Rejuvenecimiento cutáneo facial con materiales autólogos

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1 Rejuvenecimiento cutáneo facial con materiales autólogos Universidad Autónoma de Barcelona Tesis para optar por el título de Máster en Medicina Cirugía-Cosmética y del Envejecimiento

2 Rejuvenecimiento cutáneo facial con materiales autólogos Autor: Iliana Acosta Licenciada en Medicina Especialista en Medicina Familiar y Comunitaria Diplomado en Bases Clínicas en Medicina y Cirugía Cosmética Diplomado en Medicina del Envejecimiento Didie Potdevin Licenciada en Medicina Licenciado en Dermatología - Cosmética Diplomado en Bases Clínicas en Medicina y Cirugía Cosmética Diplomado en Medicina del Envejecimiento

3 Exergo El espiral de vida, Distensión y fluidez, búsqueda de verticalidad, misterio de la vida. La arquitectura de nuestro citoesqueleto, se debe en particular a un doble espiral, pero también a fuerzas extrañas que nos mantienen en un estado de equilibrio y coherencia en un punto medio entre la teoría de la relatividad y la física cuántica. El misterio de la vida se encuentra quizá en el espacio que separa la materia, como los espacios blancos entre las palabras, y la vida resuena entre las notas del universo. Dr: Didier Potdevin

4 Iliana Acosta Didie Potdevin Rejuvenecimiento cutáneo facial con materiales autólogos

5 Colaboradores Plinio R. Hurtado MD, PhD. Renal Unit. Royal Adelaida Hospital. Australia. Equipo de Ingeniería Química. Departamento de Biofísica. Laboratorio ISDIN. Barcelona. España. Equipo Técnico del Instituto de Foto-Medicina Clínica Teknon. Barcelona. España. Alejandra Pérez Bonilla, PhD. Universidad Politécnica de Cataluña. Departamento de Estadística e Investigación Operativa. Barcelona. España. Agradecimientos Agradecemos infinitamente a los pacientes ya que sin ellos no hubiera sido posible realizar la investigación. A la Licenciada Samia Moussa, por dedicar parte de su tiempo libre a nuestra investigación

6 Iliana Acosta Didie Potdevin Rejuvenecimiento cutáneo facial con materiales autólogos Con 13 figuras, 22 imágenes fotográficas, 64 imágenes ultrasónicas, 70 tablas de frecuencia, 48 gráficos, 7 histogramas, 3 boxplot

7 Abreviaturas AH APP APF ATP Ca EGF FGF HGF HTA IGF IFN IL KGF MM PRP PMN RMN SNG SPSS TAC TNF TGF TIMP VLDL VEGF ácido hialurónico antecedentes patológicos personales antecedentes patológicos familiares trifosfato de adenosina calcio factor de crecimiento epidérmico factor de crecimiento del fibroblasto factor de crecimiento hepatocitario hipertensión arterial factor de crecimiento tipo insulina interferón interluquinas factor de crecimiento queratinocitico milímetros plasma rico en plaquetas polimorfonucleares resonancia magnética nuclear surco naso geniano stantistical package for the social science tomografia axial computarizada factor de necrosis tumoral factor de crecimiento transformador inhibidor tisular de metaloproteínas de la matriz lipoproteínas de baja densidad factor de crecimiento del endotelio vascular

8 Índice 1-Resumen 9 2-Introducción 10 3-Sustancias autólogas utilizadas: semisólida, liquida, gel Impacto del trasplante de tejido adiposo en la medicina estética-cosmética 21 5-Plaquetas y reparación tisular Polivalencia de los factores de crecimiento autólogos.24 7-Liberacion y mecanismo de acción de los factores de crecimiento 25 8-Factores de crecimiento implicados en los procesos tisulares 26 9-Trombina, cinética de liberación de los factores de crecimiento Materiales autólogos, carcinogénesis Técnicas para obtener material autólogo (PRP, tejido adiposo, trombina) Objetivos de la investigación Material y método Analisis estadísticos Resultados Discusión Conclusiones Recomendaciones Bibliografia Anexos

9 RESUMEN Introducción: El hombre como fuente de obtención de materia curativa para el propio hombre, cada día se desarrolla con más ímpetu; constituyen una fuente de materia prima para la realización autotrasplante o trasplante de células para curar enfermedades, y su uso se ha extendido a ramas más allá de la medicina convencional. En nuestro trabajo hemos utilizado como materia prima sustancias autólogas, como es el caso del plasma rico en plaquetas (PRP), la trombina autóloga y el tejido adiposo. En desventaja se encuentran los materiales sintéticos utilizados en diferentes ramas de la medicina, a pesar de los logros obtenidos con su utilización, aún su uso no está exento de riesgos. Objetivo: Evaluar la efectividad terapéutica del uso de los materiales autólogos a nivel de la piel con fines cosméticos. Material y Método: En el procedimiento utilizamos tres sustancias autólogas: tejido adiposo, plasma rico en plaquetas (PRP) y trombina autóloga. En este estudio hacemos la reproducción del seguimiento de 32 pacientes durante dos años, para valorar efectividad y posibles efectos indeseables de los materiales autólogos. Los parámetros de la piel, tales como, extensibilidad, elasticidad e hidratación, fueron mensurados antes y después del tratamiento, mediante el uso de DermaLab Combo dispositivo que aúna el Dermascan C (ecógrafo de ultrasonidos de alta resolución) y un cutómetro en una misma interfaz. La medición de la hidratación de la piel se llevo a cabo con el corneómetro MPA 580.Con la ultrasonografía de alta resolución obtuvimos mayor información a cambio de una menor penetración de la señal. Para este estudio se utilizó la sonda de 25MHz, por ser un estándar de facto y por poseer una penetración de entre 6 y 12 mm. Los datos cuantitativos se obtuvieron a través de una estadística descriptiva de variables, test de hipótesis mediante prueba no paramétrica de normalidad y de variables de diferenciación, test de Student y correlación de Person. Los datos fueron procesados mediante el sistema Statistical Package for the Social Science (S.P.S.S) versión 15. Resultados: La extensibilidad de la piel varia a partir de 0,4931 mm a 0,4187mm, elasticidad de la piel a partir de 0,3699 ad a 0,4500 ad y la hidratación de la piel varía a partir de 68,0281 ua a 71,8531ua, alcanzando diferencia estadística. Conclusiones: Los materiales autólogos son una alternativa posible y segura si lo comparamos con los materiales sintéticos, ya que se obtienen mejores resultados, y se evita el riesgo de rechazo PALABRAS CLAVE: Plasma rico en plaquetas (PRP), Trombina autóloga, Tejido Adiposo, Rejuvenecimiento cutáneo facial. 9

10 INTRODUCCION El hombre como fuente de obtención de materia curativa para el propio hombre, cada día se desarrolla con más ímpetu. Su obtención es diversa, entre las que destaca la alogénica, autóloga y los alotrasplantes. Entre estas fuentes de materia podemos mencionar el trasplante de médula ósea, hemoderivados, trasplante de células de cordón umbilical, trasplante de órganos, trasplante de tejido adiposo, entre otros. Desde el año 1989 se utiliza con gran éxito, células obtenidas de la sangre con diferentes fines terapéuticos, dada su capacidad para regenerar tejido hematopoyético, epitelial, endotelial y nervios; existiendo evidencia científica in vitro y en in vivo (1) (2). El tejido sanguíneo, constituye una fuente para autotrasplante o trasplante de células para curar enfermedades graves, tratar anemias severas, tumores cerebrales, tumor de Ewing, leucemias, entre otras. El uso de materiales obtenidos del propio hombre, ya sea en cualquiera de sus formas antes mencionadas, constituyen una potente modalidad de tratamiento curativo en diversos desordenes genéticos, hematológicos, oncológicos e inmunológicos. Las células obtenidas a partir de la sangre, son candidatas a ser utilizadas en el futuro para el tratamiento de una gran diversidad de enfermedades, incluyendo cardiovasculares, oftalmológicos, ortopédicas, neurológicas y endocrinas (3) (4) (5). Dada su insustituible fuente de beneficios para el hombre, su uso se ha extendido a ramas más allá de la medicina curativa, como es el uso del plasma rico en plaquetas (PRP) en la medicina estética cosmética, donde el donante y el receptor es el mismo paciente, constituyendo un material autólogo. El PRP es una fuente fiable de obtención de células para regenerar tejidos, con una fácil disponibilidad a corto plazo; es un material inocuo, bio-compatible 100%, con mínima posibilidad de rechazo. Actúa como bio-estimulador y mediador biológico contra el envejecimiento celular, restaura y repara tejidos con propiedades indistinguibles al tejido original, es de fácil aplicación a 10

11 través de métodos terapéuticos mínimamente invasivo, además permiten conservar la armonía y fisiología de la estructura tisular propia del paciente, lo cual nunca podrá ser superado por sustancias sintéticas, ni métodos quirúrgicos invasivos. En desventaja se encuentran los materiales sintéticos utilizados en diferentes ramas de la medicina. En la medicina estética-cosmética son utilizados como sustancias de relleno. A pesar de los logros obtenidos en la utilización de los materiales sintéticos, su uso aun no es un procedimiento libre de riesgo (6) (7). Nuestro trabajo tiene dos propósitos fundamentales, el primero es demostrar que el hombre puede ser una fuente de obtención de materia prima y la importancia de su utilización en la medicina; el segundo es presentar nuestra experiencia a lo largo de dos años, con un seguimiento de resultados antes y después del procedimiento médico, incluyendo estudios cuantitativos, cualitativos y de observación, así como el grado de satisfacción del paciente. Hemos aplicado técnicas propias. En el caso del tejido adiposo no se realizo purificación, centrifugación ni decantación. Utilizamos exclusivamente materiales autólogos, en forma tejido celular subcutáneo superficial y profundo con todo su estroma vascular; además hemos utilizado plasma rico en plaquetas (PRP) y trombina autóloga. Las células de tejido adiposo autólogo para el implante, se obtuvieron del tejido celular subcutánea de la zona infraumbilical, trocanterica y rodillas, ya que en estas zonas se localizan las células madres del tejido adiposo. En nuestro estudio preferimos la zona trocanterica para el sexo femenino y la infraumbilical para el sexo masculino, el plasma rico en plaquetas (PRP) y la trombina autóloga, fueron obtenidos de la sangre del propio paciente, no considerándose un hemoderivado, ya que se extraen de la sangre células vivas, que serán inyectadas espontáneamente después de una centrifugación. 11

12 SUSTANCIAS AUTOLOGAS UTILIZADAS -Tejido adiposo (sustancia semisólida) -Plasma rico en plaquetas (PRP) (sustancia liquida) -Trombina autóloga (gel) 1-Tejido adiposo El tejido adiposo es un tejido conectivo, formado por células del propio tejido (adipocitos) especializados en el acumulo de grasas y un estroma de tejido conjuntivo reticular. Aunque el origen del tejido adiposo no es totalmente conocido, sabemos que el mesodermo (lámina intermedia del disco embrionario) da origen a las células mesenquimáticas y estas al tejido adiposo. Su origen embrionario las define en células pluripotentes, con capacidad para diferenciarse en células omnipotentes de varios tipos celulares, tales como adipocitos, condorcitos, osteoblastos y miocitos. Los procesos celulares que llevan a la conversión de las células pluripotentes en adipocitos omnipotentes aun están en estudio. Figura 1: Adipogénesis 12

