HIV 1 & 2 CombFirm. Principio de la prueba. Introduccion

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1 Código: HIV 1 & 2 CombFirm S Formato: 3 x 6 pruebas Los resultados de las pruebas InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm son comparables a aquellos obtenido en el Western blot. En lugar de la necesidad de correr 2 blots que consumen tiempo, la reactividad para los anticuerpos a los VIH tipos 1 ó 2 puede confirmarse rápidamente en una prueba simple y sencilla. Principio de la prueba La prueba de InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un ensayo inmunoenzimatico indirecto de fase sólida (EIA). La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ( dientes ). Cada peine tiene 6 pares de dientes, con seis puntos de antígeno por par (3 puntos en cada diente). El diente izquierdo de cada par tiene un punto superior sensibilizado con inmunoglobulina humana (control interno), y los dos marcadores p24 (gag) y p31 (pol). El diente derecho tiene tres puntos de proteína derivadas de env gp41, gp120 y gp36. La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F), cada fila contiene una solución de reactiva lista para uso en diferentes fases del análisis. La prueba se desarrolla fase por fase, desplazando el peine de una fila a la otra, con incubación en cada una de las fases. Para iniciar la prueba se adicionan muestras de suero o plasma al diluyente en los pozos de la fila A de la bandeja de desarrollo. Luego el peine se inserta en los pozos de la fila A. Los anticuerpos Anti-VIH, si están presentes en las muestras se enlazaran específicamente a los antígenos de VIH sobre los dientes del peine (figura 1). Los componentes no ligados se lavan en la fila B. En la fila C, el Anti-VIH IgG capturado en los dientes, y la inmunoglobulina humana en las puntos superiores (control interno) reaccionarán con los anticuerpos anti IgG humanos marcados con fosfatasa alcalina (). En las siguientes dos filas los componentes no unidos se remueven lavando. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionará con componentes cromogénicos. Los resultados son visibles como puntos gris-azulados en la superficie de los dientes del peine. Para uso diagnóstico in vitro solamente El kit InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es una prueba confirmatoria. La prueba confirma la presencia del virus de inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2), incluyendo el VIH-1 subtipo O, en las muestrasde suero o plasma humano inicialmente VIH reactivos. Pueden desarrollarse 18 pruebas con una kit. Introduccion El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Dos tipos, el VIH-1 y el VIH-2, han sido identificados, presentando pronósticos y tasas de transmisión diferentes. Las rutas principales de la transmisión del VIH son el contacto sexual, la contaminación por productos sanguíneos o por sangre, y la transmisión de madre a hijo. El VIH predominantemente infecta los linfocitos CD4, los cuales juegan un papel clave en el sistema humano. La disminución progresiva de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad lleva a una condición inmunocomprometida, facilitando infecciones oportunistas, con consecuencias fatales. El virus VIH consta de una molécula de RNA genómica asociada con una transcriptasa reversa, protegida por una cáspide y una envoltura. La envoltura del virus es el objetivo principal para la respuesta del anticuerpo humoral. Por consiguiente, las pruebas de tamizaje de VIH altamente sensibles están principalmente basadas en la detección de anticuerpos contra antígenos derivados de los componentes de la envoltura (env). Para distinguir las reacciones reales de las falsas, un resultados positivo mediante un análisis de tamizaje debe re-probarse y confirmarse mediante una prueba de alta especificidad. La confirmación serológica de una infección de VIH, comúnmente desarrollada usando el análisis Western blot se basa en la detección diferencial de anticuerpos dirigidos contra los antígenos VIH. La prueba InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm emplea cinco antígenos recombinantes distintos y sintéticos para la determinación serológica