistationina β-sintasa. Otros trastornos que podrían tratarse de esta forma incluyen trastornos del metabolismo de los aminoácidos, tal como la cistinosis; trastornos del transporte de membrana, tal como la histidinuria o la hipocolesterolemia familiar; y trastornos del metabolismo de los ácidos nucleicos, tal como la aciduria orótica hereditaria. Las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas utilizadas en la presente invención también pueden utilizarse en el tratamiento de las enfermedades genéticas en las que un producto (por ejemplo, una enzima u hormona) normalmente producido por el organismo no se produce o se hace en cantidades insuficientes. Aquí, pueden utilizarse las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con un gen que codifica para la sustancia que falta o producida inadecuadamente para producirla en cantidades suficientes. Esto puede utilizarse en la producción de alfa-1 antitripsina. También pueden utilizarse en la producción del factor XIII y el factor IX y, por tanto, podrían ser útiles en el tratamiento de la hemofilia. Hay muchas enfermedades adquiridas para las que puede proporcionarse tratamiento mediante el uso de células madre mesenquimatosas humanas alogénicas obtenidas por ingeniería genética (por ejemplo, células madre mesenquimatosas humanas transducidas con material genético de interés) para la fabricación 7

8 13 ES T de una preparación farmacéutica. Por ejemplo, tales células pueden utilizarse en el tratamiento de la anemia, que se presenta comúnmente en enfermedades crónicas y que a menudo está asociada con insuficiencia renal crónica (por ejemplo, en pacientes sometidos a hemodiálisis). En este caso, las células madre mesenquimatosas humanas que tienen incorporadas en ellas un gen que codifica para la eritropoyetina podrían corregir la anemia estimulando la médula ósea para aumentar la eritropoyesis (es decir, la producción de eritrocitos). Otras citocinas codificadas pueden ser G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) o GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos - macrófagos), por ejemplo. Las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas utilizadas en la presente invención también pueden utilizarse para administrar una dosis baja de activador del plasminógeno tisular como un activador para evitar la formación de trombos. En este caso, las células madre mesenquimatosas humanas que tienen incorporado el material genético que codifica para TPA se administrarían a un individuo en el que se desea evitar un trombo. Esto sería útil, por ejemplo, como un medio preventivo contra trastornos comunes tales como la coronariopatía, la enfermedad cerebrovascular, la enfermedad oclusiva vascular periférica, la trombosis venosa (por ejemplo, superficial), tal como se observa en la embolia pulmonar o la trombosis venosa profunda. Las células madre mesenquimatosas humanas que contienen ADN que codifica para calcitonina pueden utilizarse en el tratamiento de la enfermedad de Paget, un trastorno crónico y progresivo del metabolismo óseo, en el que la calcitonina se administra actualmente por vía subcutánea. Otra aplicación es una implantación subcutánea de células madre mesenquimatosas humanas alogénicas solas o adheridas a un dispositivo cúbico, cerámico y poroso que alojará las células madre mesenquimatosas y les permitirá diferenciarse in vivo. Otro ejemplo sería la inyección de células madre mesenquimatosas alogénicas en el músculo, en el que se diferenciarán en células musculares. Otro ejemplo podría ser un injerto que tiene células madre mesenquimatosas humanas obtenidas por ingeniería genética que secretan continuamente una hormona polipeptídica, por ejemplo, la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) para su uso en la regulación de la natalidad. Las células madre mesenquimatosas humanas obtenidas por ingeniería genética para producir y secretar interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3 o IL-4 a IL-11) pueden utilizarse en diversos contextos. Por ejemplo, la administración de IL-3 mediante células madre mesenquimatosas humanas que contienen material genético que codifica para la IL-3 puede utilizarse para aumentar el recuento de neutrófilos para tratar la neutropenia. Las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas también pueden transducirse con el gen que codifica para la trombopoyetina y cuando se administran a un individuo que tiene un estado marcado por un bajo recuento de plaquetas, la producción y la secreción del producto codificado dará como resultado la estimulación de la producción de plaquetas. Otro uso de la presente invención es para el tratamiento de enfermedades producidas por un defecto enzimático. En este caso, el producto (polipéptido) codificado por el gen introducido en las células madre mesenquimatosas humanas no se secreta (como en el caso de las hormonas); en lugar de eso, es una enzima que permanece dentro de la célula. Hay numerosos casos de enfermedades genéticas en las que un individuo carece de una enzima particular y no puede metabolizar diversos aminoácidos u otros metabolitos. Los genes correctos para estas enzimas podrían introducirse en las células madre mesenquimatosas alogénicas y trasplantarse en el individuo; el trasplante llevaría a cabo entonces esa función metabólica. Por ejemplo, hay una enfermedad genética en la que los afectados carecen de la enzima adenosina desaminasa. Esta enzima participa en la degradación de purinas a ácido úrico. Se cree posible, utilizando la presente invención, producir un injerto subcutáneo tal como se describió anteriormente, que pueda producir la enzima que falta a niveles suficientemente altos como para desintoxicar la sangre cuando pasa a través de la zona en la que se aplica el injerto. Usos adicionales incluyen, pero no se limitan a, genes de citocina para potenciar la reconstitución hematopoyética tras el trasplante de médula ósea en el caso de insuficiencia de médula ósea por trastornos congénitos de médula ósea; citocinas óseas para mejorar la reparación y consolidación de huesos lesionados; problemas de la matriz ósea para mejorar la reparación y la consolidación del hueso lesionado y degenerativo; corrección de trastornos genéticos mesenquimatosos tal como la osteogénesis imperfecta y la distrofia muscular; producción localizada de proteínas, hormonas, etc., que proporcionan agentes terapéuticos celulares para muchos compuestos diferentes; y genes citotóxicos, tal como la timidina cinasa que sensibiliza las células para el ganciclovir. La adhesión en unión comunicante (gap) a las células tumorales podría permitir que las células madre mesenquimatosas sirvieran en el tratamiento contra el cáncer. Sin embargo, ha de entenderse que el alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones específicas descritas anteriormente. La invención puede ponerse en práctica de otra manera distinta a la descrita particularmente y estar todavía dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que los métodos descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo de varias formas que son bien conocidas en la técnica, con numerosas modificaciones y variaciones de los mismos. También puede apreciarse que ninguna de las teorías explicadas como los modos de acción o interacciones entre los tipos celulares debe interpretarse como limitante de esta invención en modo alguno, sino que se presentan de manera que los métodos de la invención puedan entenderse más completamente. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente aspectos de la presente invención. Sin embargo, en modo alguno son una limitación de las enseñanzas o la descripción de la presente invención tal como se explica en el presente documento. Ejemplo I Falta de alorreactividad a las células madre mesenquimatosas Los antígenos de la superficie celular responsables de provocar el rechazo en los trasplantes son los antígenos de MHC de clase I y de clase II. Las células T son alorreactivas para los antígenos del MHC extraño. Las moléculas del MCH de clase I y II estimulan la reacción mixta de linfocitos. Se cultivaron 1 x células T procedentes del individuo A (T A ) en pocillos de microtitulación de fon-