13 El tejido adiposo se encuentra distribuido en distintas localizaciones del organismo, encontrándose principalmente a escala dérmica, subcutánea, mediastínica, mesentérica, peri gonadal, perirrenal y retroperitoneal. En los vertebrados se distinguen dos grandes tipos de tejido adiposo, el blanco y el pardo o marrón. Ambos no presentan diferencias únicas y exclusivas en cuanto a coloración, sino también en cuanto a su morfología, distribución, genes y función. Tejido adiposo plurilocular (pardo): Este tipo de tejido es el menos estudiado de los tejidos adiposos. Su elevada cantidad de citocromos le dan el color pardo, está especializado en la producción de calor y juega un importante papel fisiológico en los animales que hibernan. En la especie humana este tejido sólo es significativo en recién nacidos, en el que ejerce una función termorreguladora. Aparentemente no se visualiza neo formación de este tejido adiposo después del nacimiento, ni tampoco transformación de un tipo adiposo en otro. Las células mesenquimatosas que van a formar el tejido pardo, se vuelven epiteloides, tomando aspecto de glándula endocrina cordonal antes de acumular grasa. Su distribución corporal es restringida, se localiza fundamentalmente subscapular, axilar, nuca, a lo largo de los grandes vasos y en pequeños paquetes intercostales. Está formado por adipocitos pluriloculares con abundantes mitocondrias que expresan altas cantidades de proteína desacoplante, la cual es responsable de la actividad termo-génica de este tejido. Almacena la grasa en forma de múltiples y pequeñas gotas distribuidas por todo el citoplasma en las células del tejido adiposo (adipocitos).a pesar de existir escasamente en nuestro cuerpo, estudios recientes señalan que alteraciones en la capacidad termo génica del tejido adiposo trae desordenes endocrinos metabólicos relevantes, cambios en el gen que codifica los receptores adrenérgicos ß, encargados de activar la termogenina, sustancia que 13

14 provoca que la energía producida a nivel mitocondrial no se acumule en forma de ATP y se disipe en forma de calor (8) (9). Figura 2: Características histológicas del tejido adiposo pardo. Tomado de Junqueira, Luis y José Carneiro. Histología Básica: Texto y atlas color.6 ta Ed. Barcelona. España. Editorial Elsevier, El tejido adiposo pardo está constituido por células poligonales de tamaño mediano (30-60 µm). - con citoplasma abundante y granuloso, contiene pequeñas gotas de grasas de diferentes tamaños, existen abundantes mitocondrias que expresan proteínas desacoplante termogenina, retículo endoplásmico rugoso y liso, Golgi, glucógeno; el citocromo presente en la mitocondria le confiere el color pardo-marrón al tejido. - núcleo redondeado con ubicación excéntrica y contiene gránulos de cromatina grumosa. - numerosos inclusiones (gotas) lipídicas pequeñas. -lámina basal (peri celular). -estroma de tejido conjuntivo reticular. -muy vascularizado: 1 adipocito / 2 capilares sanguíneos. -inervación del sistema nervioso autónomo simpática directa a cada adipocito. 14

15 Composición química del tejido adiposo pardo.triglicéridos en poca cantidad. Tejido adiposo pardo como órgano regulador de temperatura -Termogénesis.la termogénesis depende de una proteína mitocondrial..termoprotección de los neonatos en mamíferos..hibernación..eliminación de energía sobrante. -Termogenina.la termogenina una proteína desacoplante de origen mitocondrial..canal de protones de la membrana interna mitocondrial (desacoplante de la fosforilación oxidativa. Tejido adiposo unílocular (blanco): La formación de tejido adiposo blanco comienza antes del nacimiento, aunque la cronología de aparición varía de unas especies a otras. La mayor expansión del mismo tiene lugar rápidamente tras el nacimiento. Pero el desarrollo es un proceso continuo a lo largo de toda la vida. Una vez que el tejido adiposo está completamente formado, los adipocitos representan uno y dos tercios del mismo. El resto del tejido adiposo está constituido por células endoteliales, perioditos y precursores de adipocitos con distintos grados de diferenciación, fundamentalmente fibroblastos, aunque también aparecen preadipocitos (células intersticiales o vacías de lípidos), células mesenquimales pobremente diferenciadas (poseen gotas de lípidos) y células grasas muy pequeñas (10).Esta formado por adipocitos uniloculares; funciona como almacén energético y regulación de la energía disponible para el organismo (liposíntesis y lipólisis), regula el apetito, protección mecánica (almohadillas plantares, grasa retroperitoneal), aislamiento térmico (panículo adiposo) y morfología corporal carácter 15

16 sexual secundario. Almacena la grasa en el adipocito, en forma de una gran gota que llena el citoplasma casi en su totalidad, desplazando al núcleo hacia la periferia de la célula (8). Figura 3: Características histológicas del tejido adiposo blanco Tomado de Junqueira, Luis y José Carneiro. Histología Básica: Texto y atlas color.6 ta Ed. Barcelona. España.Editorial Elsevier, adipocitos grandes ( µm) -núcleo marginado, poco visible. -pocas y grandes inclusiones (gotas) lípidicas. -lámina basal (pericelular). -escaso citoplasma con retículo endoplásmico rugoso y liso, Golgi, glucógeno. -estroma de tejido conjuntivo reticular.muy vascularizado: 1 adipocito / 1 capilar sanguíneo..innervación perivascular simpático. Composición química del tejido adiposo blanco -Triglicéridos (90%) 16

17 -Ácidos grasos libres -Colesterol -Fosfolípidos -Lipocromos (carotenos, xantinas ) Tejido adiposo blanco como órgano de almacenamiento de energía -Lipogénesis: El tejido adiposo blanco es el mayor reservorio energético del organismo, la energía es almacenada en las células grasas en forma de triglicéridos. La principal fuente de triglicéridos de los adipocitos procede de los quilomicrones y las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) circulantes. Los triglicéridos de estas lipoproteínas son hidrolizados hasta ácidos grasos libres. El termino lipogénesis designa la formación de ácidos grasos a partir de algún precursor derivado del adipocito, por ejemplo la glucosa (11). -Lipólisis: Durante la lipólisis los triglicéridos almacenados en el tejido adiposo son hidrolizados hasta ácidos grasos y glicerol (12). El tejido adiposo blanco como órgano secretor El tejido adiposo blanco es un productor de ciertas sustancias con acción endocrina, paracrina y autocrina. En este grupo de sustancias secretadas se encuentran moléculas implicadas en la regulación del peso corporal (leptina), sustancias relacionadas con el sistema inmune (TNFa, IL-1, IL-6), la función vascular (angiotensina e inhibidores del activador del plasminógeno tipo 1), el desarrollo de resistencia a la insulina (resistina) y la función reproductora (estrógenos), entre otras. -Leptina: Es una hormona segregada principalmente por los adipocitos, juega un importante papel en la regulación del peso corporal a través de sus efectos sobre el sistema nervioso central inhibiendo el apetito y periféricos sobre el gasto energético (13). 17

18 -Citoquinas (TNFa, IL-1, IL-6): Estas moléculas multifuncionales son producidas por muchos tipos celulares incluidos los adipocitos. Respecto a la función que lleva a cabo estas citoquinas secretadas por el tejido adiposo, se ha sugerido una acción paracrina o autocrina en el propio tejido adiposo. Los niveles del TNFa en el tejido adiposo están correlacionados positivamente con el tamaño de los depósitos adiposos. Los niveles altos de TNFa en el tejido adiposo podrían estar implicados en el desarrollo de algunas alteraciones metabólicas tales como resistencia a la insulina. En este sentido, se ha demostrado que el TNFa inhibe la captación de glucosa dependiente de insulina ya que interfiere con la ruta de señalización de la misma. El papel en el ámbito fisiológico general que pudieran tener estas citoquinas secretadas por el tejido adiposo no está claro (14). -Resistina: Es secretada por adipocitos maduros y que se ha postulado podría ser el enlace entre la obesidad y el desarrollo de resistencia a la insulina, sin embargo otros estudios revelan que la expresión de resistencia en tejido adiposo está severamente disminuido en la obesidad (15). -Adipsina/ASP: (Acylation Stimulating Protein) es una proteína sérica relativamente pequeña, que interviene en la regulación de los ácidos grasos procedentes de la acción de la lipoproteína lipasa, son aceptados por los adipocitos y posteriormente convertidos en triglicéridos. La ASP se genera a través de la interacción de un complejo de proteínas entre las cuales se incluye la Adipsina, de ahí que el sistema se denomine Adipsina/ASP (15). -Acrp 30/Adipo Q/ Adiponectina (Adipocyte Complement Related Protein), es una proteína expresada exclusivamente para adipocitos diferenciados. Se ha observado que sus niveles de ARNm están disminuidos en humanos obesos (15). 18

19 -Sistema renina-angiotensina: El angiotensinógeno puede jugar un papel importante en la regulación del aporte sanguíneo al tejido adiposo y el flujo de ácidos grasos desde el mismo. Además se ha observado que la expresión génica de angiotensinógeno está aumentada en humanos obesos. La angiotensina II posee un efecto estimulante sobre la diferenciación del tejido adiposo y parece estar implicado en la regulación de la adiposidad debido a su acción lipogénica (16). Además debemos señalar que el tejido adiposo blanco produce una gran cantidad de moléculas multifuncionales, denominadas adipocinas, están modulan la inflamación crónica, bajo el grado que acompaña la obesidad, entre las que podemos mencionar la adiponectina, apelina, chemerina, factor tisular, hepcidina, factor de crecimiento de hepatocitos, Il-6, leptina, lipocalina-2, proteínas quimio atrayentes de monocitos, omentina, osteopontina, inhibidor del activador de plasminogeno, retinol binding protein, amiloide sérico, factor transformador de crecimiento β, factor de necrosis tumoral α, trombospondina 1, vaspina, visfatina (12). El tejido adiposo tiene la capacidad de expandirse o contraerse según los parámetros nutritivos, para ello requiere del estroma vascular o tejido conjuntivo reticular, que le da soporte, vascularización e inervación. La fracción de tejido adiposo correspondiente a estroma vascular contiene el nicho de células madre tisular, capaz de crear un tipo especial de células o pericitos que rodean los vasos capilares más pequeños (17). 2-Plasma rico en plaquetas (PRP) En línea general cuando hablamos bioquímicamente de un plasma, estamos en presencia de suero, leucocitos, plaquetas y factores de crecimiento. El sistema para la obtención de proteínas plaquetarias y plasmáticas, no es más que proteínas autólogas, que se obtienen de la sangre del propio paciente momentos antes de su utilización terapéutica, mediante aféresis y centrifugación; se prepara a partir de un determinado volumen de (PRP). Según el criterio 19

20 de los hematólogos un plasma rico en plaquetas (PRP) es aquel que contiene más de plaquetas/ul, pudiera hablarse de una concentración de plaquetas ocho veces más, en comparación con la concentración de plaquetas en sangre total. La técnica para la obtención del PRP hace que este contenga la menor cantidad posible de leucocitos. El PRP contiene factores de crecimiento tanto de origen plaquetarios como plasmáticos; implicados en los mecanismos de reparación y regeneración tisular, también contiene proteínas plasmáticas adhesivas como la fibrina, fibronectina, vitronectina, entre otras (18) (19). 3-Trombina humana. La trombina es una glicoproteína, formada por dos cadenas polipeptídicas de 36 y 259 aminoácidos, unidas por un puente disulfuro. Figura 4: Diagrama de cascada de la trombina: Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter, (2):p