rápida del perfil de anticuerpos VIH. Dos antígenos son proteínas pol y gag-derivadas de ambos tipos de VIH, mientras que tres antígenos son péptidos o proteínas del env, específicas para el VIH-1 o el VIH-2. Los antígenos se posicionan separadamente a concentraciones fijas y libres de los antígenos tisulares, los cuales pueden contaminar las preparaciones de antígenos a partir de lisados vírales comúnmente usados en los análisis Western blot. anticuerpo Conjugado anti-igg humano sustrato cromogénico Figura 1. Princio de la prueba Formación del complejo: péptido de HIV - anticuerpo; 30 min Unión del conjugado anti-igg humano; 20 min Reacción enzimática de color; 10 min El kit incluye un control positivo (anticuerpos anti VIH-1 y VIH-2) y un control negativo que debe incluirse en cada corrida del análisis. Al terminar la prueba, el par de dientes usados con el control positivo debe mostrar todos los 6 puntos gris-azulados, y aquella usada con el Control Negativo debe indicar únicamente el punto de control interno. El punto de control interno también debe aparecer en todos los demás dientes para confirmar que el kit funciona adecuadamente y que la prueba ha sido desarrollada de forma correcta. Contenido del kit Peines El kit contiene tres peines plásticos, cada peine tiene 6 pares de dientes, un par para cada prueba (Figura 2). Ambos dientes de un par llevan números idénticos. Cada par de dientes está sensibilizado en seis áreas reactivas: Posicion El diente izquierdo En el diente derecho Superio Inmunoglobulina Humana (Control Interno) Media Proteína recombinante del core derivada de gag la p24 (reconocidas por los anticuerpos al ViH-1 y al VIH-2) Glipropoteína recombinante derivada de env-vih-1 la gp 120. Glicoproteina env gp 41 derivada de péptidos sintéticos VIH-1 de la transmembrana Inferior Proteina derivada de pol Gliproproteina env recombinante p31(reconocidas transmembrana VIH-2 por los anticuerpos al VIH-1 y al peptido sintético Derivado de VIH-2) gp36 1

2 ImmunoComb II Almacenamiento del kit Almacene el kit en su caja original entre 2 y 8 C. Bajo estas condiciones, el kit permanecerá estable hasta la fecha de vencimiento en la etiqueta. No congele el kit. Figura 2. Peine Interno Control p24 p31 gp120 gp41 gp36 Los peines se suministran en empaque de aluminio que contiene una bolsa de secante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, con unacubierta de aluminio, cada Bandeja de Desarrollo contiene todos los reactivos necesario para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consta de 6 filas (A-F). La fila A se divide en 6 pozos, mientras que las demás filas se dividen en 12 pozos cada una. El contenido de cada fila es el siguiente: Fila A diluyente de la muestra Fila B solución de lavado Fila C anticuerpos anti-igg humanos de cabra marcados con fosfatasa alcalina. Fila D Solucion de lavado Fila E Solucion de lavado Fila F solución de substrato cromogénico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT). Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperaturas de 2 a 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a -20 C o a temperaturas más bajas. Todas las muestras congeladas deben centrifugarse a rpm, por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover cuidadosamente el líquido sobrenadante. Si se forma una capa de lípidos en la superficie, asegurese de tomar la muestra del líquido claro debajo de la capa. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario. Pipeta de precisión con puntas desechables para dispensar 50 ul. Tijeras. Cronómetro o reloj de laboratorio. Preparacion de la Prueba Lleve todos los componentes, bandejas de desarrollo, peines, reactivos y muestras a temperatura ambiente (22 a 26ºC). y desarrolle la prueba a temperatura ambiente. 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C durante 30 minutos; o déjela a temperatura ambiente (22 a 26ºC), durante 3 horas. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente para poder desecharlo como desperdicio bio-contaminante al final de la prueba. 