9 ES T3 16 do plano con PBMC alogénicas tratadas con mitomicina C (para evitar la proliferación de PBMC a las células T) procedentes del individuo B (mpbmc B ) durante 7 días. Las mpbmc B se sembraron a K y 0 K. Los cultivos se pulsaron con 3 H-timidina durante las últimas 18 horas del periodo de cultivo para medir la proliferación de células T. Los resultados mostrados en la figura I indican que las células T A reconocieron a las PBMC B como extrañas. (Véanse las barras con el título T A + mpbmc B ). Cuanto más PBMC B estaban presentes, más células T proliferaban. Se incubaron de manera conjunta 2 x 4 células madre mesenquimatosas humanas (hmsc) procedentes del mismo donante que las PBMC, con 1 x células T procedentes del individuo A (T A ). Las células se cultivaron en pocillos de microtitulación de fondo plano durante un total de 7 días. Los cultivos se pulsaron con 3 H-timidina durante las últimas 18 horas del periodo de cultivo para medir la proliferación de células T. Dos días antes de cocultivar con las células T, se sembraron células madre mesenquimatosas humana en pocillos de microtitulación en el número dado anteriormente (confluente) y se trataron con IFN-γ (interferón γ) (0 unidades/ml) para estimular la expresión del MHC superficial en las células madre mesenquimatosas. Se incubaron con las células T, células madre mesenquimatosas humanas o células madre mesenquimatosas humanas transducidas con moléculas de coestimulación B7-1 humana o B7-2 humana (Lafferty, K.J., Prowse, S.J. y C.J. Simeonovic. Ann. Rev. Immunol. 1: (1983)). Los resultados mostrados en la figura 1 (véase T A + hmsc transducidas en la figura 1) demuestran que los linfocitos T no respondieron (no proliferaron) a las células madre mesenquimatosas humanas transducidas ni a las no transducidas, es decir, no se reconocieron como extrañas. Por tanto, no hubo reacción mixta de linfocitos. Los resultados también muestran que la falta de respuesta a las células madre mesenquimatosas humanas no se debió a la compatibilidad genética entre los individuos, puesto que las células T no reconocieron a las células mononucleares de sangre periférica (PBMC B ) del donante de células madre mesenquimatosas como extrañas. Ejemplo 2 Inhibición de la reacción mixta de linfocitos Para determinar si las células madre mesenquimatosas inhiben activamente la respuesta alogénica, se establecieron reacciones mixtas de linfocitos (MLR) en placas de cultivo tisular, con o sin células madre mesenquimatosas adherentes obtenidas a partir de 2 donantes diferentes: un donante era compatible con la célula estimuladora u objetivo en la MLR y el otro donante no estaba relacionado. Se mezclaron PBMC procedentes del individuo A (PBMC A ) con PBMC procedentes del individuo B objetivo (PBMC B ). Las PBMC B se irradiaron (células estimuladoras) con irradiación con rayos X de 00 radianes para evitar su proliferación debido a la activación de PBMC A. Por tanto, sólo proliferaron las PBMC A (células que respondieron). Cuando se mezclaron PBMC A y PBMC B se produjo una reacción mixta de linfocitos en la que las células PBMC A se activaron por los antígenos de superficie sobre las PBMC B. Los cultivos se incubaron durante un intervalo de 7 días y después se pulsaron con 3 H-timidina durante las últimas 18 horas. En presencia de PBMC B, las PBMC A proliferaron dando recuentos de.000. Véase la figura 2, 1ª barra ( NINGUNA se refiere a la ausencia de células madre mesenquimatosas) Sin embargo, cuando se mezclaron PBMC A y PBMC B en presencia de células madre mesenquimatosas, se inhibió la reacción mixta de linfocitos. PBMC A se mezclaron con PBMC B en pocillos de placa de microtitulación recubiertos con una monocapa de células madre mesenquimatosas humanas. Las células madre mesenquimatosas se añadieron en los pocillos en cantidades que oscilaban desde 700 hasta células madre mesenquimatosas por pocillo. Se probaron dos poblaciones de células madre mesenquimatosas: células madre mesenquimatosas humanas que se obtuvieron de un individuo que era compatible con el tipo de MHC del individuo B y células madre mesenquimatosas humanas que se obtuvieron de un individuo que no era compatible ni con el tipo de MHC del individuo A ni del B. Los cultivos se incubaron durante un intervalo de 7 días y se pulsaron con 3 H-timidina durante las últimas 18 horas. En presencia de células madre mesenquimatosas humanas se inhibió la MLR. Véase la figura 2. Por tanto, independientemente del origen de MHC de las células madre mesenquimatosas, las células madre mesenquimatosas inhibieron la reacción mixta de linfocitos. Los resultados mostrados en la figura 2 también indican que las células madre mesenquimatosas humanas disminuyeron la reacción mixta de linfocitos de una manera dependiente de la dosis. Las células madre mesenquimatosas procedentes de cualquiera de los donantes inhibieron la proliferación igualmente bien, lo que indica que no hubo especificidad de inhibición con respecto al tipo de MHC. Estos resultados demuestran que las células madre mesenquimatosas inhibieron activamente la reacción mixta de linfocitos cuando las células se cultivaron juntas. Ejemplo 3 Estudio subcutáneo alogénico en perros El propósito de este estudio fue determinar si la implantación subcutánea de muestras de HA/TCP (hidroxiapatita / fosfato tricálcico) cargadas con MSC alogénicas daban como resultado una respuesta inmunológica en perros y si esta respuesta tenía un efecto sobre la osteogénesis mediada por MSC. Se utilizaron dos perros para esta implantación alo-subcutánea. Cada perro recibió 6 autoimplantes de MSC en un muslo y 3 aloimplantes de cada uno de dos donantes alogénicos en el muslo contralateral. Tres de los autoimplantes y todas las muestras alogénicas se cargaron en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbeco) - glucosa baja, libre de fenol y libre de suero. Las otras tres muestras autogénicas se cargaron en medio DMEM - glucosa elevada, libre de suero. Sólo se utilizaron MSC crioconservadas en el estudio y las muestras se cargaron 24 horas antes de la implantación. Se asignaron dos muestras de cada tipo para tratamiento histológico y una para extracción de ARN. Además, se recogió una cantidad limitada de sangre y ganglios linfáticos para la determinación de la respuesta inmunológica. Los puntos finales fueron 2 semanas y 6 semanas. El perro de 2 semanas se sometió a intervención quirúrgica de tendón bilateral, mientras que el perro de 6 semanas se sometió a intervención quirúrgica de tendón unilateral en la extremidad que recibió los autoimplantes subcutáneos. Los perros en el estudio no pertenecían a la misma camada. 9