21 La trombina no es un constituyente de la sangre, sino que se genera a partir del precursor protrombina. Para que este proceso ocurra, interviene el calcio en las distintas etapas de la cascada de la coagulación; en la última etapa el complejo activado Xa/Va transforma la protrombina en trombina a través de una reacción catalizada por la enzima tromboplastina en presencia de iones de calcio (Ca2+). La trombina es la iniciadora de la formación de coágulo; es responsable de la formación de la red de fibrina en cuyos nudos se encuentran las plaquetas, leucocitos y macrófagos (18). IMPACTO DEL TRASPLANTE DE TEJIDO ADIPOSO EN LA MEDICINA ESTÉTICA-COSMÉTICA Cuando hablamos de tejido adiposo no podemos pasar por alto la existencia de su estroma vascular, en que se encuentra el nicho de células madres o también llamadas células tróncales; estas son un tipo especial de células indiferenciadas que tienen la capacidad de dividirse indefinidamente, sin perder sus propiedades y llegar a producir células especializadas. Existe una clasificación de células madres, estas pueden ser residentes, embrionarias o adultas. Se ha descrito la existencia de células madres adultas en diferentes tejidos (hematopoyético, neuronal, epidérmico, gastrointestinal, músculo esquelético, músculo cardíaco, hígado, páncreas, pulmón, tejido adiposo) (20).La primera propuesta de usar tejido adiposo autólogo como injerto fue expuesta por Neuber en 1893.La idea gano rápidamente entusiasmo. Posteriormente las primeras experiencias de trabajar con trasplante de tejido graso autólogo fue decepcionante, pero se albergaba la esperanza de que en un futuro se podría transferir con éxito. Muchos científicos han dedicado su tiempo a trabajar con el tejido graso, entre estos podemos mencionar a Guerrerosantos, Coleman y otros, demostrando que es posible con un cuidadoso procedimiento preservar la supervivencia del tejido graso. Actualmente este, se utiliza en la cirugía plástica y medicina estética-cosmética, en el remodelado de curvas y volúmenes, restauración mamaria, radio dermitis, cicatrices, 21

22 esclerodermia, síndrome Parry-Romberg, etcétera. Llegándose a obtener resultados muy alentadores tanto para el médico, como para los pacientes, ya que en algunos casos el trasplante de tejido graso autólogo ha logrado una supervivencia entre 4 y 8 años. En el caso de la medicina estética-cosmética se emplean técnicas que ofrecen múltiples ventajas, por la simplicidad del procedimiento, reproducibilidad, seguridad, eficacia, poco riesgo para el paciente, brindando soluciones paliativas interesantes. En la literatura se recogen múltiples ensayos realizados para tratar el tejido adiposo, los cuales describimos más adelante (21) (22) (23) (24) (25). PLAQUETAS Y REPARACIÓN TISULAR Las plaquetas han sido muy estudiadas por su papel en la hemostasia, donde desempeñan una función fisiológica muy importante, hoy sabemos que también son portadoras de proteínas con un papel importante en la reparación y regeneración tisular. Las plaquetas o trombocitos no son más que partículas ovoides, irregulares sin núcleo ni otros orgánulos, de superficie lisa, de unos 3 µm de diámetro; algunos autores las denominan células anucleadas y tienen una vida media de 7 a 10 días. Después de los eritrocitos son el elemento más abundante de la sangre, son propias de los mamíferos. Estas partículas tienen su origen en el tejido hematopoyético de la medula ósea, específicamente proceden de la fragmentación del citoplasma de los megacariocitos medulares circulantes en la sangre. Las plaquetas circulantes se encuentran en una interacción dinámica con los componentes del plasma, los demás elementos formes de la sangre y con el endotelio vascular, a través de las glicoproteínas de la membrana plaquetaria y diferentes mediadores químicos. Constan de una ultra estructura que le es propia, constituida por varias aberturas semejantes a una esponja, los cuales son conductos membranosos que se prolongan hacia el interior de la partícula. Después de una lesión se producen cambios que afectan su morfología y bioquímica activándolas. Una vez activadas se van destruyendo, y durante este proceso liberan 22

23 importantes sustancias coagulantes que conducen a la formación un tapón hemostático primario, hemostático secundario en cualquier solución de continuidad del endotelio vascular, siendo este el primer paso de la cicatrización, además de estar implicadas en la hemostasias por su función pro-coagulante, son fuente natural de varios factores de crecimiento involucrados en vigilar la continuidad de los vasos sanguíneos y en la reparación de tejidos. Actúan como vehículo de estos factores de crecimiento y los liberan en las zonas donde hay daño tisular. Todas estas funciones las pueden realizar, por la compleja estructura que poseen, la que consta de cuatro zonas (19) (26). -Zona periférica: glucocálix, membrana. -Zona estructural: micro túbulos, cito esqueleto submembranoso, actina, miosina. -Zona de organelas: cuerpo denso, lisosoma, gránulos alfa, mitocondrias. -Sistema de membrana: sistema canalicular abierto, sistema tubular denso. De la superestructura plaquetaria, en nuestro estudio centramos la atención la zona de organelas ya que en su interior se encuentran unos gránulos secretores especializados llamados gránulos alfa, que almacenan en su interior gran variedad de factores de crecimiento. Gránulos alfa: Son organelos esféricos de nm, sintetizados por el aparato de Golgi, ricos en macro-moléculas con una porción de alta densidad en electrones. Constituyen un 15% del volumen total de las células. Sus membranas contienen glicoproteínas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, fibrinógeno, trombospondín, P selectina, colagenasa, elastasa, inhibidores de la proteasa. Después de un estimulo fuerte los gránulos α se alargan y emiten seudópodos, se aproximan a la membrana plasmática (lo que es posible debido a la disolución del sistema canalicular abierto), se funden con la membrana, aumentan el volumen debido a la entrada de agua y esto propicia la liberación de su contenido al medio exterior en forma de factores de crecimiento. Entre otros se almacenan factor de crecimiento derivado 23

24 de plaquetas, factor de crecimiento transformador α (TGFα), factor de crecimiento hepatocitario/factor dispersador (HGF),factor de crecimiento de la célula endotelial vascular (isoformas A, B, C, D) (VEGF), factor de crecimiento del fibroblasto-1(acidito)-2(básico) y familia (FGF), factor de crecimiento queratinocítico (también denominado FGF-7) (KGF), factor de crecimiento de tipo insulina-1 (IGF-1), factor de necrosis tumoral (TNF), interluquinas (IL-1), interferones (IFN-α), factor de crecimiento epidérmico (EGF).Estas sustancias fueron sintetizadas por los megacariocito, ya que la plaqueta no contiene núcleo, ni lo elementos necesarios para la síntesis de proteínas. Por otra parte, durante su recorrido por el torrente sanguíneo la plaqueta capta proteínas plasmáticas que también almacena en el interior de sus gránulos. Contiene por tanto una compleja mezcla de proteínas, unas procedentes de su célula precursora, el megacariocito, y otras capturadas por endocitosis del torrente sanguíneo. Queda claro que cuando hablamos de plaquetas, estamos en presencia de una compleja estructura, sujeta a la influencia de una gran diversidad de factores, y saltan a la vista sus gránulos secretores α, y la liberación de una gran variedad de factores de crecimiento contenidos en su interior; siendo estos últimos los mediadores biológicos universales de nuestras células. Hace más de una década se habla sobre la utilización de proteínas plaquetarias autólogas en la cirugía oral y maxilofacial. Actualmente se han ido introduciendo en el mercado distintos sistemas de obtención y preparación de concentrados plaquetarios con fines terapéuticos en otras ramas de la medicina (18) (19) (27). POLIVALENCIA DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO Como fue mencionado anteriormente, en nuestro estudio además del tejido adiposo, utilizamos factores de crecimiento autólogos de origen plaquetario; estos pueden ser producidos y almacenados por diferentes células y tejidos, entre estos podemos mencionar plaquetas, fibroblastos, macrófagos, células endoteliales, monocitos, matriz ósea, riñón, glándulas salivares glándulas lagrimales, músculo liso, diversas células tumorales 24

25 etcétera; algunos de los cuales actúan en varios tipos celulares, y otros tienen dianas celulares restringidas. En el caso de las plaquetas, estas actúan como almacén de factores de crecimiento, concentrados en los gránulos secretores α. Los factores de crecimiento son proteínas con un papel clave dentro del complejo proceso bioestimulación, reparación y regeneración tisular. Su aplicación terapéutica estimula e inhiben los procesos biológicos de migración celular dirigida (quimio taxis), diferenciación y proliferación celular, inducción e inhibición de la angiogénesis. Cabe destacar la influencia de los factores de crecimiento sobre las células más comunes del tejido conectivo, ya que estos inducen a la proliferación de los fibroblasto. Estas células derivan de células primitivas mesenquimales y pluripotenciales, proporcionando una estructura entramada a múltiples tejidos, jugando un papel importante en la reparación y regeneración tisular ya que interviene en la síntesis de todas las fibras del tejido conectivo (reticulares, colágenos y elastina) y mantenimiento de la matriz extracelular del tejido de muchos animales (19) (25) (28) (29). LIBERACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO Cuando las plaquetas se activan, se inicia una cascada de señalizaciones que conduce a la reorganización del cito esqueleto de la plaqueta, la centralización de sus gránulos secretores y la exocitosis de moléculas pequeñas y proteínas procedentes de tres tipo de gránulos: gránulos densos, gránulos α y lisosomas. Los gránulos densos contienen moléculas pequeñas con adenosin trifosfato (ADP) y serotonina, factores protrombinicos, los lisosomas contienen enzimas de degradación, los gránulos α representan el lugar de almacenamiento de diversas proteínas y su liberación está dirigida por mecanismos moleculares precisos. La presencia de gránulos densos y gránulos α es la clave para pasar de la hemostasis a la fase de regeneración celular. Se ha observado que cuando se utiliza Ca2+ para inducir la activación de las plaquetas, la cinética de liberación de los 25

26 factores de crecimiento contenidos en los gránulos α es lenta, desarrollándose una cascada filológica(18) (19) (27). 1-Primera semana: se desarrolla el proceso de angiogénesis a nivel de los capilares, mediante la inducción de la mitosis en las células endoteliales. La continua secreción de TGF- ß favorece la proliferación del fibroblasto. Entre el quinto y séptimo día el PRP atrae los macrófagos y a partir de aquí los procesos regenerativos serán estimulados por los factores de crecimiento derivados de macrófagos. 2-Segunda y tercera semana: La actuación directa de los factores de crecimiento permite la mitogénesis celular y la angiogénesis. 3-Cuarta a sexta semana: Revascularización y regeneración celular. Desaparecen los macrófagos, iniciándose un proceso restitutivo, que pretende llevar a la normalidad el metabolismo y funcionamiento cutáneo. FACTORES DE CRECIMIENTO IMPLICADOS EN LOS PROCESOS TISULARES Figura 5: Agregado de plaquetas y gránulos α dentro de la estructura plaquetaria, degranulación plaquetaria. Tomado de PA Everts et al: Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur Surg Res 2007, 39:

27 A) Microscopia electrónica de un agregado de plaquetas y los gránulos alfa dentro de la estructura de las plaquetas. Magnificación X 7,000. B) Microscopia electrónica de plaquetas que han sido inducida a degranular. Las plaquetas dentro del círculo han perdido los gránulos y solo en algunas fuera del círculo aun se pueden observar los gránulos α. Figura 6: Microscopia electrónica de alta resolución. Agregado de plaquetas y gránulos α dentro de la estructura plaquetaria. Tomado por Acosta I, Hurtado P,

28 Figura 7: Microscopia electrónica a alta resolución de una plaqueta, donde se puede ver los gránulos α antes de inducir su activación. Tomado por Acosta I, Hurtado P,

