Western Blot Introducción y Optimización. Ariana Veiga

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1 Western Blot Introducción y Optimización 10 Abril 2013 Ariana Veiga

2 Western Blot En qué consiste el Western Blot? Cómo funciona? También llamado Inmunoblot Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene varias proteínas Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra Calle 1: Anticuerpo anti- β Actina (ab8226) diluido 1/1000 Calle 2: ab8226 diluido 1/10000 Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500 Calle 1: Calle 2: Calle 3: Calle 4: Lisado celular HeLa (humano) Lisado celular HeLa (humano) Lisado celular HEK293 (humano) Lisado celular 3T3 (ratón) 2

3 En qué casos es útil utilizar Western Blot? Está la proteína de interés presente en mi muestra? El tratamiento con un determinado agente X, aumenta o reduce el nivel de expresión de mi proteína? Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en distintos tejidos o líneas celulares? Mi muestra es sana o patológica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc. 3

4 Organización del Webinar Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 4

5 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 5

6 Preparación de las muestras para la electroforesis Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo 6

7 Lisis Mantener las muestras en hielo o a 4ºC para evitar degradación de las proteínas Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en frío. Antes de realizar la lisis, añadir al tampón un cocktail de inhibidores de proteasas Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al tampón de lisis Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína de interés Localización de la proteína Célula entera Citoplasmática (soluble) Citoplasmática (citoesqueleto) Membranal Nuclear Mitocondrial Tampón de lisis recomendado NP-40 o RIPA Tris-HCl Tris-Triton NP-40 o RIPA RIPA RIPA 7

8 Preparación de las muestras para la electroforesis Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo Determinar la concentración de proteínas Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias) Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a ºC o durante 5-10 minutos a 70ºC 8

9 Condiciones reductoras y desnaturalizantes Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y β- mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol) El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular mediante SDS-PAGE La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unión SDS y DTT/ β-mercaptoetanol Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las proteínas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o β-mercaptoetanol o DTT no deben añadirse a los tampones. 9

10 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 10

11 SDS-PAGE Definición Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética SDS : Dodecilsulfato Sódico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida 11

12 SDS-PAGE Cómo funciona? El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; ph 8,3 Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 µg por calle Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas hacia el polo positivo Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas endógenas de las mismas son despreciables El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente - Corriente eléctrica + Frente de migración 12

13 Geles Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMED La estructura del gel puede modificarse alterando la proporción de acrilamida Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para proteínas de gran tamaño Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamaño de la proteína es desconocida Tamaño de la proteína (kda) Porcentaje del gel ,

14 Electroforesis en condiciones no reductoras y/o no desnaturalizantes Forma requerida de la proteína Reducida- Desnaturalizada Condiciones electroforesis Reductor y desnaturalizante Tampón de carga Con ß-mercaptoetanol o DTT Con SDS Tampón de migración Con SDS Reducida - Nativa Reductor no Con ß-mercaptoetanol o Sin SDS desnaturalizante DTT Sin SDS Oxidada Desnaturalizada Oxidada - Nativa No reductor y desnaturalizante No reductor y nativo Sin ß-mercaptoetanol ni DTT Con SDS Sin ß-mercaptoetanol ni DTT SinSDS Con SDS Sin SDS 14

15 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 15

16 Objetivo de la transferencia Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés para poder visualizarla El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas Los anticuerpos no son retenidos en el gel Los geles son frágiles y difíciles de manipular Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado 16

17 Cómo funciona la transferencia? El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que en el gel Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol Montaje de la transferencia 17

18 Transferencia en medio húmedo o semi seco? Ventajas Inconvenientes Medio Húmedo El gel y la membrana se intercalan y fijan firmemente entre finas esponjas y papel absorbente Este montaje sándwich se sumerge en un compartimento que contiene el tampón de transferencia donde se aplica a continuación la corriente eléctrica Un tampón de transferencia se compone normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina y 20% de Metanol Adecuado para proteínas grandes o difíciles de transferir El proceso de transferencia es más largo Semi Seca El montaje papel-gel-membrana-papel se humedece con tampón de transferencia El montaje se coloca directamente entre el cátodo y el ánodo donde se aplica la corriente El tampón de transferencia estándar suele contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04% SDS, y 20% Metanol Más rápido La membrana puede secarse afectando a la transferencia de las proteínas 18

19 Transferencia de proteínas >100 kda Transferencia en medio húmedo durante la noche a 4 ºC y bajo voltaje Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de aglomerados en el gel Reducir la cantidad de metanol en el tampón de transferencia a 10% o incluso menos para evitar la dispersión de proteínas en el gel Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del tampón (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol) 19

20 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 20

21 Por qué se utilizan anticuerpos? Colorantes como Coomassie pueden usarse para teñir las proteínas después de realizar el SDS-PAGE SDS3 Pero, cuál de las bandas corresponde a la proteína de interés? El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la proteína de interés Lisado celular de SDS3 transfectado (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda) y en Western Blot con el anticuerpo ab89345 anti-sds3 (derecha). 21