10 17 ES T3 18 Resultados La observación macroscópica del lecho del implante en el sacrificio y también la observación de la salud general no indicaron ninguna reacción inmunológica principal a los aloimplantes ni en el punto final de 2 semanas ni en el de 6 semanas. Los ganglios linfáticos poplíteos estaban aumentados en ambas extremidades en ambos puntos de tiempo. Los ganglios linfáticos inguinales no pudieron identificarse. Los datos de MLR preliminares utilizando PBMC de una combinación del par donante - huésped indicaron una reacción positiva con un recuento de K en el ensayo de proliferación, lo que indica que este par es incompatible. La sección histológica de dos semanas de las auto y alo-muestras no se diferenciaron entre sí. Hubo tejido conjuntivo laxo presente en todas las muestras y no se observó formación ósea en ninguna de las muestras (tal como se espera a las 2 semanas). Se obtuvieron los datos histológicos de una muestra de dos de cada grupo en el punto de tiempo de 6 semanas. La muestra autóloga de 6 semanas tratada en DMEM-LG tenía una cantidad sustancial de hueso en la muestra (figura 3). La alo-muestra procedente de cada uno de los dos alo-donantes también fue positiva para hueso (figuras 4 y ) y el patrón de formación de tejido fue similar al de la auto-muestra. La cantidad de formación ósea en las alo-muestras fue inferior que en la auto-muestra. Sin embargo, dada la variabilidad en la cantidad de formación ósea asociada con este ensayo, no puede extraerse ninguna conclusión partiendo de la base del limitado tamaño de muestra. No pudo observarse respuesta inmunológica en ninguna de las alo-muestras con tinción HE (hematoxilina - eosina). Los datos sobre la formación ósea en estos estudios preliminares muestran claramente que las MSC de perro conservan su potencial osteogénico en una práctica alogénica y no provocan una respuesta inmunológica principal. Ejemplo 4 El objetivo del estudio fue demostrar la viabilidad y la seguridad en perros de la infusión de una dosis moderadamente alta de células madre mesenquimatosas de perros (cmsc) de la misma camada con antígeno leucocitario de perro (DLA) donante idéntico a x 6 células/kg en una práctica de aloinjerto de médula ósea. Un objetivo secundario fue examinar la distribución y la función de las cmsc marcadas con GFP y neo a 0 y 10 días tras el trasplante. Materiales y métodos Animales de experimentación Se utilizaron perros Beagle para el estudio. Se utilizaron en el estudio dos perros macho y dos hembra de la misma camada con DLA idéntico, con edades de 7 ó 9 meses en el día 0. El método para el tipado utilizado supone el uso de marcadores microsatélite altamente polimórficos para seguir la herencia de la región DRB de clase II en el antígeno leucocitario de perro (DLA), el equivalente canino del complejo mayor de histocompatibilidad. Los microsatélites son pequeñas repeticiones de di, tri o tetra-nucleótidos, que muestran una variación de longitud suficiente en los alelos de manera que pueden utilizarse para seguir la herencia de los segmentos cromosómicos a través de cruces de múltiples generaciones. La segregación de los alelos se monitoriza normalmente utilizando una reacción en cadena de la polimerasa de una única etapa con cebadores derivados de secuencias únicas de ADN que rodean cada repetición. Además, se llevaron a cabo reacciones mixtas de leucocitos en los pares de la misma camada con DLA idéntico escogidos para el estudio para proporcionar confirmación de los resultados del ensayo de marcador microsatélite de PCR. Diseño del estudio Los perros se sometieron a trasplante con cmsc y médula ósea procedente del mismo donante de la misma camada con DLA idéntico. El injerto de médula ósea se extrajo de cada uno de los dos miembros de la misma camada con idéntico DLA en el día 0 antes de la irradiación corporal total (TBI) y se intercambiaron. Se indujo mieloablación mediante la exposición de los perros en el día 0 a una única dosis de TBI de 9 centigray (cgy) (exposición al aire en la línea media de dos fuentes de Co opuestas suministradas a una velocidad de 7 cgy (9,3 R)/min. Se realizó la transducción de cmsc expandidas mediante cultivo aisladas de un aspirado de médula ósea donante a las 4 o más semanas antes del trasplante con que contenía los genes para la proteína fluorescente verde (GFP) y neomicina fosfotransferasa (neo). Las cmsc se crioconservaron tras el paso 1 (P1) o el paso 2 (P2). Tras la TBI, se descongelaron las cmsc y se administraron por vía intravenosa mediante una bomba de infusión portátil durante un periodo de tiempo de minutos. En un plazo de una a dos horas tras la infusión de cmsc, se realizó la infusión por vía intravenosa del injerto de médula ósea a una dosis de 1 x 8 células nucleadas totales (TNC)/kg. Se administró ciclosporina por vía intravenosa a los cuatro perros para prevenir la enfermedad del injerto contra huésped (EICH) en los días 0 al a una dosis de mg/kg b.i.d ( mg/kg/día) (Sandimmune solución para inyección, Novartis Pharmaceuticals Corporation). En los días 6 al 0 (final del estudio) para el grupo I.1.a, o del 6 al 0 para el grupo I.1.b, se administró ciclosporina a mg/kg b.i.d. v.o., ( mg/kg/día) (Neoral cápsulas de gelatina blanda, Novartis Pharmaceuticals Corporation). El tratamiento de apoyo normal con antibióticos orales para el receptor comenzó en el día y se comenzó a administrar antibióticos sistémicos en el día 0 y se continuó hasta que se logró el injerto. Se suministró reposición de líquidos cuando fue necesario. No se requirieron transfusiones de plaquetas para ninguno de los cuatro perros durante su recuperación. Los procedimientos habituales con perros requieren que se administre una transfusión de sangre completa si el recuento de plaquetas cae sistemáticamente por debajo de.000/mm 3 o si el personal del tratamiento observa signos de hemorragia. Las transfusiones de plaquetas, si eran necesarias, habían de administrarse como 0 ml de sangre completa irradiada (00 cgy) procedente de un donante aleatorio. Se estableció el injerto como el tiempo de la primera de tres mediciones consecutivas de > 00 neutrófilos absolutos por mm 3, > 1.000/mm 3 y plaquetas >.000/mm 3, 0.000/mm 3 y > Para seguir la recuperación hematopoyética, se obtuvieron hemogramas completos (CBC) desde el día 0 hasta el día 0 y cada dos semanas posteriormente para el grupo del estudio de 0 días. Se realizó un análisis bioquímico del suero en los días 0, 2 y cada semana posteriormente. Se tomaron muestras de sangre periférica en los puntos de tiempo del día 0 antes de la infusión de MSC, y minutos, 1 y 2 horas y 1, 2, 3 y 4 días para el aislamiento del