29 Figura 8: Microscopia electrónica a alta resolución, que muestra plaquetas durante el proceso de activación como se describe en el material y método, donde se puede observar una plaqueta después de su degranulación, sin gránulos α. Tomado por Acosta I, Hurtado P, Existen factores de crecimiento propiamente dichos y factores de transformación. I) Factores de crecimiento de transformación (estimulador/inhibidor) a-factor de crecimiento transformador α (TGF α). Es un factor positivo que estimula la replicación celular..fuente: macrófagos, linfocitos T, queratinocitos y diversos tejidos. 29

30 .funciones: similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), estimula la replicación de hepatocitos y ciertas células epiteliales. b- Factor de crecimiento transformador ß (isoformas 1, 2, 3); otros miembros de la familia son proteínas morfogénicas de la medula (BMP) (TGF-ß). Es un factor negativo que inhibe de la mayoría de las células y leucocitos..fuente: plaquetas, fibroblastos, linfocitos T, macrófagos, células endoteliales, queratinocitos, células musculares lisas..funciones: quimiotáctico para los leucocitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, linfocitos, fibroblastos y células musculares lisas, estimula la síntesis de inhibidor tisular de la metaloproteínas de matriz ( TIMP), la migración de queratinocitos, la angiogénesis y la fibroplasia, inhibe la producción de metaloproteínas de matriz (MMP) y proliferación de queratinocitos; regula la expresión de integrina y otras citocinas; induce la producción de factor de crecimiento transformador ß (TGF-ß), está implicado en la regulación, reparación y regeneración tisular II) Factores de crecimiento propiamente dichos (tejido donde actúan) a-factor de crecimiento hepatocitario /factor dispersador (HGF)..fuente: células mesenquimales..funciones: aumenta la proliferación de células epiteliales y endoteliales y de hepatocito incrementando la motilidad celular. b- Factor de crecimiento de la célula endotelial vascular (isoformas A, B, C, D) (VEGF)..fuente: células mesenquimales..funciones: aumenta la permeabilidad vascular; mitógeno para células endoteliales. c-factor de crecimiento del fibroblasto-1(acidito)-2(básico) y familia (FGF)..fuente: macrófagos, mastocitos, linfocitos T, células endoteliales, fibroblastos y diversos tejidos. 30

31 .funciones: quimio táctico para fibroblastos; mitógeno para fibroblastos y queratinocitos; estimula la migración de queratinocitos, angiogénesis, contracción de la herida y depósitos de matriz. d- Factor de crecimiento queratinocitico (también denominado FGF-7) (KGF)..fuente: fibroblastos..función: estimula la migración de queratinocitos, proliferación y diferenciación. e-factor de crecimiento de tipo insulina-1 (IGF-1)..fuente: macrófagos, fibroblastos y otras células..función: estimula la síntesis de proteoglicanos sulfatados, colágenos, migración de queratinocitos y proliferación de fibroblastos; efectos endocrinos similares a la hormona del crecimiento. f- Factor de necrosis tumoral (TNF)..fuente: macrófagos, mastocitos, linfocitos T..funciones: activa los macrófagos; regula otras citoquinas; funciones múltiples. g- Interluquinas (IL-1 etc)..fuente: macrófagos, mastocitos, queratinocitos, linfocitos y diversos tejidos..funciones: muchas funciones, algunos ejemplos: quimio táctico para leucocitos polimorfonucleados (PMN) (IL-1) y fibroblastos (IL-4), estimulación de la síntesis de metaloproteinasas-1(mmp-1) (IL-1), angiogénesis (IL-8), síntesis de inhibidor tisular de la metaloproteínas de matriz (TIMP) (IL-6); regulación de otras citoquinas. h- Interferones (IFN-α etc)..fuente: linfocitos y fibroblastos.funciones: activan los macrófagos, inhiben la proliferación de fibroblastos y la síntesis de metaloproteínas de matiz (MMP), regulan otras citoquinas. i- Factor de crecimiento epidérmico (EGF). 31

32 .fuente: plaquetas, macrófagos, saliva, sudor, orina, leche, plasma, contenidos intestinales.funciones: mitógeno para queratinocitos y fibroblastos, estimula la migración de queratinocitos, formación de tejido de granulación y estimula la angiogénesis, estimula la quimio taxis del fibroblasto, activa la formación de matriz provisional, es sintetizado como precursor de aminoácidos, tiene efecto proapoptótico, intervienen en la síntesis de colágeno total. j- Factor de crecimiento derivado de plaquetas (isoformas A, B, C, D). El factor de crecimiento derivado de plaquetas se les denomino de esta forma por encontrarse por primera vez en las plaquetas, almacenados dentro de los gránulos α. Constituye una familia de proteínas estrechamente relacionadas, cada una de ellas con dos cadenas denominadas A y B. Las tres isoformas del (AA, AB, BB) son secretadas y biológicamente activas..fuente: plaquetas, macrófagos, células endoteliales, queratinocitos, células de músculo liso..función: quimio táctico para leucocitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, fibroblastos y células musculares lisas; activa (PMN) y fibroblastos; mitógeno para fibroblastos, células endoteliales, células mesenquimales y células musculares lisas; estimula la producción de metaloproteínas de matriz (MMP), fibronectina y acido hialurónico(ah); la quimio taxis de sus macrófagos estimula la angiogénesis; contracción y cicatrización de la herida; remodelado; inhibe la agregación plaquetaria; regula la expresión de la integrina, también participa en la activación de las células estrelladas hepáticas en los pasos iníciales de la fibrosis hepática, induce la producción de la matriz extracelular e inhiben la degradación de esta, facilitando la síntesis de colágeno tipo I. Siendo la matriz extracelular el elemento esencial para el medio de integración fisiológica de los tejidos, de naturaleza bioquímica de alta complejidad, en la que están inmersas las células del sistema del medio intersticial (intercelular), cumpliendo funciones vitales, como la de rellenar los intersticios, confiere 32

33 resistencia mecánica a los tejidos, constituye el medio homeostático, nutrición y metabolismo celular, y promueve la fijación para el anclaje celular; constituyendo el medio táctico para el transito celular, e interviene en la comunicación celular (endocrina, paracrina. autocrina, yuxtacrina, nerviosa), e interviene en la síntesis de colágeno, elastina y ácido hialurónico. Los factores de crecimiento de origen plaquetario son los iniciadores universales de casi todos los procesos de regeneración y restauración celular en la zona receptora, permitiéndole una dimensión suplementaria a los trasplantes, en este caso al de tejido graso, garantizando una mejor aceptación y supervivencia de estas, además mejorando la calidad de la piel, permitiendo una mayor estimulación y regeneración tisular (19) (30) (31) (32). TROMBINA, CINETICA DE LIBERACIÓN DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO La trombina además de ser la iniciadora de la formación de coágulo y responsable de la formación de la red de fibrina en cuyos nudos se encuentran las plaquetas, leucocitos y macrófagos, desempeña otras múltiples funciones, entre estas está la de estimular a los gránulos secretores α contenidos en el interior de la plaqueta; intervenir en la síntesis, expresión y liberación de proteínas de las células endoteliales especialmente los factores de crecimiento derivados de plaquetas, el factor XIII, factor VIII, y el factor activante de plaquetas, todos ellos capaces de modificar las interacciones entre las células endoteliales y las células subyacentes; aumenta la expresión de glicoproteínas de adhesión de la membrana celular endotelial lo que favorece a la fijación de factores de la inflamación al endotelio; induce la quimio taxis en los neutrófilos; además la trombina es un potente quimiotáxico para los macrófagos en los que altera la producción de citoquinas y metabolitos del ácido araquidónico. Cuando queremos lograr una secreción rápida e instantánea (1-2 minutos) de los factores de crecimiento de origen plaquetario utilizamos trombina endógena; por el contrario la activación con calcio provoca una liberación lenta de los factores de crecimiento, 33

34 la cual ocurre después de haber transcurrido una hora después de la activación en el 90-95% de los casos (18) (19) (27) (33). MATERIALES AUTOLOGOS /CARCINOGÉNESIS Hay que tener presente que las células normales solo son capaces de proliferar un número determinado de veces, hasta llegar a un límite máximo (limite Hayflick) a partir del cual la célula sufre una serie de cambios bioquímicos entrando en senescencia. La célula que adquiere la habilidad de proliferar ilimitadamente se denomina inmortalidad celular y esto se considerado un proceso importante hacia la transformación maligna de las células normales. Los mecanismos de control celular (genes supresores y proapoptoticos) van a evitar que la célula sobrepase ese límite y entre en dos posibles etapas, apoptosis o senescencia/ diferenciación terminal. Teniendo presente esta base científica, se ha relacionado la sobreexpresión de los factores de crecimiento y sus receptores en tejidos tumorales y displasias; es decir la existencia de una posible relación de estos con la carcinogénesis y la vía mitogena que utilizan los factores de crecimiento. Sin embargo los autores que han empleado ampliamente el plasma rico en plaquetas (PRP) en diferentes ramas de la medicina, aseguran que no existe riesgo de infecciones o transmisiones de enfermedades, niegan la existencia de efectos indeseables; y hasta la fecha de hoy no existe evidencia científica que demuestre transformación carcinomatosa de tejido normal o displásico. Pero no pasamos por alto las hipótesis, sospechas, e indicios que establecen la posible relación de la aplicación del plasma rico en plaquetas (PRP) y la carcinogénesis y teniendo en cuenta cierta semejanza en mecanismo bioquímicas, consideramos tomar como apropiado determinadas precauciones. -Realizar técnica de obtención de plasma rico en plaquetas (PRP) de una sola centrifugación, para obtener la mínima dosis efectiva, ya que se ha observado similares resultados terapéuticos con respecto a la doble centrifugación. 34

35 -Evitar la utilización de plasma rico en plaquetas (PRP) en pacientes con condiciones precancerosas (tejido con displasia, leucoplasias, queilosis solar, o neoplasia a cualquier nivel). -Evitar la aplicación de plasma rico en plaquetas (PRP) en el campo de cancerificación de pacientes con exposición previa a carcinógenos. En este sentido se considera poco recomendado utilizar plasma rico en plaquetas (PRP) en fumadores y/o bebedores, ya que están expuestos a potentes agentes mutágenos y tienen por tanto una mayor probabilidad de que existan células iniciadoras en el proceso de carcinogénesis (19) (34). Acerca del trasplante de tejido graso, existe evidencia científica, en la que resalta esta técnica por su buena reputación y resultados reproducibles, basados en la terapia regenerativa, además de considerarse un material totalmente inocuo (35) (36). TÉCNICAS PARA OBTENER (PRP, tejido adiposo blanco, trombina autóloga) -El plasma rico en plaquetas (PRP) se puede obtener de forma manual con técnica abierta o mediante kits desechables técnica cerrada, describiéndose diversas técnicas. Sistema Harvest Smart PReP de doble centrifugación; Técnica manual de Anitua y colaboradores con una sola centrifugación; Sistema BTI PRGF, Curasan PRP kit AG, Friadent-Schultze PRP KIT, Symphony Platelet Concentrate-Sustem, Secuestra 5000 centrifygation, entre otros. Dependiendo del sistema empleado las concentraciones de plaquetas y leucocitos pueden variar. En la técnica de doble centrifugación, se procesa la sangre que pueden ser 280g a (1400 rpm) durante 7 minutos, o 160g a (1200rpm) durante 10 minutos, el sobrenadante se vuelve a centrifugar a 400g (200rpm) obteniéndose un PRP concentrado. Habitualmente la concentración de plaquetas es de un 33-40%, tras este proceso aumenta hasta un 330%.Existen otros estudios en los que la primera centrifugación 200g durante 10 minutos y la segunda centrifugación 700g durante 15 minutos (34).Eduardo 35