22 Inmunodetección Bloqueo de la membrana Leche, BSA, etc Epítopo Incubación con el anticuerpo primario Proteína Anticuerpo Proteína Lavado (TBST) Incubación con anticuerpo secundario conjugado Proteína Anticuerpo Proteína Lavado (TBST) Detección Proteína 22

23 Detección Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol) Producto (sensible a la luz) Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en una película fotográfica Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana próximo a la zona del anticuerpo Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial ECL : Enhanced chemiluminescence HRP : HorseRadish Peroxidase DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride AP : Alkaline Phosphatase 23

24 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 24

25 Controles de carga Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de SDS PAGE es constante Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares independientemente del tipo de muestra Control de carga Tipo de muestra β Actina Célula entera / Citoplasma GAPDH Célula entera / Citoplasma Tubulina Célula entera / Citoplasma Peso molecular (KDa) VDCA1/Porinas Mitocondria 31 Precauciones 42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de la proteína actina (Farmer et al, 1983) Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares 55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000) COXIV Mitocondria 16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que COXIV Lamin B1 Núcleo 66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la membrana nuclear Proteína de unión a TATA (TBP) Núcleo 38 No es válido para muestras sin ADN 25

26 Controles de carga Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o recombinante), etc Todas las calles - anticuerpo anti - Actina control de carga (ab8227) diluído 1/1000 Calle 1: Células HeLa (humano) a 20 µg Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg Calle 3: Hígado de pescado a 20 µg Calle 4: Hígado de conejo a 20 µg Calle 5: Células MDCK (perro) a 20 µg Calle 6: Células EBTr (bovino) a 20 µg Calle 7: Células SL-29 (pollo) a 20 µg Calle 8: Células CHO (Hamster chino) a 20 µg Calle 9: Embrión de Xenopus a 20 µg 26

27 Controles positivos y negativos Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de interés Proteína recombinante Células transfectadas con la proteína de interés Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar Muestras knockout o sirna Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína 27

28 Péptidos de bloqueo La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de manera específica los sitios de unión del anticuerpo Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no puede unirse a la proteína en la membrana Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la proteína o proteínas no específicas Todas las calles: Anti-Histona H3 (fosfos10) [mabcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml Calle 1: Preparado de Histona, células HeLa Calle 2: Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml 28

29 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 29

30 Adecuado para Western Blot Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la ficha técnica del anticuerpo 30

31 Inmunógeno y especificidad Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre una región específica de la proteína (epítopo) Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un precursor de la misma si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína NERTCRCDKP NERTCRCDKP 31

32 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 32

33 Ausencia de bandas, o bandas muy débiles Origen del problema Incompatibilidad con el anticuerpo secundario No hay suficiente proteína o anticuerpo para producir una señal Solución Seleccionar un anticuerpo secundario que sea compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo primario (ej. Anticuerpo secundario anti-igm de ratón con anticuerpo primario IgM hecho en ratón) Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo primario o de anticuerpo secundario (incluso una combinación de los tres) Tiempo de incubación insuficiente Incubar la membrana con el anticuerpo primario para producir una señal durante la noche a 4ºC La membrana no se ha bloqueado correctamente La proteína no se ha transferido correctamente del gel a la membrana Las proteínas hidrófobas son más difíciles de transferir La muestra no expresa la proteína de interés El anticuerpo no reconoce la proteína de interés Bloquear durante menos tiempo o usando un agente de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo al agente de bloqueo Comprobar que se ha producido la transferencia usando un colorante como rojo de Ponceau. Es posible que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de transferencia Para este tipo de proteínas usar membranas de PVDF Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína de interés Verificar que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína a estudiar 33

34 Ruido de fondo Origen del problema Exceso de lisado celular, anticuerpo primario o secundario que provocan uniones no específicas Temperatura de incubación del anticuerpo primario muy elevada La membrana no se ha bloqueado correctamente Uso de una membrana no adecuada Degradación de la proteína Presencia de isoformas o fragmentos de la proteína de interés Presencia de polímeros Solución Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más los anticuerpos Incubar durante la noche a 4ºC Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un detergente, como Tween 20, al tampón de lavado. Probar otro agente de bloqueo Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos ruido de fondo que las membranas de PVDF Optimizar la preparación de la muestra. Mantener las muestras en hielo y añadir una solución recién preparada de inhibidores de proteasas. Almacenamiento de muestras a largo plazo puede dañar las proteínas Consultar la literatura y SwissProt Hervir las muestras durante 10 minutos antes de realizar la electroforesis 34

35 Exceso de proteína y/o anticuerpo Dilución de la muestra y anticuerpo primario 35

36 Optimización del tampón de bloqueo 5% leche 5% BSA 5% BSA 5% leche Anti-GAPDH [mabcam 9484] - Loading Control (ab9484) a una dilución 1/1000 A cada anticuerpo le corresponderá una solución de bloqueo óptima 36