11 19 ES T3 ADN. Se evaluó el ADN para determinar la presencia de células marcadas con GFP y mediante un PCR- ELISA de ADN anti-egfp con digoxigenina incorporada en el producto y una segunda etapa de ensayo colorimétrico anti-digoxigenina. Se obtuvo un aspirado de médula ósea cuando el recuento de plaquetas alcanzó sistemáticamente 0.000/mm 3 y se examinó para determinar la presencia de células marcada con GFP utilizando el mismo método de PCR. Se establecieron cultivos de cmsc para examinar las unidades formadoras de colonias (UFC) y para expandir las cmsc para un posterior análisis por PCR anti-egfp. Durante la necropsia, se obtuvieron sangre periférica, aspirados de médula ósea y biopsias de médula ósea para el análisis por PCR anti-egfp. Se realizaron ensayos de UFC en los aspirados de médula ósea y se realizó el análisis por PCR anti-egfp en las cmsc expandidas mediante cultivo. Se realizó un análisis histológico para determinar la presencia de GFP en diversos tejidos. Aislamiento, expansión mediante cultivo, transducción y crioconservación de cmsc Se obtuvieron aspirados de médula ósea bilaterales para el establecimiento de cultivos y aislamiento de cmsc en la semana -4 para perros CAN y CAN y en la semana -9 para perros CAN y CAN Se obtuvieron quince ml de médula (7 ml de cada húmero) de cada perro. Los perros se anestesiaron mediante una inyección de butorfanol seguido por una inyección de una mezcla de diazepam y clorhidrato de ketamina (Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA). Los sitios de inserción de la aguja se lavaron con povidona yodada y luego se aclararon con alcohol. Se obtuvieron aspirados de cada cóndilo humeral de cada perro utilizando una aguja para médula ósea de 2 pulgadas, de calibre 16. Se unió una jeringa a la aguja y se aplicó succión para extraer 8 ml de médula de cada húmero. Los aspirados de médula ósea se transfirieron a tubos cónicos de polipropileno de ml utilizando una técnica estéril. Tras el procedimiento, el perro se situó sobre una almohadilla eléctrica para su recuperación. Se diluyeron alícuotas de a ml de médula ósea hasta 0 ml con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) en un tubo de cultivo de polipropileno. Las suspensiones celulares se sometieron a centrifugación a 20 rpm durante minutos a temperatura ambiente (TA). Se determinaron los recuentos de células nucleadas totales en ácido acético al 4%. Entonces, se diluyeron las células en DPBS para una concentración final de x 6 células/ml. Se cargaron diez ml de 0 x 6 células en ml de Percoll (peso esp. de 1,073 g/ml) en un tubo cónico de 0 ml y se sometieron a centrifugación a 10 rpm durante minutos. La interfase celular que contenía las células mononucleares se lavó con DPBS, se resuspendió en medios completos y se contó para obtener un porcentaje de recuperación. Entonces, se diluyeron las células en medios completos, se establecieron cultivos tal como se describió anteriormente y se pusieron en un incubador a 37ºC, con un % de CO 2. Construcción del vector retroviral MuL V bicistrónico Se construyó el retrovirus con la proteína fluorescente verde (EGFP) aislando el gen EGFP-1 de la medusa Aequorea victoria (Clontech, CA). Se clonó el gen EGFP en el vector retroviral pjm73-neo (el plásmido resultante se denominó pot-24). Se derivó el plásmido pjm73-neo de pn2 (Keller et Al., 198, Nature 318:149) con las siguientes modificaciones: se sustituyó el sitio de iniciación gag retroviral murino por un codón de terminación dentro del marco; se construyeron LTR en y LTR en 3 en el mismo casete; se insertaron el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) y un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) en pn2. En la figura 6, se muestra un mapa esquemático del plásmido EGFP-pOT24. Preparación del retrovirus recombinante pot-24 se transfectó en células productoras ecotrópicas GP&E86 utilizando DOTAP (Boehringer Manheim) tal como sugiere el fabricante. Las células transfectadas se hicieron crecer en medio DMEM - glucosa elevada (HG) complementado con un % de FBS inactivado por calor, penicilina - estreptomicina (Life Technologies) y 0, mg/ml de sulfato de protamina - G418 (sigma) como un marcador selectivo. Los cultivos se mantuvieron hasta un 70% de confluencia, momento en el que se sustituyó el medio por nuevos medios retrovirales (sin G418) y las células se mantuvieron a 32ºC durante 2 días. Se recogió el medio de cultivo que contenía el retrovirus. Se filtró a través de un filtro de 0,4 µ y se almacenó a -70ºC. Se preparó el retrovirus anfotrópico mediante la transducción de células PA317 dos veces con el virus ecotrópico utilizando un procedimiento de transducción mediante centrifugación seguido por la selección con G418 (0, mg/ml). Se recogió el sobrenadante retroviral. El título del retrovirus con EGFP reunido en células 3T3 fue de 1,2 x 6 UFC/ml. Los sobrenadantes de retrovirus con GFP se crioconservaron a -70ºC. CAN y CAN Se establecieron las células mononucleares lavadas, obtenidas en la interfase de Percoll, en matraces T-18 que contenían ml de medios completos y x 6 células/matraz. En los días 2, 6 y 9 de cultivo, se sustituyeron completamente los medios en los matraces por nuevos medios completos. En el día 12 del cultivo primario, se tomaron fotografías y las células se llevaron del paso 0 (P0) al paso 1 (P1). Se aspiraron los medios y los matraces se lavaron dos veces con 8 ml de DPBS. Se añadieron ocho ml de tripsina y los matraces se colocaron en un incubador a 37ºC durante 3 minutos. Una vez que las células habían ascendido, se detuvo la reacción mediante la adición de 8 ml de medios completos. Las células se transfirieron y se reunieron en tubos cónicos de 0 ml. Los matraces se lavaron con DPBS y las células reunidas se centrifugaron a TA a 00 rpm durante minutos. Se extrajo el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en medios completos. Las células se reunieron, contaron y examinaron para determinar su viabilidad. Las células se cultivaron en placa en matraces T80 que contenían 18 ml de medio completo y 0,4 x 6 células por matraz. En el día de cultivo, se realizó la primera transducción en de los 18 matraces. Se extrajeron los medios. Se descongelaron alícuotas del sobrenadante de retrovirus y se añadió polibreno hasta una concentración final de 8 µg/ml para preparar la mezcla de transducción. El medio celular se sustituyó por ml de la mezcla de transducción y se centrifugaron los matraces a 00 rpm durante 1 hora a 32ºC. Tras la centrifugación, se añadieron ml de medios completos preparados utilizando suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor a cada matraz (con la mezcla de 11