3. Mezcle los reactivos agitando la Bandeja de Desarrollo. NOTA: No remueva la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo. Rompa la cubierta del estuche usando una punta desechable de la pipeta o el perforador, únicamente cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Figura 3. Bandeja de Desarrollo Control positivo-1frasco (tapa de color rojo) de 0.4 ml de plasma positivo humano diluido para anticuerpos anti-vih-1 y anti-vih-2, inactivados mediante la adición de b-propiolactona y por tratamiento de calor. Control negativo-1 frasco (tapa de color verde) de 0.4 ml de plasma humano inactivado por calor diluido, negativo para anticuerpos al VIH. Perforador-para perforación de la cubierta de aluminio que cubre los pocillos de la bandeja de desarrollo. Seguridad y Precauciones El kit es únicamente para uso de diagnóstico in-vitro. Maneje el Control Positivo como si fuese potencialmente infeccioso e incluso cuando haya sido inactivado. Todos los demás materiales de origen humano usados en la preparación de los controles fueron probados y se encontró que no eran reactivos para antígeno de superficie de la Hepatitis B, para anticuerpos al virus de Hepatitis C y al virus del VIH. Debido a que ningún método de prueba puede proporcionar una seguridad completa de la ausencia de contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todos las muestras humanas deben manejarse como potencialmente infecciosos. Use siempre guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para trabajar con suero o plasma humano. No pipetee con la boca. Deseche todos las muestras, peines usados*, Bandejas de Desarrollo, y otros materiales usados con el kit como desechos bio-contaminante. * A menos que sea archivado para consulta posterior No mezcle los reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de vencimiento. Preparación del peine. Precaucion Para asegurar un funcionamiento adecuado de la prueba, no toque los dientes del peine. 1. Abra el empaque de aluminio del peine por el borde punteado. Remueva el peine. 2. Usted puede usar todo el peine y la Bandeja de Desarrollo solamente una parte de ellos. Para usar una sola parte del peine haga lo siguiente : a. Determine cuantos pares de dientes necesita para probar las muestras y controles. Usted necesita solo un par dientes para cada prueba. Cada par de dientes muestra el número de código 34 del kit para permitir la identificación de los dientes desprendidos. b. Doble y rompa el peine verticalmente o córtese con tijeras (véase figura 4), para desprender el número requerido de pares de dientes (número de pruebas incluyendo 2 controles). c. Devuelva la parte no usada del peine al empaque de aluminio (con la bolsa de secante). Cierre y ajuste el empaque. Por ejemplo, con un gancho para papel, para mantener seco el empaque. Almacene el peine en la caja del kit original a 2-8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Fraccionamiento del Peine Instrucciones de la prueba Reacción Antígeno-Anticuerpo (fila A de la Bandeja de Desarrollo). 1. Pipetee 50 ul de la muestra. Perfore la cubierta de aluminio en el pozo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta de 2

3 la pipeta o con el perforador y dispense la muestra en el fondo del pozo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución. Deseche la punta de la pipeta. 2. Repite el pásoe 1 para los otras muestras, incluyendo un Control Positivo y un Control Negativo suministrado con el kit. Use un pozo nuevo en la fila A y cambie las puntas de la pipeta para cada muestra o Control. 3. a. Inserte el peine (la parte impresa frente a Usted) en los pozos de la fila A que contienen las muestras y controles. Mezcle: retire e inserte el peine en los pozos varias veces. b. Deje el peine en la fila A durante exactamente 30 minutos. Active el cronómetro. Al aproximarse a los 30 minutos, perfore el papel de aluminio en la fila B usando el perforador. No abra más pozos de los necesarios. c. Al final de los 30 minutos, tome el peine y sáquelo de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal de los dientes. Primer lavado (fila B). 