37 Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta Durante la transferencia, contacto insuficiente entre el gel y la membrana Burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia Lavados insuficientes 37

38 Proteínas en estado nativo Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las proteínas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas La imagen muestra un Western Blot de colágeno III humano purificado, en la forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha La estructura tridimensional del sitio de unión del anticuerpo al antígeno se pierde al desnaturalizar y reducir la proteína Forma reducida y desnaturalizada Forma nativa Colágeno humano purificado (ab7535) a 5 µg por calle con el anticuerpo anti-colágeno III(ab6310) Calle 1: Proteína en su forma reducida y desnaturalizada Calle 2: Proteína nativa (son reducir ni desnaturalizar) Imagen cortesía de un Abreview enviado por Michaela Leyh 38

39 Conocer la proteína de interés Las proteínas no siempre muestran una única banda al peso molecular esperado Posibles motivos: fragmentación de la proteína, modificaciones post -traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas Una diferencia del 10-15% respecto al tamaño esperado se considera aceptable y dentro de la normalidad Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura 39

40 Protocolo de Western Blot Paso 1: Preparación de la muestra Paso 2: Electroforesis en gel Paso 3: Transferencia gel - membrana Paso 4: Inmunodetección Controles recomendados en WB Selección de anticuerpos Problemas técnicos y optimización. Ejemplos. Enlaces a otros productos de interés 40

41 Protocolos y material de interés SwissProt Protocolos detallados de WB Guía sobre controles de carga: Vídeo detallado sobre WB: Guía de trucos para WB Descarga tu guía de trucos para WB en nuestra página de protocolos O pide tu copia por 41

42 Reactivos para Western Blot Optiblot Marcadores de peso molecular Prism Anticuerpos secondarios AbExcel Geles prefabricados y soluciones tampón optimizadas para WB Otros reactivos (tinción de gel, Bradford, etc ) Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usar Anticuerpos secundarios validados para WB Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP) Kits ECL Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB 42

43 Optiblot reactivos para WB Fáciles de usar pocillos coloreados para facilitar la carga de la muestra Hasta 10 veces más fuertes que los geles convencionales Pocillos de alta capacidad y sin peine que remover Larga duración 1-2 años de caducidad Fáciles de abrir, sin espátulas o cuchillos Geles compatibles con la mayoría de tanques Todos los reactivos necesarios para tus experimentos: Tampones optimizados Optiblot Blue (ab119211) tinción tipo Coomassie del gel en tan sólo 15 minuots Reactivo Bradford y ensayo BCA compatible con detergentes en la muestra Otros productos membranas PVDF de baja fluorescencia, etc Más información: 43

44 Anticuerpos monoclonales de conejo ( ), óptimos para WB Histona H3 (fosfot3) RabMAb Anticuerpo histona H3 (fosfot3) (ab78351), dilución 1/500,000 en HeLa. 1) Sin tratar, 2) Tratadas con FBS + Caliculina A. RabMAb: ventajas para WB Alta afinidad mayor factor de dilución (hasta 1: en algunos RabMAbs) Alta especificidad señal específica, sin o con muy poco ruido de fondo Reconocen epítopos diversos ideal para la detección de modificaciones posttraduccionales (ej. fosforilación, metilación, acetilación) Cada RabMAb has sido testado en WB en muestras humanas, de ratón y rata para determinar la reactividad Más de 4000 RabMAbs disponibles Más información: 44

45 AbExcel anticuerpos secundarios 5 razones para usar secundarios AbExcel Altamente testados AbExcel conjugados a AP se pueden usar en diluciones de 1/5000 a 1/50000 Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se pueden conseguir hasta blots (usando dilución 1/5000 en 3ml leche/bsa) AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en diluciones de 1/2000 a 1/20000 Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se pueden conseguir hasta 600 blots (usando dilución 1/2000 en 3ml leche/bsa) Más información: AbExcel: 45

46 Bolígrafo Luminol para membrana (ab166858) La forma más fácil y segura de calcular el peso molecular de la proteína de interés. Una vez las proteínas han sido transferidas a la membrana: Marca los estándares de PM con el boli Lumimol en la membrana Continúa con la hibridación de la membrana según tu procedimiento habitual (bloqueo, etc ) Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetría Visualiza y localiza las bandas del estándar con película o procesador CCD 46

47 Contáctanos España: Teléfono: , Argentina: Tecnolab; Teléfono: , Chile: Biosonda; Teléfono: , Méjico: CTR Scientific; Teléfono: , Otros paises: Abcam; Teléfono: , 47

48 Promoción especial para participantes 20% descuento en los siguientes productos: (hasta el 31 de mayo 2013) Gama Optiblot RAbMAbs Gama AbExcel Código : SPWEB-XBIS1 48

49 Preguntas? 49

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