12 21 ES T3 22 transducción) y se devolvieron los matraces al incubador. Los matraces no se sometieron a transducción y se sustituyeron por medios nuevos. En el día 16 de cultivo, los medios se sustituyeron por nuevos medios completos. En el día 17 de cultivo, se repitió el procedimiento de transducción. En el día 18 de cultivo, se recogieron las células tal como se describió anteriormente y se llevaron de P1 a P2. Se añadieron 3 x 6 células a 0 ml de medio completo, y se vertieron en matraces por triplicado (de 00 cm 2 ). Se prepararon quince matraces por triplicado con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas. Se crioconservó cualquier célula restante. Se preparó una disolución congelada de un % de DMSO y un 90% de FBS. Se resuspendieron x 6 células en 1 ml de disolución de congelación. Los viales se etiquetaron y se crioconservaron en un envase Cryo de Nalgene durante un mínimo de 4 horas a -70ºC y se almacenaron a -70ºC. En el día 22 de cultivo en P2, se tomaron fotografías para registrar la distribución y la morfología celulares y se recogieron las células en P2 y se crioconservaron tal como se describió anteriormente. CAN y CAN Se establecieron las células mononucleares lavadas, obtenidas en la interfase de Percoll, en matraces T-7 que contenían ml de medios completos y 12 x 6 células/matraz. En el día 2 de cultivo, se sustituyeron completamente los medios en los matraces y las placas por nuevos medios completos. En el día 6 de cultivo primario para cmsc, se realizó la primera transducción tal como se describió anteriormente. Tres matraces no se sometieron a transducción y se sustituyeron por nuevos medios en el día 6. En el día 7 de cultivo, se sustituyeron los medios por nuevos medios. En el día 8 de cultivo, se repitió el procedimiento de transducción. En el día 9 de cultivo, se tomaron fotografías y se pasaron las células de P0 a P1, tal como se describió anteriormente. Se añadieron 3 x 6 células a 0 ml de medio completo, y se vertieron en matraces por triplicado. Se prepararon quince matraces por triplicado con células transducidas y se prepararon tres con células no transducidas. Los aspirados de ml de médula ósea produjeron 9, 1212, 86 y 1948 x 6 células nucleadas para los donantes CAN-07-01, CAN-07-02, CAN y CAN-07-04, respectivamente. Los recuentos de células mononucleares obtenidas de la interfase de Percoll fueron de 612, 666, 88 y 462 x 6, dando como resultado recuperaciones del 67,2,, 68,7 y 23,7%. En P1, la viabilidad celular fue una media de 97,1 (intervalo de 93,3 a 0)%. En P2 para los donantes CAN y CAN-07-02, y las células en P1 para los donantes CAN y CAN-07-04, la viabilidad celular de las células transducidas fue una media de 96,7 (intervalo de 96,3 a 97,9)%. Las células no transducidas fueron viables en un 9,4 (intervalo de 93,3 a 96,9)%. Tras la recogida para crioconservación de las cmsc, la viabilidad de las células transducidas fue una media de un 99,4 (intervalo de 97,4 a 0)% y las células no transducidas fueron viables en un 99,4 (intervalo de 97,6 a 0)% (tabla 4). El rendimiento por matraz de las cmsc transducidas, para los donantes CAN y CAN-07-02, recogidas 4 días después del paso 2 y cultivadas en placa a 3 x 6 por matraz, fue de,9 y 6,7 x 6 y el rendimiento por matraz de las cmsc no transducidas fue de 8,4 y 7, x 6. El rendimiento por matraz de las cmsc transducidas, para los donantes CAN y CAN-07-04, recogidas 4 días después del paso 1 (diferente diseño de paso y transducción) y cultivadas en placa a 3 x 6 por matraz, fue de,0 y 14,0 x 6 y el rendimiento por matraz de las cmsc no transducidas fue de,3 y 18,0 x 6. Ensayos de UFC en cmsc procedentes de cultivos en P0 Se prepararon ensayos de colonias de UFC en el momento del establecimiento del cultivo primario, cultivando en placa 0, x 1 6 células, por triplicado, en placas de 0 mm que contenían ml de medios completos. Las placas se incubaron a 37ºC y con un % de CO 2. Los medios se sustituyeron por medios nuevos cada 2 a 4 días. En el día de cultivo, se aclararon las placas de ensayo de UFC con HBSS dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 1% durante minutos, se aclararon con HBSS dos veces y se secaron al aire. Se tiñeron entonces las cmsc en las placas con cristal violeta, se aclararon con agua desionizada tres veces y se secaron al aire. Se contaron las colonias para calcular el número de colonias que se forman por 6 células cultivadas en placa. Los ensayos de UFC se cultivaron en placa el día del aislamiento de células mononucleares y establecimiento de los cultivos, y se recogieron en el día produciendo 6, 46,7, 114 y 72 colonias por 6 células para los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN y CAN-07-04, respectivamente. En el día 13 de cultivo en P1, se tomaron fotografías para registrar la distribución y morfología celulares y se recogieron las células en P1 mediante tripsinización y se crioconservaron tal como se describió anteriormente. Se decantaron los medios en los matraces por triplicado y se aclararon los matraces con 0 ml de DPBS. Tras decantar el DBPS, se añadieron 23 ml de tripsina al 0,% a cada matraz por triplicado. Los matraces se colocaron en un incubador a 37ºC durante 3 minutos. Tras el desprendimiento de las células, se añadieron 23 ml de medio completo a cada matraz. Las suspensiones celulares se transfirieron a tubos cónicos de 0 ml y los matraces se lavaron con ml de HBSS. Los tubos se centrifugaron a 20 rpm durante minutos a TA. Se reunieron y contaron los sedimentos que contenían las células transducidas o no transducidas, respectivamente. Se reservó una alícuota de 1 x 7 células para la determinación del porcentaje de transducción mediante un ensayo PCR-ELISA de ADN anti-egfp. Tras la recogida, se centrifugaron las cmsc expandidas mediante cultivo y transducidas de P1 o P2 a 10 rpm durante minutos y se resuspendieron en alícuotas de 1 ml con 1 x 7 cmsc/ml en disolución de crioconservación enfriada en hielo, que contenía un 8% de Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), un % de DMSO y un % de suero canino autólogo. Se dispensaron alícuotas de células en crioviales separados que contenían 1 ml cada uno. Los tubos se etiquetaron con el número de donante canino y el recuento de células viables totales. Se crioconservaron las cmsc colocando los viales celulares en un envase para congelación de Nalgene y se pusieron en un congelador a -70ºC durante 4 horas, luego se trasladaron a almacenamiento a -70ºC. Tras la recogida celular para la crioconservación

