Estudio de patrones de indeterminados al Western blot en el algoritmo cubano de diagnóstico serológico del Virus de Inmunodeficiencia Humana

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1 ARTÍCULO ORIGINAL / ARTIGO ORIGINAL Estudio de patrones de indeterminados al Western blot en el algoritmo cubano de diagnóstico serológico del Virus de Inmunodeficiencia Humana Study of Western blot indeterminate patterns in the algorithm followed in Cuba for HIV diagnosis Eladio Silva Cabrera 1 Ana L Lubián Caballero 2 Otto Cruz Sui 3 Dervel Felipe Díaz Herrera 4 Lucy Montano Tamayo 5 Carmen Nibot Sánchez 6 Héctor Díaz Torres 7 Rev Panam Infectol 2013;15(3-4):95-99 Conflicto de intereses: ninguno Recebido em 20/7/2011 Aprovado em 10/2/ PhD. Especialista de segundo grado en Microbilogía 2 Especialista de primer grado en Epidemiología 3 PhD. Licenciado en Biología 4 MsC. Licenciado en Bioquímica 5 Técnico en Microbiología 6 Licenciada en Biología 7 PhD. Especialista de primer grado en Infectología 1-7 Departamentos de confirmación serológica y de Inmunotransferencia. Laboratorio de Investigaciones del SIDA, Carretera de Tapaste y Autopista Nacional, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. RESUMEN Cada año un número de personas resultan indeterminadas por las pruebas de Western blot y requieren de seguimiento para esclarecer su condición serológica respecto al VIH. Para profundizar en el conocimiento de este grupo, se estudió la respuesta de anticuerpos a las diferentes proteínas virales en el Western blot de 571 personas que resultaron indeterminadas en el algoritmo de confirmación del Laboratorio de Investigaciones del SIDA en Cuba (LISIDA) durante los años 2004 y 2005, también se investigó la evolución serológica de 57 personas que presentaban reactividad solamente contra las proteínas de 53 y/o 55 Kd, pudiendo estar presente además, reactividad contra la proteína de 17Kd. Se observó de forma significativa (p< 0,001) una mayor reactividad a las proteínas de 53 y 55 Kd, de igual forma resultó significativo el porcentaje de personas que negativizaron su patrón de bandas en el Western blot en la evolución serológica. Los resultados coinciden con lo reportado por otros investigadores en estudios similares y justifican la estrategia de seguimiento serológico y epidemiológico en personas con patrones indeterminados al VIH 1 en el Western blot, aún cuando su reactividad sea solamente contra las proteínas de 53 o 55 Kd, además, confirman que el diagnóstico de VIH va más allá de un criterio de interpretación o el valor de la reactividad a una proteína en particular, el éxito está en la conjugación de los resultados del laboratorio con la clínica y la epidemiología. Palabras clave: Western blot; VIH; Diagnóstico; Seguimiento 95

2 Cabrera ES et al Estudio de patrones de indeterminados al Western blot en el algoritmo cubano de diagnóstico serológico del Virus de inmunodeficiencia humana ABSTRACT Every year a number of individuals are interpreted as indeterminate when tested by Western blot, then, a follow up is required to clear up their HIV serological status. To deepen in the study of this group, 571 persons whose Western blot was interpreted as indeterminate in the confirmatory algorithm of the AIDS Research Laboratory in Cuba (LISIDA) during the years 2004 and 2005 were studied for antibody response to the different HIV viral proteins; the serological evolution of 57 persons who only showed reactivity to p53 and/or p55 Kd, with a probable reactivity to p17 Kd protein was also studied. A greater reactivity (p < 0,001) to proteins 53 and 55 Kd was observed, and the percentage of persons who became negative in their Western blot bands pattern during the serological evolution was also significant. The results correlate with those reported by other researchers in similar studies, and justify the strategy of serological and epidemiological follow up in HIV- 1 individuals with Indeterminate Western blot tests, even when its reactivity is only against proteins 53 or 55 Kd, it also confirms the fact