4. Inserte el peine en los pozos de la fila B. Agite: retire e inserte vigorosamente el peine en los pozos durante por lo menos 10 segundos para lograr un lavado adecuado. Repita el agitamiento varias veces durante el transcurso de 2 minutos; mientras tanto perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido como en el paso 3c. Unión del conjugado (fila C). 5. Inserte el peine en los pozos de la fila C. Mezcle tal como en el paso 3a. Active el cronómetro durante 20 minutos. Perfore el papel de aluminio de la fila D. Después de 20 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido. Segundo lavado (fila D). 6. Inserte el peine en los pozos de la fila D. Agite repetidamente durante 2 minutos, tal como en el paso 4. Mientras tanto perfore el papel de aluminio de la fila E. Después de 2 minutos retire el peine y absorba el líquido adherido. Tercer lavado (fila E) 7. Inserte el peine en los pozos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos, mientras tanto perfore el papel de aluminio de la fila F, después de 2 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido. Reacción de Color (fila F) 8. Inserte el peine en los pozos de la fila F. Mezcle. Active el cronómetro durante 10 minutos. Después de 10 minutos retire el peine. Detención de la Reacción (fila E). 9. Inserte nuevamente el peine en la fila E. Despues de 1 minuto, retire el peine y deje secar al aire. Diposicion de Desechos Deseche las bandejas de desarrollo, puntas de pipeta, papel absorbente, y guantes como desechos bio-contaminantes Almacenamiento partes no usadas del kit Bandeja de Desarrollo Si usted no usó todos los pozos de la bandeja de desarrollo, puede almacenarla para uso posterior: Selle los pozos usados con cinta adhesiva ancha de manera que no se derrame nada por fuera del pozo, incluso si la bandeja de desarrollo se voltea. Otros materiales del kit Vuelva a colocar la Bandeja de Desarrollo, Peines, perforador, controles y las instrucciones en la caja originaldel kit. Almacene de 2º a 8ºC. Resultados de la prueba Validación Para confirmar que todas las pruebas funcionan adecuadamente y demuestran que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (véase figura 5). 1. El Control Positivo debe producir 6 puntos de color azul grisáceo sobre la superficie del peine en el par de dientes. 2. El control negativo debe producir una punto superior (control interno) en el diente izquierdo del par y ningun otro punto. 3. Cada muestra probada debe producir una punto superior (control interno) en el diente izquierdo del par. Si ninguna de estas tres condiciones se cumplen, los resultados son inválidos, y las muestras y controles deben volverse a probar. Contro Positivol Contro Negativol Resultados Inválidos Figura 5. Validación de la prueba Interpretación de los Resultados La sola aparición del control interno indica que la muestra correspondiente es negativa para los anticuerpos VIH-1 o VIH-2. Una muestra que produce solamente un punto circular aislado, coloreado de antígeno VIH, o ambos puntos, p24 y p31 sin un punto en el diente derecho, se considerada indeterminada. Una muestra que produce mínimo 2 puntos circulares coloreados de antígenos de VIH, incluyendo uno que representa al gp41 o al gp36 (véase figura 2) se define como VIH positivo. En éstos caso la diferenciación entre el VIH-I y el VIH-2 puede obtenerse de la siguiente forma: Ausencia de un punto para el gp36 y presencia del gp41 y/o gp120 indica que la muestra es positiva para los anticuerpos VIH-1. Presencia de un punto para el gp36 indica que la muestra es positiva para los anticuerposl VIH-2. Los patrones más prevalentes y su interpretación se resumen en la tabla 1. Tabla 1. Interpretación de los resultados. Puntos de HIV presentes en Interpretacion Diente izquierdo Diente derecho Positivo p24 y/o p31 gp41 Sin punto gp41 y gp120 HIV-1 p24 y/o p31 gp36 solo o con gp41 HIV-2 p24 y/o p31 gp36 y gp41 y gp120 HIV-2 solo, o Coinfección con HIV-1 p24 y/o p31 Sin punto o gp120 Sin punto gp41 o gp120 y/o gp36 } Indeterminate Sin punto Sin punto Negativo Importante Cualquier punto ligeramente coloreado en los dientes debe interpretarse como reactiva. En caso de resultado indeterminado, tome una nueva muestra de sangre y repita la prueba. Documentación de los resultados Debido a que el color desarrollado sobre el peine es