13 23 ES T3 24 del producto, se obtuvieron alícuotas de 1 x 7 células para la determinación de la eficacia de la transducción. La eficacia de la transducción se analizó mediante un PCR-ELISA de ADN anti-egfp con incorporación de digoxigenina en el producto y una segunda etapa de ensayo colorimétrico anti-digoxigenina. Producto de infusión de cmsc De una a dos horas antes de la infusión, se descongelaron los viales de cmsc haciéndolos girar en un baño de agua a 37ºC, se pulverizaron con etanol al 70% y se abrieron en una cámara de bioseguridad. El producto de cmsc se suspendió en 0 ml de medio de infusión que contenía DMEM-LG más un % de suero autólogo para el donante de células. Se determinó la viabilidad del producto de cmsc mediante exclusión de azul de tripano, para determinar la dosis viable real. Se sometió una alícuota de cada producto de cmsc a crecimiento, aerobio y anaerobio, con aislado de levaduras. Se evaluaron las cmsc para determinar la capacidad de unirse al plástico del cultivo tisular y para proliferar en cultivo de P2 (P3 para CAN y CAN-07-02). Se cultivaron en placa alícuotas de 1 x 6 y 0,16 x 6 cmsc en medio de cultivo canino completo, por triplicado, en matraces de cultivo de plástico T-. Tras 24 horas, se recogieron por tripsinización y se contaron los matraces cultivados en placa con 1 x 6 cmsc y en el día 3, los matraces cultivados en placa con 0,16 x 6 cmsc. Tras TBI, se infundió la suspensión de cmsc a través de un catéter insertado en la vena cefálica, utilizando un mini-infusor de mano de Harvard Bard para administrar los 0 ml en un periodo de - minutos. Se infundieron dosis moderadamente altas de 7,49, 7,3,,0 y,0 (media de 8,7) x 6 cmsc viables/kg en el día 0 a los perros CAN-07-01, CAN , CAN y CAN-07-04, respectivamente. Estas dosis representan un aumento de 4 a veces sobre la dosis normal que recibiría un paciente. Las cmsc viables totales infundidas oscilaron desde 67,7 hasta 129 (media de 93,3) x 6 cmsc. La viabilidad de las células osciló desde 92,1 hasta 97,6 (media de 94,9) según se determinó mediante la exclusión de azul de tripano. Las infusiones de cmsc se administraron entre 71 y 146 (media de 1) minutos después de la TBI. Toma de muestras de sangre tras la infusión Se obtuvieron muestras de sangre (2 ml) antes (pre) y durante la infusión de cmsc, a los cinco y quince minutos después del inicio de la infusión, así como en los puntos de tiempo de 1 y 2 horas, y 1, 2, 3 y 4 días. Se prepararon lisados celulares utilizando el kit de aislamiento de ADN Puregene MR (Gentra Systems, Inc.) para su uso en un PCR-ELISA de ADN anti-egfp con digoxigenina incorporada al producto y una segunda etapa de ensayo colorimétrico antidigoxigenina para determinar el nivel de cmsc marcadas con GFP en el torrente sanguíneo. Recogida de médula ósea e infusión del injerto Se recogió la médula ósea que iba a utilizarse como el injerto de trasplante de la camada con DLA idéntico antes de la TBI. Se obtuvieron aspirados de cada húmero utilizando una aguja para médula ósea de acero inoxidable, de punta redonda, de 4-6 pulgadas, de calibre 11, unida a un tubo de polivinilo que sale de un matraz de vacío que contenía 0 ml de medio de cultivo tisular 199 y 4 ml (00 U) de heparina. La médula se hace pasar a través de un tamaño de poro de 0 y 0 µm y se almacena a 4ºC en un envase de un paquete de transferencia, etiquetado con el donante y el receptor, hasta la siguiente infusión ese día. Se corrige el recuento de células nucleadas totales de médula ósea (BM-TNC) de la médula para excluir cualquier célula nucleada que estuviese presente en el volumen de sangre periférica obtenido durante la recogida de la médula. Se corrigió el recuento de células nucleadas totales (TNC) de la médula ósea para excluir cualquier TNC que estuviese presente en el volumen de sangre periférica obtenido durante la recogida de la médula. Las dosis corregidas de médula fueron de 4,3, 3,, 3,1 y 2,0 (media de 3,2) x 8 TNC/kg para los perros CAN-07-01, CAN-07-02, CAN y CAN-07-04, respectivamente. Las dosis de médula ósea no corregidas fueron de,6, 4,2, 4, y 2,7 (media de 4,3) x 8 TNC/kg. Veinte minutos antes de la infusión, la médula se puso a temperatura ambiente. Una hora después de la infusión de cmsc, la médula se infundió por vía intravenosa, mediante una palomilla insertada en la vena cefálica, ejerciendo presión sobre la bolsa durante de 1 a 2 minutos. Tratamiento de soporte En el día -, se administraron antibióticos orales (sulfato de neomicina y sulfato de polimixina) tres veces al día. Estos antibióticos orales se administraron hasta que los recuentos de neutrófilos absolutos alcanzaron 00/mm 3. El día 0, se administró el antibiótico sistémico Baytril por vía intravenosa dos veces al día y se continuó hasta que los recuentos de neutrófilos absolutos alcanzaron 1.000/mm 3 sistemáticamente. La pérdida de líquidos y electrolitos que resulta de la toxicidad de la radiación temporal se repusieron mediante administración subcutánea de 00 ml de solución de Ringer, dos veces al día, hasta que aceptaron el agua y los alimentos. Recuentos diferenciales de células sanguíneas Se extrajeron muestras sanguíneas (2 ml) de la vena yugular o de la cefálica en las mañanas del aspirado medular para el aislamiento de las cmsc, en los días 0 al 0 y dos veces por semana posteriormente hasta el final del estudio. Se transfirió la sangre a un vacutainer que contenía EDTA. Los recuentos totales de leucocitos y plaquetas por mm 3 se midieron usando un Sysmex E00 y los recuentos diferenciales de células se determinaron manualmente tras fijación y tinción con tinción de Wrights. Necropsia Se obtuvieron muestras sanguíneas para CBC, análisis bioquímico 23 y evaluación por PCR. Se sedaron los perros con butorfanol seguido de una mezcla de diazepam y clorhidrato de ketamina. Tras la sedación, se obtuvieron biopsias y aspirados bilaterales de médula ósea a partir de los húmeros, fémures y crestas ilíacas. Después se completó la eutanasia con una sobredosis del sedante, pentobarbital sódico. El grupo de perros del 0 días (CAN y CAN-07-02) se sometieron a eutanasia en el día 43 del estudio; el grupo de perros de 0 días (CAN y CAN ) se sometieron a eutanasia el día 0 del estudio. Se resecaron los conjuntos completos de tejidos con la necropsia de los animales. La resección de los tejidos para el examen histológico siguió inmediatamente. Se usó un subconjunto de tejidos para análisis mediante PCR-ELISA de ADN anti-egfp. Se usaron los aspirados de médu- 13