that HIV diagnosis is beyond an interpretation criteria or the reactivity value to a particular protein, success lies on the conjugation of clinical and epidemiological laboratory results. Keywords: Western blot; HIV-1; Diagnosis INTRODUCCIÓN Las pruebas de pesquisaje que se utilizan en el diagnóstico serológico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) poseen alta especificidad, no obstante, es usual confirmar cualquier resultado reactivo por estas, antes de emitir un diagnóstico definitivo (1). A través del Western blot, que es la prueba más usada en la confirmación de anticuerpos contra el VIH 1 y VIH 2, se puede identificar correctamente la mayoría de los individuos infectados por VIH, sin embargo, una parte de las muestras repetidamente reactivas en las pruebas de pesquisaje generan resultados indeterminados, que no pueden ser considerados como positivos o negativos y que constituyen el límite de resolución de esta prueba (2-4). El estudio de estos patrones indeterminados se basa en el seguimiento de los individuos por un período igual o mayor a seis meses a través del Western blot u otras pruebas suplementarias, ya sean serológicas o virológicas, siempre teniendo en cuenta los datos clínicos y epidemiológicos. No obstante, los resultados indeterminados constituyen una preocupación constante, tanto para la persona afectada como para el que diagnostica (2, 5). El algoritmo cubano de diagnóstico serológico del VIH incluye un sistema de Western blot en la etapa final de confirmación de las muestras de suero o plasma que resultan reactivas a los ELISA que se emplean en el pesquisaje (6). Cada año un número de personas resultan indeterminadas y requieren de seguimiento para esclarecer su condición serológica respecto al VIH. Para profundizar en el conocimiento de este grupo, se estudió la respuesta de anticuerpos a las diferentes proteínas virales en el Western blot de personas que resultaron indeterminadas en el algoritmo de confirmación del Laboratorio de Investigaciones del SIDA en Cuba (LISIDA). MATERIALES Y MÉTODOS Se analizaron con carácter retrospectivo, los patrones indeterminados ocurridos entre los años 2004 y 2005 en LISIDA, del total de muestras de suero (4498) estudiadas por Western Blot (DAVIH BLOT, Laboratorios DAVIH, La Habana, Cuba) provenientes de personas con antecedentes de reactividad a las pruebas de pesquisaje empleadas en los laboratorios de la red de diagnóstico de la infección por el VIH 1 en Cuba (UMELISA HIV 1+2 Recombinant, TECNOSUMA, Ciudad Habana, Cuba) y un segundo ELISA que se emplea en LISIDA como parte del algoritmo de confirmación (Vironostika HIV Uni-Form II Ag/Ab, biomérieux bv, Holanda). Se usó el criterio de interpretación del estuche, el cual coincide con el recomendado por la Organización Mundial de la Salud, que considera una muestra positiva cuando posee anticuerpos al menos a dos de las glicoproteínas codificadas por el gen de envoltura del VIH 1 (gp 41, gp 120 y gp 160), negativa cuando no posea anticuerpos a ninguna de las proteínas virales o solamente reactividad a la proteína de 17 Kd y como indeterminada cualquier muestra que no cumpla con los criterios anteriores (7). Se analizaron los patrones de bandas de las muestras con resultados indeterminados y se agruparon de acuerdo a su reactividad a las diferentes proteínas estructurales del VIH 1, para determinar la frecuencia de aparición de cada banda en los mismos. Se investigó la evolución serológica de 57 personas con 6 meses o más de seguimiento y que presentaban reactividad solamente contra las proteínas de 53 y/o 55 Kd, pudiendo estar presente entre estas, reactividad contra la proteína de 17Kd. Para el análisis de los resultados se empleó un programa estadístico para comparar proporciones, desarrollado en el Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria en La Habana, Cuba (8). 96