36 Anitua y colaboradores, describieron la técnica de obtener plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugado lento (Sistema BTI PRGF),en el que se procesan pequeñas cantidades de sangre de 40ml aproximadamente, obteniendo un plasma rico en plaquetas (PRP) con todas las proteínas y factores de la coagulación plasmática. Otros protocolos realizan una doble centrifugación, a mayor velocidad para obtener un superconcentrado de plaquetas; otros procesan mL de sangre. El coagulo se obtiene al agregar cloruro de calcio, sin necesidad de utilizar trombina, evitando la aparición de enfermedades desencadenadas por esta sustancia, otros protocolos utilizan trombina bovina. Entendemos que la técnica de obtención de plasma rico en plaquetas (PRP) utilizada por Anitua, nos permite utilizar las plaquetas como vehículo portador de factores de crecimiento, se puede controlar la liberación y concentración de estas proteínas, ofrece mayor seguridad biológica ya que evita la sobreexpresión de factores de crecimiento, nos permite utilizar los factores de crecimiento en la zona receptora que deseamos, favoreciendo y acelerando el proceso de regeneración y reparación tisular (19) (37). -El tejido adiposo blanco. La primera transferencia de grasa se hace en el año 1893 por el Dr F. Nueber. Posteriormente se describen diferentes técnicas, fundamentalmente mediante purificación a través lavado con Ringer Lactato, filtrado, decantación y centrifugación. La restauración de volúmenes o lipoestructura se describe en 1994 por Sydney Coleman, esta incluye sedación y anestesia local de las zonas donantes o receptora y/o anestesia general, dependiendo de las características de cada paciente. Obtienen la grasa de forma manual mediante aspiración con cánula Coleman de extremo romo, unida a una jeringa a presión negativa, suficiente para aspirar y no causar daño al tejido adiposo. El material obtenido no se somete a maniobras de lavado o colado para evitar dañar los adipocitos, pero si se realiza purificación del tejido adiposo mediante centrifugación a 3000 rpm durante 3 minutos, para separa la grasa pura de la sangre, detritos, anestesia y aceites. Otros autores el material 36

37 aspirado lo depositan de forma vertical para realizar un decantado obteniendo un estrato superior (grasa pura), un estrato intermedio (lisis por el proceso de aspiración) y un estrato inferior (presencia de eritrocitos), utilizando en el tratamiento solo el estrato superior. Existen publicaciones que plantean que estos mecanismos de depuración pueden crear un daño osmótico o traumatismos de tipo mecánico sobre los adipocitos, lo que puede modificar la supervivencia de estos. Al margen de la técnica utilizada para obtener el tejido adiposo, su posterior aplicación está basada en la modificación tridimensional de la anatomía, mediante el relleno de las zonas en desarmonía con el propio tejido graso del paciente, permitiendo que la sangre revascularice las zonas receptoras de tejido adiposo y el cuerpo las incorpore permanentemente como tejido propio, ofreciendo resultados predecibles, permanentes y seguros (21) (22) (23) (24) (25).Tomando como premisa todas las cualidades del tejido adiposo y la experiencia de múltiples científicos, hemos dedicado una parte de nuestro estudio a la utilización de este como material de relleno. Según nuestra experiencia, hoy sabemos que un trasplante material autólogo es inocuo y tiene mayor éxito si se lleva a cabo de forma instantánea, transfiriendo de la zona donante a la receptora, sin ningún tipo de manipulación, estas células vivas, van a crear tejido vivo. Teniendo presente las leyes naturales de la física y la química, en esta situación, sería más razonable hablar de un trasplante de tejido sub-cutáneo y no de un lipo-filling, a pesar de estar constituido en su mayoría por células de tejido adiposo. Los implantes de tejido adiposo autólogo por sí mismo, estimulan una neovascularización y le donan a la piel una mayor consistencia y textura (38) (39) (40). -La trombina autóloga, se obtiene mediante métodos de fraccionamiento y purificación de plasma. 1-Método de precipitación a. método físico mediante crio precipitación 37

38 b. método fisicoquímico, entre éstos los procedimientos de precipitación con etanol, derivados del método clásico de Cohn, siendo los más utilizados para la obtención de albumina e inmunoglobulinas. 2- Método cromatográfico a. filtración en gel b. cromatografía de intercambio de iones c. cromatografía de afinidad En nuestro estudio se utilizo el método de precipitación fisicoquímica de Cohn, siendo este el método de fraccionamiento de plasma más utilizado, el cual se basa en la propiedad de las diferentes proteínas de precipitar a diferentes concentraciones de etanol y temperatura de acuerdo a su punto isoeléctrico. Esta materia prima autóloga constituida por fibrinógeno y fibrina al unirla con PRP y factores de la coagulación, activa nuevamente el proceso de coagulación, obteniendo una trombina autóloga humana que pasa rápidamente de estado liquido a gel (41) (42) (43) (44). Este método para la purificación de trombina autóloga fue elegido por ser practico y eficaz, según ha sido demostrado por varios autores (45) (46) (47) (48) (49), el cual hemos modificado y describimos en el método. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN I-General: a) Evaluación de la efectividad terapéutica del uso de los materiales autólogos con fines cosméticos. II-Específicos: a) Establecimiento de parámetros estéticos a evaluar y selección de la muestra. b) Generación de soporte tisular bilógico activo, basado en componentes autólogos. 38

39 c) Evaluación de la respuesta restauradora del material autólogo en los pacientes tratados. MATERIAL Y MÉTODO 1-Diseño de estudio: Prospectivo, observacional. 2-Escenario: El trabajo investigativo se llevo a cabo en el Centro de Atención Primaria Santa Perpetua de la Mogoda, Valles Occidental, Barcelona, España y en el Centro Médico de Prévention de la Sénescence Cutanée, Ohaín, Bélgica. 3-Periodo de tiempo analizado: Nuestro estudio se inició en enero 2009 y finalizó en junio Universo: La muestra de estudio está constituida por un total de 32 individuos, 5 del sexo masculino y 27 del sexo femenino. Con una edad máxima de 60 años, una edad mínima de 40 años, para una media de 50 años. 5- Definición y criterios utilizados a)- Criterios de inclusión -todos aquellos pacientes que fueron caracterizados por la encuesta epidemiológica -ambos sexos -edad mínima 40 años -edad máxima 60 años -que todos los pacientes firmaran el Consentimiento Informado I: Acerca del procedimiento, quedando plasmado su conformidad de formar parte de la investigación, con relación al Consentimiento Informado II: Acerca de la publicación de fotos con fines científicos, no fue obligatorio en nuestra investigación, por la existencia de diferentes criterios por parte de los pacientes. b)-criterios de exclusión -fumadores 39

40 -bebedores habituales de alcohol -mayores de 60 años -menores de 40 años -enfermedades autoinmunes -enfermedades infecciosas -discrasias sanguíneas -enfermedades crónicas no controladas -pacientes que consumen anticoagulantes -pacientes que consuman inmunosupresores -paciente que no haya firmado consentimiento informado -paciente no haya llenado encuesta epidemiológica c) Determinación de analítica preoperatorio A los 32 pacientes de la muestra seleccionada se les realizó analítica sérica de rutina (glicemia, urea, creatinina, perfil lipidico, coagulación y sangramiento, perfil hepático, parámetros endocrinos). Lo valores utilizados, según criterios del Sistema Internacional de Unidades para Laboratorio Clínico del Ministerio de Salud Publica. d) Encuesta Se confeccionaron dos modelos de encuesta:.encuesta epidemiológica I (preoperatoria), recoge datos generales de los pacientes, así como sus antecedentes patológicos familiares y personales (Anexo I), confeccionada de forma simple y entendible. Consta de 27 preguntas con incisos..encuesta epidemiológica II (post-operatoria), recoge las características inmediatas, mediatas y tardías del proceso medico cosmético-estético (Anexo II), confeccionada de forma simple y entendible. Consta de 16 preguntas con incisos. -Aplicación de la encuesta: 40

41 .el personal médico entrego personalmente a cada paciente la encuesta epidemiológica I, antes de la primera fase del tratamiento médico cosmético-estético. Todos los pacientes entregaron el cuestionario un mes antes de iniciar la primera fase del tratamiento médico cosmético-estético..el personal médico entrego personalmente a cada paciente una encuesta epidemiológica II post-operatoria, el mismo día en que se realiza el primer procedimiento de tratamiento médico cosmético-estético. Se continúa el control periódico de las variables de la encuesta, ya que estas, están confeccionadas para ser evaluadas en el transcurso del tiempo, de forma prospectiva, finalizando la encuesta al año de la primera fase del tratamiento médico cosmético-estético. e) Registro de imágenes fotográficas para valorar la morfología facial Se obtienen imágenes digitales, con cámara Sony α 100 DSLR-A100 Lente /18-200,Malasia.Estas imágenes fueron tomadas posicionando los pacientes de la siguiente manera: Colocados en una silla fija del suelo y a 1 ½ metro de la cámara frontal. La altura de la cámara fue regulada según la altura de paciente, tomando como referencia el mentón a 1,20 cm del suelo. Se tomaron fotos con flash convencional acoplado a la cámara. Las fotos fueron llevadas a cabo antes del tratamiento y 10 semanas después de la segunda etapa de tratamiento. Se intentó reproducir las mismas condiciones iniciales de cada paciente a fin de obtener una mejor comparativa. Se consulto a cada paciente el uso de sus fotos para publicaciones científicas, algunos de ellos no consintieron su uso, por lo que sus fotografías no constan en esta publicación respetando su derecho de privacidad. f) Obtención de imágenes cutáneas faciales mediante estudio ecográfico (Ultrasónico) Las mensuraciones de cambio de densidad de la dermis y elasticidad de la piel se llevaron a cabo mediante el uso de DermaLab Combo (Cortex Technology, Denamark). 41

42 Dispositivo que aúna el Dermascan C (ecógrafo de ultrasonidos de alta resolución) y un cutómetro en una misma interfaz. La medición de la hidratación de la piel se llevo a cabo con el corneómetro MPA 580 (Courage-Khazaka, Germany). La ultrasonografía de alta resolución se basa en los mismos principios que la ecografía tradicional para la obtención de imágenes, pero usando frecuencias mucho más elevadas. El resultado es una mayor cantidad de información a cambio de una menor penetración de la señal, lo que redunda en imágenes mejor definidas pero más superficiales. Para este estudio se utilizó la sonda de 25MHz, por ser un estándar de facto y por poseer una penetración de entre 6 y 12 mm, más que suficiente para poder observar toda la dermis. Los cambios del grosor y de densidad son fácilmente observables en la dermis, ya que el colágeno como estructura altamente organizada, posee una elevada ecogenicidad, lo que se traduce en una mayor señal cuyas diferencias son directamente mensurables. Las capturas se realizaron antes del tratamiento y 10 semanas después de la segunda etapa de tratamiento.se elige un ambiente estable con temperatura de 25ºC e iluminación fluorescente. El personal médico les informa a los pacientes que deben acudir desmaquillados a la prueba diagnóstica. -Para todos los pacientes la zona elegida para determinar mensuraciones ecográficas (elasticidad y extensibilidad de la piel a nivel facial) así como determinación del estado de hidratación de la piel antes y después del tratamiento, fue en hemicara derecha, a nivel del pómulo derecho, trazando una línea imaginaria que se extiendo desde el centro de la pupila y otra línea que va desde el ángulo externo del ojo derecho hasta el canto del ala nasal derecha, justo en el punto donde se cortan ambas líneas fueron realizadas las mensuraciones, como podemos observar a continuación. 42