14 ES T la ósea y las biopsias para el análisis mediante PCR- ELISA de ADN anti-egfp, expansión mediante cultivo para posterior análisis de PCR y ensayos de UFC. Se cortaron los tejidos en piezas cuadradas de aproximadamente 1 pulgada y se colocaron en distintos tubos cónicos de 0 ml, etiquetados, llenos de formalina tamponada neutra al % (ph 6,8-7,2). Los tejidos se sumergieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las muestras de médulas ósea se tiñeron con tinción de ácido peryódico de Schiff. Los aspirados de médulas ósea obtenidos antes de la necropsia se recogieron en tubos etiquetados de ml procedentes de los húmeros, los fémures y las crestas ilíacas izquierdos y derechos de cada perro. Un subconjunto de las muestras tisulares se obtuvo durante la necropsia y se cortó en piezas cuadradas de aproximadamente ¼ de pulgada, se envolvieron en gasa embebida en PBS y se colocaron de manera separada en una bolsa etiquetada con cierre de cremallera. Los aspirados de médula ósea se mantuvieron en hielo. Preparación de los aspirados de médulas ósea para ensayo de UFC Se dispusieron alícuotas de los aspirados de médula ósea procedentes de los húmeros, los fémures y las crestas ilíacas izquierdos y derechos de cada perro, obtenidos para análisis de PCR, en distintos tubos de ml, etiquetados. Las muestras de médula ósea se mantuvieron en hielo. Ensayo de UFC con cmsc procedentes de médula ósea obtenida en la necropsia Los ensayos de colonias de UFC realizados con cmsc obtenidas de médula ósea obtenida en la necropsia se prepararon cultivando en placa 0, x 6 células, por triplicado, en placas de 0 mm que contenían medios completos. Las placas se incubaron a 37ºC y con un % de CO 2. Se sustituyeron los medios por medios nuevos cada 2-4 días. En el día de cultivo, se aclararon las placas de ensayo de UFC con HBSS dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 1% durante minutos, se aclararon dos veces con HBSS y se secaron al aire. Después, se tiñeron las cmsc en las placas con cristal violeta al 0,1%, se aclararon con agua desionizada tres veces y se secaron al aire. Se contaron las colonias para calcular el número de colonias por 6 células cultivadas en placa. Aislamiento y purificación del ADN Se aisló el ADN procedente de una parte de cada tejido. La pieza restante de la muestra se crioconservó y se almacenó en el congelador a -70ºC. Se aisló el ADN colocando las muestras en solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadiendo disolución de proteinasa K e incubando a ºC durante 3 horas o hasta que el tejido se hubo disuelto. Se trataron posteriormente las muestras con ARNasa a 37ºC durante min. Se enfriaron las muestras hasta temperatura ambiente y se precipitó la proteína. Se centrifugaron las muestras y se recogió suavemente la fase acuosa en isopropanol al 0%. Se mezclaron y centrifugaron las muestras y se lavó el sedimento con etanol al 70%. Se centrifugaron los tubos y se eliminó el sobrenadante mediante drenaje y se dejaron secar los sedimentos durante aproximadamente de 1 a 6 horas. Se dejó que el ADN se hidratara durante la noche a temperatura ambiente y se almacenó posteriormente a 4ºC. Primero se lisaron las muestras de sangre periférica y de médula ósea con disolución de lisis de eritrocitos (tampón de cloruro de amonio). Después, se aisló el ADN de los lisados tal como se describió anteriormente. Se cuantificó el ADN mediante la adición de 998 µl de H 2 O desionizada y 2 µl de ADN de la muestra en una cubeta y se agitó en vórtex. Se usó un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (DO). Se leyó la DO a 2 y 280 y la concentración de ADN se calculó para µg/ml. Se ajustó la concentración de ADN hasta 1 µg/ml usando agua desionizada. PCR-ELISA de ADN anti-egfp El ensayo de PCR-ELISA de ADN anti-egfp usado en estos estudios detecta cmsc infundidas utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para GFP. Para el análisis de la expresión génica, se utilizó un kit de PCR-ELISA (marcado con DIG / detección) (Boehringer Mannheim). De forma breve, se realizó una PCR en presencia de nucleótidos marcados con digoxigenina para marcar el producto amplificado. A continuación, se desnaturalizaron µl del producto de PCR y se dejó que se hibridara en disolución con una sonda oligonucleotídica biotinilada en a 37ºC, en una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. El producto de PCR - sonda unida se detectó mediante un conjugado de peroxidasa anti-digoxigenina y usando el sustrato colorimétrico 2,2 -azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolin-sulfónico) (ABTS). Se generaron curvas patrón de titulación usando cmsc control transfectadas para aproximarse a la concentración de ADN por cantidad de ADN utilizado en el ensayo. Estableciendo en primer lugar una correlación con un patrón interno para PCR del ADN genómico de clase II de DLA y después la correlación de la concentración de ADN con los equivalentes celulares y suponiendo un acontecimiento de integración de retrovirus por célula transducida, puede obtenerse una estimación del número de células. En todas las biopsias / muestras de médula ósea, se indicaron las mediciones cuantitativas de ADN para GFP. Recuperación de las células sanguíneas tras el trasplante El día medio hasta alcanzar un umbral (hasta 3 valores consecutivos) de plaquetas, hasta.000/mm 3 fue de 12,8 (intervalo de 11-17), hasta 0.000/mm 3 fue de 19,8 (intervalo de 16 - ) y hasta 0.00/mm 3 de 23,0 (intervalo de - 27). El día medio hasta alcanzar un valor umbral (hasta 3 días consecutivos) de neutrófilos absolutos, hasta 00/mm 3 fue de 9,3 (intervalo de 8-11) y hasta 1.000/mm 3 fue de, (intervalo de 9-13). Aspirados de médula ósea intermedios Cuando las plaquetas se recuperaron sistemáticamente hasta valores superiores a por mm 3, se recogió un aspirado de médula ósea intermedio de la cresta ilíaca. Este procedimiento se realizó en el día 27 del estudio para CAN y CAN y en el día 29 para CAN y CAN Resultados Tras la evaluación histopatológica de todos los tejidos de CAN y CAN-07-02, sometidos a eutanasia en el día 43, los hallazgos fueron negativos para el tejido conjuntivo ectópico y para EICH subaguda. Pudo encontrarse una señal de ADN detectable en el plazo de 1 hora desde la infusión y de nuevo a los 2 días. A los 3 días después de la infusión, una muestra pudo medirse cuantitativamente para determinar el ADN de GFP. Este punto de tiempo es coherente con