3 RESULTADOS En la tabla 1 se puede apreciar que 571 muestras resultaron indeterminadas, lo que representó el 12,7 % del total analizadas, además, las diferencias que se observaron entre los porcentajes de los años estudiados, no resultaron significativas desde el punto de vista estadístico. Se observó (Tabla 2) entre los sueros estudiados con resultado indeterminado, una mayor reactividad a la p55 y p53, las diferencias entre ellas y el resto de las proteínas fueron significativas estadísticamente para una p< 0,001. También resultó inferior la reactividad a las proteínas derivadas del gen env, respecto a la reactividad que presentaron los sueros al resto de las proteínas derivadas de los genes gag y pol. De las 57 personas que se estudió su evolución serológica (Tabla 3), el 84 % resultó negativa en el seguimiento, este porcentaje fue significativamente superior (p< 0,001) que el observado entre las que seroconvirtieron o que mantuvieron su patrón indeterminado. Es de significar que tres personas seroconvirtieron a pesar de solo presentar reactividad a las proteínas 55 y/o 53, con o sin reactividad a la p17. Tabla 1. Resultados indeterminados según año de estudio en el algoritmo cubano de confirmación de la infección por VIH 1 Muestras a confirmar Muestras según año de estudio Total Indeterminados % Indeterminados 10,7 14,5 12,7 DISCUSIÓN Las razones por las cuales ocurren la mayoría de los resultados indeterminados al VIH-1 en el Western blot son desconocidas, algunos investigadores han asociado este suceso con la presencia de auto anticuerpos, como el Factor reumatoideo y contra antígenos de linfocitos humanos (ALH), además de las alo inmunizaciones, debidas a transfusiones, trasplante o embarazo (5, 7, 10). En África es frecuente la presencia de reacciones indeterminadas y se asocian fundamentalmente a reactividad cruzada Tabla 2. Frecuencia de reactividad a las proteínas del VIH-1 en los patrones de Western blot indeterminados Genes estructurales del VIH - 1 Gag = Pol Env Proteínas del VIH * Letras distintas difieren estadísticamente para una p< 0,001 Frecuencia / % (n = 571) Comparación de proporciones* p / 47 C p / 38 DE p / 89 A p / 34 E p / 83 B p / 43 CD gp41 5 7/ 10 G gp / 8 G gp / 18 F Tabla 3. Resultados del seguimiento de personas con patrones indeterminados con anticuerpo solamente contra las proteínas de 53 y/o 55 Kd Evolución serológica por Western blot Frecuencia / % (n = 57) Comparación de proporciones* Negativos 48 / 84.2 A Indeterminados 6 / 10.5 B Positivos 3 / 5.3 B * Letras distintas difieren estadísticamente para una p < 0,001 97

4 Cabrera ES et al Estudio de patrones de indeterminados al Western blot en el algoritmo cubano de diagnóstico serológico del Virus de inmunodeficiencia humana con malaria, otros retrovirus, herpes simple, etc (11). La presencia de un resultado indeterminado nos obliga a descartar una infección temprana (seroconversión) o estadios finales de la enfermedad, pues en etapas avanzadas de las infecciones por VIH (SIDA) los pacientes tienen una débil respuesta de anticuerpos y sus patrones pueden ser indeterminados (12). Estudios previos demostraron que del 20 al 30% de las personas con resultados no reactivos al VIH 1 en ELISA y del 4 al 20% de los ELISA positivos son indeterminados en el Western blot (2). El porcentaje de indeterminados encontrado en este estudio (Tabla 1) en personas con reactividad repetida a las pruebas de ELISA que se emplean en el algoritmo cubano de confirmación de la infección por VIH - 1, se mantuvo en el rango antes mencionado, incluso fue inferior al observado en otros trabajos donde se emplearon diferentes tipos de Western blot (13-14). Se plantea que es frecuente observar que los indeterminados solo posean anticuerpos contra las proteínas del gen gag, (p17, p24 o p55) a pesar de que otros patrones pueden aparecer (12). Povoltsky et al 1991, observó una mayor frecuencia de reactividad a la proteína de 24 Kd, la cual estuvo presente entre un 50 y un 70 % de los indeterminados, además, señaló la importancia de los anticuerpos contra esta, al ser los primeros en aparecer en la seroconversión de personas infectadas por VIH (15). D. Cremonezi y col. (2005) al igual que I. H. Syed y col (2005) reportaron una