43 Figura 9: Representación anatómica de la zona donde se determinaron las mensuraciones ecográficas así como el estado de hidratación de la piel. -Secuencia de realización de las ecografías: El tratamiento médico estético se realiza en dos etapas, existiendo 8 semanas entre estos. Por tanto las ecografías también son realizadas en dos etapas, la primera antes del tratamiento médico estético, la segunda etapa se realiza a las 10 semanas del segundo tratamiento. Facilitándonos la determinación de parámetros cuantitativos cutáneos (extensibilidad-milímetros, elasticidad-adimensional). En las dos ocasiones el estudio fue realizado por los mismo profesionales, ambiente de climatización, iluminación y con los mismos equipos. -Secuencia de determinación del estado de hidratación de la piel: El estudio se realiza simultáneamente, el mismo día en que fueron realizadas las capturas ecografías, en el mismo ambiente de climatización, iluminación, y por los mismos profesionales y con los mismo equipos. Facilitándonos la determinación de parámetros cuantitativos cutáneos (hidratación-unidades arbitrarias). 6-Hoja de procedimiento operatorio 43

44 En este documento se hace un registro del procedimiento empleado, así como otras observaciones, quedando constancia de parámetros cuantitativos y cualitativos para cada paciente. 7-Limitaciones del estudio -No fue posible realizar estudios mediante métodos precisos (estudio volumétrico de tejido adiposo facial por (TAC, RMN, Tomografia óptica coherente), ya que estos son de alto coste. - Las imágenes fotográficas fueron tomadas por los autores, sin poder aplicar método de triangulación mediante proyección en franjas. -Falta de control sobre otros factores que pudieran influir en los resultados como edad, dieta, factores bio-psico-sociales, etc. -Estas limitaciones hicieron que nuestro trabajo no fuera objetivo al 100%. DESCRIPCIÓN DE MÉTODO 1) Agenda de programación: Los pacientes que formaron parte de nuestra muestra, fueron programados en la agenda de procedimientos terapéuticos mínimamente invasivos de forma ambulatoria. a. Programación del número de sesiones de tratamiento. El procedimiento terapéutico medico estético-cosmético se realizo en diferentes fases, programándose dos sesiones de tratamiento y en caso necesario una tercera sesión en pacientes que así lo requirieron. Entre una fase de tratamiento y la siguiente, existió una pausa de 8 semanas. b. Programación de los test cutáneos para descartar alergia a anestésicos Lidocaína/Epinefrina. Se programan los test cutáneos para detectar alergias e intolerancia a anestésicos, tres semanas antes del tratamiento médico estético-cosmético. 44

45 c. Programación de ecografías cutáneas antes y después del tratamiento médico estético-cosmético. Las ecografías son programadas una semana antes del tratamiento médico estéticocosmético y 10 semanas después de la última sesión de tratamiento. d. Programación para determinar el estado de hidratación de la piel antes y después del tratamiento médico estético-cosmético. La determinación del estado de hidratación de la piel es programada una semana antes del procedimiento medico estético-cosmético y 10 semanas después de la última sesión de tratamiento. e. Programación de encuetas epidemiológica I y II. Programa de una encuesta epidemiológica I preoperatoria (Anexo I) un mes antes del tratamiento médico estético-cosmético. Programación de encuesta epidemiológica II peri-operatoria y post-operatoria (Anexo II), recogiendo datos en el transcurso de dos años. 2) Todos los pacientes deben haber firmado el consentimiento informado para el procedimiento medico así como para publicar sus fotos: 3) Valoración pre-operatoria: a. Examen físico por aparatos y sistemas b. Analítica general previa c. Electrocardiograma previo d. Detección de reacciones adversas a anestésicos locales Las reacciones adversas a anestésicos locales son relativamente frecuentes, si bien las verdaderas reacciones alérgicas son excepcionales. En nuestro protocolo de trabajo, de forma habitual descartamos posibles reacciones adversas a anestésicos locales;1) reacciones toxicas:2) reacciones no relacionadas con el fármaco (reacciones 45

46 psicomotoras, vágales, estimulación simpática, toxicas locales: 3) reacciones adversas alérgicas, siendo la más frecuente la dermatitis de contacto. Realizamos pruebas cutáneas para detectar alergia anestésicos locales, y en caso de sospecha de positividad, los pacientes son derivados al alergista para estudio alergológico determinando anestésicos locales seguros. La prueba cutánea combinada con la prueba de provocación, ofrece un valor predictivo excelente, seguro y eficaz. A todos los pacientes se les realizo prueba cutánea intradérmica con Lidocaína (1:100) 0,1ml en cara interna de antebrazo izquierdo, en la línea media interna a 5 cm del pliegue anterior del codo. La prueba se considero positiva si los habones eran 3mm más grande que el control negativo, lectura inmediata y pasada 24h (según criterios de la American College of Allergy 2008). En nuestro estudio no utilizamos anestésicos locales del grupo Esteres del Ácido Para-amino benzoico. Realizamos test cutáneos para anestésicos locales del grupo Amida (Lidocaína), siendo esta la única sustancia utilizada en nuestro protocolo, que puede implicar un riesgo para el paciente. En todos los pacientes aplicamos Lidocaína como anestésico local, excepto una paciente que presentaba historia previa de alergia a múltiples fármacos, entre estos anestésicos del grupo Amida, estudiada por alergología mediante prueba cutánea de provocación, recomendándose como anestésico seguro el ultracain del grupo Amida. 4) Valoración peri-operatoria: a. Examen físico por aparatos y sistemas b. Ayunas de 8 horas, permitiéndole beber solo agua c. Marcaje de las zonas sobres las que se va a trabajar Antes de comenzar la intervención, después de palpar y observar detalladamente las zonas sobre las que trabajamos, tanto la donante como la receptora, realizamos un marcaje con 46

47 Surgical Skin Marker (Deroyal ) Hospiteria, Bruselas, Bélgica, lo cual facilita el trabajo y lo hace más preciso. d. Premedicación Recomendamos control del stress, ansiedad, vómitos y bronco aspiración. Pautando por vía oral a las 23:00h la noche antes de la intervención: -Ansiolíticos Lorazepam 1mg, vida media de este es de horas. -Antagonistas H2 (profilaxis del bronco espasmo) Domperidona (aceleran el vaciamiento gástrico, no atraviesa B.H.E) o Metoclopramida 10mg (estimula la motilidad gástrica, sin olvidar que puede provocar reacción extra piramidal) -Inhibidores de la bomba de protones Omeprazol 40mg En caso necesario, podemos repetimos la pauta de (ansiolítico, antagonista H2, inhibidor de la bomba de protones) 2 horas antes de la intervención, contando con que su acción se inicia a partir de los minutos de haber sido ingerido. 5) Sala de procedimientos: a. Extracción de sangre -se realiza en el área pre-quirúrgica. -utilización de guantes. -material de desinfección cutánea con Cristalmina Plus Spray Laboratorio Salvat, España, (clohexidina 1% y alantoína 0,4%). -compresor Esmarch. -punción venosa periférica de la región antero cubital del brazo derecho para todos los pacientes, unos minutos antes del procedimiento. 47

48 -utilizamos trocar Vacuette (Greiner bio-one. Ref ) 23G ¾ (0,64mmx19mm).Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -se extraen 45mL de sangre (5 muestras de 9ml) tubos Vacuette (Greiner bio-one) MLS n.v. Holland, de cristal, estériles de sistema serrado. De estos 5 tubos utilizados, 4 contienen coagulation sodium citrate 3,2%(Ref ) y 1 tubo no contiene aditivos (Ref ) MLS n.v. Holland. -los tubos son etiquetados con el nombre de cada paciente. -esparadrapo como sistema de fijación cutánea para evitar el sangrado una vez retirado el trocar. -colector de agujas usadas. b. Centrifugación La fase de separación celular se realiza mediante centrifugación digitalizada, garantizando parámetros de tiempo y velocidad adecuados a nuestro protocolo, a temperatura ambiente. Este proceso debe ser realizado por un profesional con experiencia, para permitir la obtención de la máxima concentración de plaquetas por unidad de volumen de sangre procesada, con este proceso obtenemos el plasma rico en plaquetas (PRP). Todo el procedimiento es realizado en un laboratorio situado anexo a la sala blanca. La separación de los elementos de la sangre después de la centrifugación, se da en función de la densidad, de mayor a menor, la serie roja va hacia el fondo del tubo, los leucocitos se sedimentan en una capa (buffy coat) inmediatamente por encima de los hematíes; esto permite recoger un plasma con la menor cantidad posible de células blancas, consiguiendo concentrar las plaquetas en centímetros cúbicos de plasma situado por encima de la serie roja. Para la obtención de la trombina autóloga existe una fase del proceso en que también interviene la centrifugación con parámetros de tiempo y velocidad establecidos en el protocolo. 48

49 c. Obtención de las fracciones del plasma rico en plaquetas (PRP) El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtiene mediante un método fácil y sencillo, con pequeñas extracciones de sangre del propio paciente, de una vena periférica, una mínima instrumentación, en poco tiempo, en el propio centro médico. En nuestro trabajo para determinar la fracción de plasma a utilizar según el número de plaquetas, se realizo un conteo en 10mL de sangre, que se centrifugo a 200Xg durante 8 minutos, sin freno en la centrifuga, quedando 3mL de plasma. Se muestra el mililitro superior, medio e inferior cerca de buffycoat y la serie roja. El conteo de plaquetas se realizo con un contador automático Sysmex, modelo XE-2100, Japan; y la centrifuga utilizada fue modelo H-19F Regen Lab-Switzerland. Según estos resultados, se decidió trabajar con el plasma rico en plaquetas (PRP) según sus fracciones de concentración como se muestra en la figura 10. Figura 10: Fracciones de plasma rico en plaquetas A los pacientes se les extrajo 4 tubos de 9mL de sangre periférica, los tubos contienen citrato de sodio 3,2% (Ref ) como anticoagulante, se colocan en la Centrifuga 49

50 modelo H-19F Regen Lab-Switzerland, 800Xg, durante 8 minutos a temperatura ambiente 22ºC, con el cual se separan las células del plasma, quedando las plaquetas suspendidas en el plasma. La concentración de las plaquetas es diversa en el plasma, no es uniforme, aumentando su concentración hacia las capas más bajas del plasma, de donde viene el nombre de plasma rico en plaquetas (PRP), el cual constituye aproximadamente 2/3 del volumen de plasma. El uso de anticoagulantes puede modificar la estructura de las plaquetas haciendo que estas se hinchen, tomando forma esférica, perdiendo su forma discoidea. Para la obtención de PRP se utiliza el citrato de sodio como anticoagulante, con el fin de no dañar ni alterar las propiedades de las plaquetas (50). El PRP se colecta con una pipeta de 100 µl evitando aspirar buffycoat o la serie roja. La presencia de leucocitos y neutrófilos puede repercutir negativamente en la formación de la fibrina autóloga, además de interferir en la agregación plaquetaria. Es conocido que las células de la serie blanca y en especial los leucocitos contienen citoquinas proinflamatorias y expresan metaloproteínas (MMP-8 y -9) capaces de degradar la matriz extracelular (51) (52). El aislamiento se hace en condiciones de total esterilidad, bajo flujo laminar. Se debe tener en cuenta que el volumen de plasma varía entre pacientes, y como resultado, el volumen de PRP que se obtiene de 40mL de sangre también varía entre pacientes. El volumen obtenido se debe medir con precisión ya que este parámetro se necesitara cuando se induce la activación plaquetaria. La activación de las plaquetas presente en el PRP se induce de forma fisiológica a través de Ca 2+. El calcio se proporciona a través de una solución de cloruro de calcio concentrada (100 mg/ml), que se le añade al PRP para lograr una concentración final de 50