15 27 ES T3 28 las observaciones previas en el estudio de autotrasplante de perro, en el que la señal se encontró en los días 2 y 3. Los datos de la necropsia del día 0 en CAN y CAN para células GFP+ mostraron una señal de GFP (1 equivalente de células GFP+ por microgramos de ADN de entrada de PCR) en el fémur y el húmero de CAN y en el húmero de CAN Estos resultados demuestran que las MSC alogénicas pueden soportar el injerto rápido de células hematopoyéticas de médula ósea. No se necesitó ningún soporte de transfusión. No hubo pruebas clínicas de EICH. La recuperación de las plaquetas fue más rápida que en los controles históricos. Hubo pruebas de quimerismo en las células del estroma tras el alotrasplante. La opción de injertar tejido alogénico usando MSC alogénicas amplia el intervalo de material de trasplante que puede usarse en las situaciones de trasplante clínico

16 29 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Uso de células madre mesenquimatosas alogénicas para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o reparar tejido mesenquimatoso dañado en un paciente, en el que dichas células madre mesenquimatosas alogénicas se han obtenido de un donante humano y en el que no se emplea una etapa de determinación de la compatibilidad del MHC de un donante humano con un paciente antes de la administración de dicha composición farmacéutica a un paciente. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición es para la osteogénesis. 3. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición es para potenciar el injerto de células progenitoras o madre hematopoyéticas en un individuo que lo necesita. 4. Uso según la reivindicación 1, en el que las células madre mesenquimatosas pueden expresar material genético exógeno incorporado.. Uso de células madre mesenquimatosas alogénicas según la reivindicación 1, en el que dicho tejido mesenquimatoso es tejido conjuntivo. 6. Uso según la reivindicación 1, en el que las células mesenquimatosas humanas alogénicas se han recuperado a partir de médula ósea humana y se formulan en una preparación celular que está sustancialmente libre de células sanguíneas. 7. Uso según la reivindicación 6, en el que la preparación celular se formula para administrarse junto con un vehículo para la preparación celular. 8. Uso según la reivindicación, en el que las células madre mesenquimatosas pueden generar formación ósea. 9. Uso según la reivindicación, en el que el tejido conjuntivo es hueso.. Uso según la reivindicación, en el que el tejido conjuntivo es cartílago Uso según la reivindicación 1, en el que el tejido mesenquimatoso es tejido esquelético. 12. Uso según la reivindicación, en el que la composición farmacéutica es para el crecimiento del estroma. 13. Uso según la reivindicación, en el que la composición farmacéutica se formula para administrarse sistémicamente. 14. Uso según la reivindicación, en el que la composición farmacéutica se formula para administrarse por vía intravenosa.. Uso según la reivindicación, en el que las células madre mesenquimatosas humanas expresan material genético exógeno incorporado. 16. Uso según la reivindicación, en el que el crecimiento tisular es injerto de célula progenitora o madre hematopoyética. 17. Uso según la reivindicación 16, en el que las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas se han recuperado de médula ósea humana y se formulan en una preparación celular que está sustancialmente libre de células sanguíneas. 18. Uso según la reivindicación 17, en el que la preparación celular se formula para administrarse junto con un vehículo para la preparación celular. 19. Uso según la reivindicación 16, en el que la composición farmacéutica se formula para administrarse sistémicamente.. Uso según la reivindicación 16, en el que la composición farmacéutica se formula para administrarse por vía intravenosa. 21. Uso según la reivindicación 16, en el que las células madre mesenquimatosas humanas alogénicas expresan material genético exógeno incorporado. 22. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho tejido mesenquimatoso dañado es una enfermedad degenerativa muscular. 23. Uso según la reivindicación, en el que dicho tejido conjuntivo es músculo

17 ES T3 17

18 18 ES T3

19 ES T3 19

20 ES T3

11 Número de publicación: 2 208 435. 51 Int. Cl. 7 : A61K 31/255. 72 Inventor/es: Baumgart, Joachim. 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

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