mayor reactividad a la proteína de 24 Kd, al estudiar los patrones indeterminados al VIH 1 en el Western blot, en una población de embarazadas. Algunos investigadores plantean que las personas con patrones que solo presentan anticuerpos contra las proteínas de 53 y 55 Kd, se consideran con bajas probabilidades de seroconvertir, a diferencia de aquellos donde están presentes anticuerpos contra las glicoproteínas de envoltura como la gp 41, gp 120 o gp 160, a las que atribuyen una mayor especificidad (11, 16). Esto último coincide con los resultados del presente trabajo donde de modo significativo la reactividad a las glicoproteínas de envoltura fue inferior que la observada al resto de las proteínas virales, evidenciándose una vez más la especificidad de las proteínas codificadas por el gen env en el diagnóstico por Western blot. Un resultado indeterminado en el Western blot siempre es contradictorio para el personal que realiza el diagnóstico y para el paciente, es por eso que algunos investigadores han encaminado su esfuerzo en tratar de esclarecer el significado que tiene la reactividad a las diferentes proteínas del VIH 1 en los patrones indeterminados. Tebourski F.; A. Slim y A. Elgaaied (2004) relacionaron la reactividad a las proteínas del gen gag y pol con la infección por VIH 1 y observaron que la reactividad a las proteínas del gen pol estaba presente en la mayoría de los infectados por el VIH - 1, sin embargo, las personas con resultados indeterminados al Western blot expresaron de forma significativa, poca reactividad a la p 34, a diferencia de la respuesta a la p24, que sí estuvo presente en la mayoría de los patrones indeterminados, los resultados motivaron una propuesta de cambio en los criterios de interpretación, no obstante, de acuerdo a los resultados expresados en la Tabla 2, para nuestras condiciones la propuesta anterior resulta inapropiada. En otro estudio se propone el uso combinado de los criterios de la OMS y CDC al observar que personas con resultados indeterminados por ambos criterios eran negativas por PCR (18). Consideramos que si bien es cierto que esta propuesta eleva la especificidad del ensayo para la población estudiada con el estuche diagnóstico empleado, se debe ser cuidadoso en su aplicación bajo otras condiciones para no correr el riesgo de comprometer la sensibilidad del método. Los resultados de la evolución serológica (Tabla 3), coinciden con los de Mahé et al quién observó que usualmente las muestras con reactividad a las proteínas de 55, 66 o 53 Kd son clasificadas como indeterminadas cuando en realidad son negativas en más del 98 % de los casos (11). Consideramos que la escasa diferencia entre nuestros resultados y los observados por Mahé et al. 2002, pudo estar condicionada a las características de nuestra muestra, donde todos las personas tenían como antecedentes haber resultado reactivo a dos sistemas de ELISA, además, en todos los casos que seroconvirtieron se pudo comprobar riesgo epidemiológico. Si bien es cierto que es poco frecuente que un resultado indeterminado en el Western blot seroconvierta en estudios posteriores (2), es importante señalar que su significado varía dependiendo del riesgo epidemiológico, del status clínico y el perfil serológico de la persona ([12). La presencia de un pequeño grupo de indeterminados que seroconvirtieron y de otro que mantuvo su condición, en este trabajo, justifican la estrategia de seguimiento serológico y epidemiológico en personas con patrones de indeterminados al VIH 1 en el Western blot, aún cuando su reactividad sea solamente contra las proteínas de 53 o 55 Kd. Consideramos que los resultados obtenidos en este trabajo son útiles en el manejo de las personas con patrones indeterminados al Western blot, la constante validación de los estuches que habitualmente empleamos en el diagnóstico, nos ayuda en gran medida a conocer el valor de sus resultados. La práctica ha demostrado que el diagnóstico de VIH va más allá de un criterio de interpretación o el significado de la 98