51 10 mg/ml, o sea el volumen a añadir representa el 10% del volumen de PRP obtenido e inmediatamente se inicia su aplicación. d. Obtención de trombina autóloga mediante precipitación fisicoquímica - 1 tubo que contiene 9mL de sangre de sangre venosa periférica sin aditivos (Ref ) MLS n.v, Holland, se aspira 1 ml de aire, posteriormente se mezcla con un 1mL de ethanol 96º, y posteriormente se añade 0,4mL de cloruro de calcio a una concentración de 100mg/mL. Se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente se centrifuga a 800Xg durante 5 minutos a 22ºC (Centrifuga modelo H- 19F, Regen Lab Switzerland), lo cual facilita la precipitación del fibrinógeno y fibrina. Se aspira 0,1mL del precipitado que se encuentra en la profundidad del tubo, con pipeta (Research Plus Monocanal Eppendorf (Ref ), evitando aspirar la fase liquida, y se coloca en un tubo de ensayo estéril al cual le añadiremos 0,9mL de plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido anteriormente. Se homogeniza la mezcla agitando ligeramente de forma manual, activando así la coagulación, transformándose en gel. La cantidad de trombina a utilizar puede variar para cada paciente, no obstante para este trabajo generamos 5mL de trombina autóloga por paciente (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49). Todo el procedimiento fue realizado en condiciones estériles, bajo flujo laminar. e. Obtención del tejido adiposo blanco de la zona donante Obtención el tejido adiposo que se encuentra a nivel subcutáneo en la zona del trocánter mayor de ambas caderas. Realizamos un micro-túnel de acceso de 2,5mm con bisturí Swan-Marton Sheffield, England, carbón estéril, número 11, estéril descartable, para facilitar la entrada de la cánula de extremo romo Euromi Verviers, Bélgica, con dos agujeros, 15cm de longitud y 2,5mm de diámetro para evitar fricción del tejido adiposo contra las paredes de la cánula, minimizando el daño que puedan sufrir las células 51

52 adiposas. Esta cánula está conectada a una jeringa de 10mL. Realizamos micro aspiraciones manuales, lentas en forma de abanico (sin utilización de aspirador) evitando la exposición de las células adiposas a traumatismos, aire y factores químicos, aspiramos 10 ml de tejido graso de cada lado, para un total de total 20 ml, para todos los pacientes. f. Aporte de sustancias anabolizantes para mejorar supervivencia de los adipocitos Instantáneamente que obtenemos el tejido adiposo, por cada 10 ml de este le añadimos 2 ml de PRP, y realizamos su aplicación inmediatamente en la zona receptora para evitar contaminación y garantizar su supervivencia. g. Anestesia Cuando realizamos una anestesio loco-regional, estamos realizando un bloque reversible de la conducción nerviosa. Con pérdida de la sensibilidad en una zona circunscrita del cuerpo. Utilizando concentraciones mínimas inhibitorias del anestésico local. Cuando utilizamos un anestésico local debemos conocer su mecanismo de acción, ya que estos ocupan el receptor interno del canal de Na+ y producen una expansión de la membrana, que cierra los canales por compresión, no entra Na+ y la célula se mantiene polarizada, de este modo, al no despolarizarse la célula, no hay transmisiones del estimulo doloroso. Siendo estrictamente necesario conocer la inervación sensitiva, así como los receptores especializados de la piel. La inervación sensitiva a través de terminaciones nerviosas corresponden a nervios del sistema nerviosos periférico encargados de inervar glándulas, músculos, folículos pilosos y control del calibre de los vasos sanguíneos. La inervación a través de los receptores especializados, están rodeados por una cápsula de tejido conjuntivo y suelen denominarse corpúsculos. -corpúsculo de Meissner (táctil) -corpúsculo de Valer-Pacini (presión y vibración) -corpúsculo de Ruffini (calor) 52

53 -corpúsculo de Krause (frío) Con la anestesia loco-regional logramos una decorticación del sistema nervioso periférico así como de los receptores especializados. -Anestesia superficial loco regional en la zona donante de tejido adiposo Habitualmente realizamos bloqueo de campo con Lidocaína 2% sin adrenalina en la zona donante de tejido adiposo, para evitar vasoconstricción del tejido adiposo y garantizar la vascularización de este. La anestesia es aplicada de forma tangencial superficial en abanico, obteniendo una decorticación del sistema nervioso periférico. Inyectamos justamente la cantidad necesaria de anestesia, suprimiendo los excesos, evitando que se contamine la zona donante de tejido adiposo que se encuentra a una profundidad aproximada de 1cm. La extracción del tejido adiposo debe realizarse inmediatamente, antes que la anestesia invada las profundidades donde se encuentran las células adiposas. Su extracción se realiza con cánula de extremo romo con movimientos lentos y constante en forma de abanico. En el caso del paciente alérgico trabajos con anestésico seguro recomendado por alergista ultracain -Anestesia loco regional en la zona receptora de tejido adiposo, PRGF, trombina Para las zonas receptoras habitualmente utilizamos Lidocaína 1% + Epinefrina 20mg/0,0125-1,8mL. -Botones dérmicos: Esto se realiza con aguja corta, paralela a la piel con el bisel hacia abajo, la inyección se aplica de forma lenta, con la punta que avanza hacia la dermis, tomando la apariencia de piel de naranja. Esta técnica anestésica la utilizamos para anestesiar la región lateral del rostro, realizando los botones dérmicos en la zona supraciliar donde comienza la frontera entre la piel y el implante capilar, aplicando 0,4 ml por botón, dependiendo de la zona a tratar. El efecto de la anestesia es muy rápido porque los 53

54 receptores especializados corpúsculos, se encuentran inmediatamente debajo de la epidermis. -Bloqueo troncular de nervios periféricos: Para la región medial del rostro, se realiza bloqueo sensitivo de la zona inervante que se va a tratar, con el fin de no comprometer la vascularización de la zona receptora del trasplante, garantizando la aceptación. Utilizamos 0,25mL por bloqueo. Fundamentalmente basamos el bloque troncular en el nervio trigémino (V par craneal) y sus tres ramas. Teniendo presente su recorrido anatómico, ya que este consta de un corto recorrido intracraneal, con su ganglio aferente Gasser, que se encuentra sobre la punta del peñasco temporal, de este ganglio parten las tres ramas del trigémino, cuales abandonan la duramadre por diferentes orificios del suelo de la fosa craneal media. -Hendidura esfenoidal/fisura supra-orbitaria (Nervio oftálmico primera rama del V par) Este una vez que sale del ganglio de Gasser se divide en tres ramas: nasal, lagrimal y frontal. Inerva piel de la frente, piel de la nariz, y parte posterior de la mucosa nasal, entre otras como globo ocular y glándula lagrimal. -Agujero redondo mayor/fisura infraorbitaria (Nervio maxilar superior segunda rama del V par) Este nervio conduce la sensibilidad de la piel adyacente de la mejilla, parpado inferior, parte de las sienes; también de la mucosa palpebral inferior, mucosa del labio superior, dientes superiores, paladar óseo, úvula y amígdalas, nasofaringe, oído medio y la parte inferior de la mucosa nasal. -Agujero oval (Nervio maxilar inferior tercera rama del V par) Es un nervio mixto, con su rama lingual y nervio dentario inferior. Sus fibras motoras inervan músculos masticadores, y sus fibras sensitivas reciben y conduce la sensibilidad 54

55 de la piel de la parte posterior de las sienes, mejillas, labio inferior, mentón, entre otros dientes inferiores, suelo de la boca, etc. Estos puntos de acceso nos permiten anestesiar un área extensa, con un mínimo de solución anestésica, no provocando modificaciones locales ya que el producto se inyecta a distancia. Con estas técnicas de anestesia en forma de bloqueo de campos, botones dérmicos y bloqueo troncular de nervios sensitivos, y conociendo las estructuras anatómicas, evitamos riesgo de introducir anestesia en la luz del vaso lo cual puede conllevar a accidentes tóxicos graves. Además nos permite trabajar sobre grande volúmenes de piel a baja concentración y no sigue recorridos de nervios. Siempre teniendo presente que la anestesia local puede conllevar a complicaciones entre estas:1) equimosis, hematomas; 2) absceso; 3) lesión del nervio; 4) hipersensibilidad local. Recomendando un conocimiento exhaustivo de las zonas anatómicas a tratar. Figura 11: Músculos de la cara. Gilroy S, MacPherson S, Ross S.Cabeza y cuello.atlas of anatomy by Thieme Medical Publishers. Inc. Madrid. España. Panamericana, 2009:p

56 Figura 12: Vasos y nervios de la cara. Gilroy S, MacPherson S, Ross S.Cabeza y cuello. Atlas of anatomy by Thieme Medical Publishers. Inc. Madrid. España. Panamericana, 2009:p.498. h.aplicación obtenidos mediante técnica mínimamente invasivo con los tres elementos -tejido adiposo aplicado con cánula romo en posición tangencial Una vez obtenido el tejido adiposo de la zona donante, aproximadamente 20 ml para cada paciente, no realizamos ningún procedimiento de depuración (lavado, filtrado, decantación, centrifugación). Preservando el tejido con todo su entorno natural (estroma vascular o tejido conjuntivo reticular, donde se encuentra el nicho de células madre).a los 20mL de tejido adiposo le añadimos 4 ml PRP como sustancia anabolizante. En todos los pacientes empleamos la normocorrección, con dos sesiones de tratamiento, y en caso necesario una tercera sesión. Entre las sesiones de tratamiento, hubo una de pausa de 8 semanas para todos los pacientes. Contando con que solo el 50% de las células sobreviven, trasplantamos 10mL de tejido adiposo más 2mL de PRP por hemicara; aplicado en posición tangencial respecto al plano horizontal, pero de forma vertical a los 56

57 pliegues cutáneos, según vectores de fuerza, particularizando en la función de las zonas de fusión anatómica y la gravedad. Por tanto, la cantidad de tejido adiposo trasplantado es mínima con relación a la superficie a tratar; en efecto, mientras más pequeña sea la cantidad a revascularizar, mayor supervivencia y menos riesgo de rechazo. Por tanto, los planos de inyección escogidos son numerosos y todos terminan cuadriculando totalmente el rostro. Se realizan pequeños túneles en la zona receptora, para facilitar la entrada de cánula de extremo romo con un agujero, 7cm longitud y 1,25mm de diámetro, Euromi Verviers, Bélgica, especifica para tejido adiposo, conectada a una jeringa de 10mL.Se realizan múltiples microinfiltraciones en forma de granos de arroz, a nivel subdérmico, intradérmico, e infra muscular, en diferentes pases, previniendo el paso al torrente sanguíneo. -plasma rico en plaquetas (PRP) aplicado con aguja en posición tangencial El (PRP) fue aplicado en la cara de los paciente en plano tangencial con aguja 27 G 1 ¼ Inex Puiseux-le-Hauberger, France; a nivel subcutáneo superficial, fundamentalmente en la zona malar, infra-orbitaria, en la cola de las cejas, y zona peri oral. -trombina autóloga aplicado con aguja en posición horizontal La trombina autóloga debe ser aplicada con gran rapidez, destreza y habilidad, ya que la aplicamos con aguja corriendo el riesgo de aparición de hematomas y equimosis, lo que requiere que se inyecte en posición horizontal a nivel subcutáneo, con aguja 27 G 1 ¼ Inex Puiseux-le-Hauberger, France. Dentro de sus particularidades está la de transformarse rápidamente, de su estado líquido a gel, en un tiempo aproximado de 30 segundos. Con esta materia prima autóloga logramos suavizar el contorno de los huesos que con el transcurso de los años se hacen más prominentes. La aplicamos en zona infraorbitaria, entrecejo, labios y surco nasogeniano, actuando como soporte tisular biológico y su vez nos permite generar volúmenes. En nuestro protocolo solo es aplicable 57