5 reactividad a una proteína en particular, el éxito está en la conjugación de los resultados del laboratorio con la clínica y la epidemiología. REFERENCIAS 1. Cruz O, Pérez MT, Izquierdo M, Lobaina L, Rubial I, Silva E. Evaluación de un sistema de Western Blot (DAVIH BLOT) para la confirmación de anticuerpos al VIH 1. Rev Cubana Med Trop 1997;49(1): Syed IH, Balakrishnan P, Solomon SS, Murugavel KG, Kumarasamy N, Vidya S, et al. HIV-1 Western blot assay: What determines an indeterminate status? Indian J Med Sci 2005;59(10): Meles H, Wolday D, Fontanet A, Tesegave A, Tilaun T, Akililu M, et al. Indeterminate human immunodeficiency virus Western blot profiles in ethiopians with discordant screening-assay results. Clin Diagn Lab Immunol.2002;9(1): Ravanshad M, Mahboudi F, Sabahi F, Bayanolhagh S. Indeterminate human immunodeficiency virus western blot results in Iranian patients with discordant screening assay results. Saudi Med J. 2006;27(8): CremoneziI D, MesquitaI PE, Romão MM, Prestes- Carneiro LE. Prevalence of indeterminate human immunodeficiency virus western blot results in pregnant women attended at a public hospital in Presidente Prudente, Brazil. Braz J Infect Dis. 2005;9(6): Díaz HM, Pérez MT, Lubián AL, Nibot C, Cruz O, Silva E, Rolo F, Izquierdo M. HIV Detection in Cuba: role and results of the Nacional Laboratory Network. MEDICC Rev. 2011;13(2): World Health Organization. Acquired immunodeficiency virus (AIDS). Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2 and HTLV-I/HTLV-II. Wkly Epidemiol Rec 1990; 65(37): Sistema para comparación de proporciones. Versión 2.1, CENSASOF Doran TI, Parra E. False-positive and indeterminate human immunodeficiency virus test results in pregnant women. Arch Fam Med 2000;9(9): Grusky O, Roberts KJ, Swanson AN. Communicating indeterminate HIV Western blot test results to clients: an observational study of three community testing sites. AIDS Patient Care STDS 2006; 20(9): Mahé C, Kaleebu P, Ojwiya A, Whitworth JAG. Human immunodeficiency virus type 1 Western blot: revised diagnostic criteria with fewer indeterminate results for epidemiological studies in Africa. Int J Epidemiol 2002; 31(5): Constantine N. HIV Antibody Assays. HIV InSite Knowledge Base Chapter May 2006 Niel Regents of the University of California. the UCSF Center for HIV Information. Disponible en: jsp?page=kb (Consulta: mayo, ). 13. Elemuwa CO, Bassey BE, Olaleye DO. The problems of indeterminate HIV results in blood transfusion services in Nigeria. Trop Doct 2005; 35(3): Huang LJ, Liu CY, Chu SC, Wong WW, Lin YC, Liu WT, et al. Predictive value of two commercial human immunodeficiency virus serological tests in cases with indeterminate Western blot results. J Microbiol Immunol Infect 2006;39(3): Povolotsky J, Gold JW, Chein N, Baron P, Armstrong D. Differences in human immunodeficiency virus type 1 (HIV 1) anti-p24 reactities in serum of HIV- 1-infected and uninfected subjects: analysis of indeterminate Western blot reactions. J Infect Dis 1991;163(2): Kleinman S 1, Busch MP, Hall L, Thomson R, Glynn S, Gallahan D et al. False positive HIV-1 test results in a low-risk screening setting of voluntary blood donation. Retrovirus Epidemiology Donor Study. JAMA 1998;280(12): Tebourski F, Slim MA, Elgaaied A. Diagnosis of HIV-1 infection: importance of taking into account the anti-pol gene product reactivity in the interpretation of Western blot results. Immunol Lett 2004;94(1-2): Tebourski F, Slim A, Elgaaied A. The significance of combining World Health Organization and Center for Disease Control criteria to resolve indeterminate human immunodeficiency virus type-1 Western blot results. Diagn Microbiol and Infect Dis 2004;48(1): Correspondencia: Eladio Silva Edificio 42 C Apartamento 2 Villa Panamericana, Habana del Este, La Habana, Cuba. Departamentos de confirmación serológica y de Inmunotransferencia. Laboratorio de Investigaciones del SIDA, Carretera de Tapaste y Autopista Nacional, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. or infomed.sld.cu 99

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