58 en su estado líquido, ya que en estado gel es imposible su paso por la aguja, lo que exige una rápida aplicación de esta en la cara de los pacientes. Aplicamos 5 jeringas de 1mL de trombina en su forma líquida, lo que hace un total de 5mL de trombina autóloga para cada paciente. i. Combinación de otras técnicas -Durante las diferentes etapas de tratamiento, la fisonomía de los pacientes fue valorada de forma evolutiva e integral. Complementando los resultados con la combinación de otras técnicas alternativas mínimamente invasivas, como es en el caso de exceso de piel el parpado superior, en los que se realizo blefaroplastia mediante radiocirugía de alta frecuencia, con Ellman Surgitrom F.F.P.F EMC, USA. j. Crioterapia Inmediatamente terminado el proceso de rejuvenecimiento facial, se realiza una Crioterapia Dermoline Sophysa Benelux,Braine-L alleud, Bélgica, a una temperatura de -5ºC, durante 5 minutos en las zonas receptoras, con el objetivo prevenir equimosis, remodelar curvas y disminuir la inflamación. k. hoja de procedimiento operatorio -tejido adiposo (ml) /PRP (ml)/ calcium clorure (ml)/ trombina autóloga (ml) -zona donante/zona receptora/número de sesiones/otros procedimientos/kilaje/anestesia Figura 13: Hoja de procedimiento operatorio CASO TEJIDO ADIPOSO (ml) PRP (ml) CALCIUM CLORURE (ml) TROMBINA AUTOLOGA (ml) ZONA DONANTE DE TEJIDO ADIPOSO ZONA RECEPTOR TEJIDO ADIPOSO,PRP,TROMBINA NUMERO DE SESIONES OTROS PROCEDIMIENTOS PESO (kg) 1 20ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, cola de las cejas, pómulos 2 NO ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera 2 NO ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de 2 NO 63 cadera 4 20ml 7ml 0,7ml 5ml Infraumbilical s.n.g, peri orbitaria 2 NO ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera 6 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera 7 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 58 s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, pómulos, arco mandibular, entrecejo, cola de las cejas, s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria 2 NO 75 3 Blefaroplastia 60 2 NO 51

59 8 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios 9 20ml 10ml 1ml 5ml Infraumbilical s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria 10 20ml 6ml 0,6ml 5ml Trocanterica de s.n.g, cola de las cejas, peri cadera orbitaria 2 NO 56 2 NO 70 2 NO ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 12 20ml 7ml 0,7ml 5ml Trocanterica de cadera 13 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 14 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera 15 20ml 7ml 0,7ml 5ml Trocanterica de cadera 16 20ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera 17 20ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera 18 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera 19 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria 20 20ml 9ml 0,9ml 5ml Infraumbilical s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios 21 20ml 7ml 0,7ml 5ml Trocanterica de s.n.g, cola de las cejas, peri cadera orbitaria 22 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de s.n.g, arco mandibular cadera,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria 23 20ml 10ml 1ml 5ml Infraumbilical s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria 24 20ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera 25 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera 26 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 27 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 28 20ml 9ml 0,9ml 5ml Trocanterica de cadera 29 20ml 7ml 0,7ml 5ml Trocanterica de cadera 30 20ml 10ml 1ml 5ml Trocanterica de cadera 31 20ml 8ml 0,8ml 5ml Trocanterica de cadera s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, peri orbitaria, peri bucal, labios s.n.g, arco mandibular,entrecejo, cola de las cejas, peri orbitaria 32 20ml 10ml 1ml 5ml Infraumbilical s.n.g, cola de las cejas, peri orbitaria 2 NO 71 2 NO 69 2 NO 53 2 NO 57 2 NO 61 2 NO 50 2 NO 53 2 NO 49 2 NO 58 2 NO 70 2 NO 57 2 NO 50 2 NO 57 2 NO 64 2 NO 67 2 NO 63 2 NO 59 2 NO 65 2 NO 68 2 NO 70 2 NO 71 2 NO 58 CASO ZONA DONANTE DE TEJIDO ADIPOSO DOSIS MÍNIMA ADMINISTRADA ZONA RECEPTORA DE TEJIDO ADIPOSO, PRP, TROMBINA AUTÓLOGA DOSIS MÍNIMA ADMINISTRADA ALERGIA ANESTÉSICOS 1 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg 3ml Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 1,8ml Propofol 2 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg 3 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg 4 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg 5 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg 6 Hidrocloruro Articaina 40,0mg/ml + Epinefrina 0,005mg/ml Dosis máxima 7mg/kg 7 Lidocaína 1%-10ml (10ml-200mg) 3ml 3ml 3ml 3ml 2ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml Hidrocloruro Articaina 40,0mg/ml + Epinefrina 0,005mg/ml Dosis máxima 7mg/kg Lidocaína 2%+epinefrina (20mg/0,0125-1,8ml) 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 2ml 1,8ml NO NO NO NO Lidocaína NO 59

60 7mg/kg/dosis Dosis máxima 2ml Dosis máxima 500mg 8 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 9 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 10 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 11 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 12 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 13 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 14 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 15 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 16 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 17 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 18 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 19 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 20 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 21 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1.8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 22 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 23 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 24 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 25 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 26 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 27 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 28 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 29 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 30 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 31 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 32 Lidocaína 1%-10ml 3ml Lidocaína 2%+epinefrina 1,8ml NO 60

61 (10ml-200mg) 7mg/kg/dosis Dosis máxima 500mg (20mg/0,0125-1,8ml) Dosis máxima 2ml 6) Post-operatorio a. Sala de recuperación -consta de un ambiente acogedor, climatización estable 25ºC. -cámara infrarrojos: se coloca al paciente en una camilla acoplado a una cámara infrarrojos biocompatibles Done Professionnel Visage Nivel Inovo Irl Techologies Montpellier, France, durante 20 minutos hasta llegar a una temperatura de 37ºC, aumentando flujo sanguíneo y linfático, mejorando las reacciones fisiológicas de las células. 7) Recomendaciones post-operatoria -no esfuerzo físicos durante una semana. -no realizar masajes sobre la zona trasplante durante una semana, para facilitar la fijación y revitalización del tejido adiposo en la zona receptora. -no exponerse a altas temperaturas. -no exponerse a radiaciones solares durante un mes. -analgésicos en caso de dolor. -buena hidratación. 8) Seguridad a. Carro de paro b. Desfibrilador externo automatizado Datas Cope Passeport Permitiendo mantener monitorizado el paciente en todo momento. c. Cámara Flujo laminar -utilización de una cámara flujo laminar H500 Hotte a filtration Suivant La Norme NX Classe 2.Dimensions externa 980x800x620mm (HLP),Poste de sécurité 61

62 microbiologique, Type BIO II 9-12, ADS Laminaire, Bélgica, en todo el proceso de separación celular posterior al centrifugado de la sangre obtenida. d. Medidas y medios de protección -uso de guantes, gorros, mascarillas, paños hendidos, gasas, compresas estériles descartables. - medidas asepsia-antisepsia correspondientes..asepsia de las zonas a tratar con Cristalmina Plus Spray Laboratorio Salvat, España, (clohexidina 1% y alantoína 0,4%)..aislamiento de campos con paño hendido estéril descartable, para la zona donante y receptora. e. Valoración y seguimiento -se realiza un control estricto sobre la posibilidad de las reacciones adversas o efectos secundarios durante y después del procedimiento medico estético-cosmético. f. Tiempo de duración del procedimiento -el procedimiento desde su inicio de la extracción de la sangre, obtención del tejido adiposo de la zona donante y su trasplante a la zona receptora, aplicación del PRP y trombina, transcurre en un tiempo máximo de 2 horas. -si existe algún percance inesperado y nos retrasamos en el proceso de aplicación de la trombina autóloga, corremos el riesgo que esta se convierta en gel, en caso que esto suceda la descartamos, y obtenemos una nueva muestra. -el plasma se aspira desde la fracción más profunda sin causar turbulencias con Pipeta Research Plus variable Monocanal Eppendorf, si se remueve la serio roja, se descarta el tubo contaminado debido a que se ha producido una hemolización del plasma. g. Fiabilidad del material utilizado 62

63 Todo el material utilizado es de alto nivel de seguridad, estéril descartable, poseen el marcado CEE, sobre productos sanitarios, para uso especifico para la obtención de plasma rico en plaquetas (PRP) y trasplante de tejido adiposo. -Centrifuga modelo H-19F Max. Speed (base on rotor type) rpm 4000 Max. Capacity (based on material density ml 240 Kinetic energy (nm) Total power consumption (w) 130 Electrical Supply (v/h2) 220/50 Input fuses (A) 3 Gigas 800 Regen Lab Switzerland -Cámara flujo laminar H500 Hotte a filtration Suivant La Norme NX Classe 2.D.Poste de Sécurité Microbilogique Type BIO II 9-12 ADS Laminare, Bélgica. - Trocar Vacuette (Greiner bio-one. Ref ) 23G ¾ (0,64x19mm).Inex Puiseuxle-Hauberger, France. -Tubos de cristal, estériles, sistema serrado, citratados Vacuette (Greiner bio-one. Ref ).MLS n.v. Holland. - Tubos de cristal, estériles, sistema serrado, sin aditivos Vacuette (Greiner bio-one. Ref ). MLS n.v. Holland. - Bisturí Swan-Marton Sheffield, England, carbón estéril, número 11, estéril descartable. - Cánula de extremo romo con dos agujeros, 15cm de longitud y 2,5mm de diámetro (Ref.1311LLMEI-2.5*100).Euromi, Verviers, Bélgica. 63

64 -Cánula de extremo romo con un agujero, 7cm longitud y 1,25mm de diámetro (Ref. CF12790). Euromi, Verviers, Bélgica -Aguja 30G ½ 0,3x13mm (Ref ) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Aguja 18G 1½ 1,2x40mm (Ref ) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Aguja 21 G X2 0,8X50mm (Ref ) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Aguja 27 G 1¼ (Ref ) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Jeringas descartables de 1mL (Ref ) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Jeringas descartables de 10mL (Ref. BSO1T2613) Inex Puiseux-le-Hauberger, France. -Contador automático Systmex, Modelo XE-2100, Japan. -Pipeta Research variable Plus Monocanal Eppendorf (0,5mL-5mL) (1mL-10mL) (Ref ). ANALISIS ESTADISTICO -Estadística descriptiva (gráficos de sectores/histogramas/contingencia con coeficiente de correlación/gráficos de barra). -Estadística cuantitativa descriptiva (tablas de frecuencia/histogramas/boxplot). -Test de hipótesis (prueba no paramétrica de normalidad/prueba no paramétrica de normalidad de la variable de diferenciación/prueba T/correlación de Pearson). 1) S.P.S.S Para obtener nuestros resultados estadísticos hemos creado una base de datos mediante el Statistical Package for the Social Science (S.P.S.S) versión 15.Este programa estadístico se utiliza para trabajar con bases de datos de gran tamaño, permitiendo recodificar variables y registros según las necesidades del usuario. El programa consiste en un modelo de base y módulos anexos, que se han actualizado constantemente con nuevos procedimientos estadísticos. 64

65 65

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