estable, los peines pueden almacenarse para documentación. Limitaciones El InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un análisis suplementario dirigido a confirmar la presencia de los anticuerpos a los antígenos de VIH en las muestras inicialmente reactivas. En ausencia de criterios uniformemente aceptados para la interpretación de los perfiles de VIH, la interpretación arriba descrita debe considerarse como una guía recomendada. De todas formas, la reactividad para anticuerpos para el VIH-1 y VIH-2 no debe considerarse como un criterio único para el diagnóstico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o para la infección con el VIH. Debido a que la producción de anticuerpos puede retrasarse después de la exposición inicial al VIH o puede suprimirse debido a una condición inmunocomprometida de un paciente, un resultado negativo con ésta prueba no debe considerarse como evidencia concluyente de que el paciente no ha estado expuesto o ha sido infectado por el VIH. Características del Ensayo* Un estudio multicéntrico se ha llevado a cabo en 559 muestras incluyendo 154 individuos VIH negativos, 318 pacientes VIH-1 positivos, 35 pacientes que fueron positivos con el examen ELISA e indeterminados (Ind) para VIH-1por el análisis Western blot (WB), tanto como 52 individuos que fueron positivos por el examen ELISA y negativos con el WB. La población negativa incluyó mujeres embarazadas, personas con enfermedades auto-inmunes y con infección de Hepatitis. Los resultados estan detallados en la siguiente tabla 2. *Datos detallados se suministran bajo solicitud. 3

4 Tabla 2. Estudio Multicéntricoa HIV-1 Condición ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm ELISA WB Negative HIV-1 Ind. Positive Negativo Negativo Positivo Positivo Ind. 20 b 6 9 Negativo A Resultados preliminares B incluyendo 6 WB que muestran únicamente p17 o p55. Leyenda de los símbolos CARD ImmunoComb tarjeta PLATE Bandejas de Desarrollo CONTROL + Control positivo CONTROL - Control negativo Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los siguientes reultados inequívocamente negativos o positivos. Sensibilidad % Especificidad - 100% B. MUESTRAES DE PACIENTES DE ORIGEN AFRICANO Se llevo a cabo un estudio en muestras de individuos de origen africano. La población consistió de 48 individuos VIH negativos, 51 pacientes infectados con VIH-1, 84 infectados con VIH-2, y 9 coinfectados con VIH-1 y VIH-2. Los resultados se detallan en la tabla 3. Tabla 3. Especímenes de origen africano ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm HIV Condicion a Neg. HIV 1 HIV 2 HIV Ind. 1+2 Negativo HIV HIV b HIV Positivo A Por ELISA y WB B Reactivo solamente con el gp36. Los datos, excluyendo resultados indeterminados, muestran un 100% de sensibilidad y especificidad para el VIH. Todos las muestras VIH-1 positivas, incluyendo 5 con el subtipo O, fueron correctamente identificados. Entre las muestras VIH-2 positivas 10 mostraron reacción cruzada contra el gp120, rmostrando una especificidad diferencial general del 93.8% PERFORATOR IVD Σ n REF LOT Perforador Consulte las instrucciones de uso Atención,ver instrucciones de uso Producto sanitario para diagnóstico in vitro Limite de temperatura Contenido suficiente para n ensayos Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Número de serie Bibliografia Centers for Disease Control Interpretation and use of the Western Blot assay for serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus type 1 infections. MMWR 38 (S-7): 1-4. Dax EM HIV testing and staging, disease progression, and markers. Curr Opinion Infect Dis 6: Groopman JE, Chen FW, Hope JA, Andrews, JM, Swift RL, Benton CV, Sulllivan JL, Volberding PA, Sites DP, Landesman S, Gold J, Baker L, Craven D, Boohes FE Serological characterization of HTLV-III infection in AIDS and related disorders. J Infect Dis 153: Higgins JR, Pederson NC, Carlson JR Detection and differentiation by sandwich enzyme-linked immunosorbent test for human T-cell lymphotropic virus III, lymphadenopathy-associated virus (LAV) and acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus-like clinical isolates. J Clin Microbiol 24: Jackson JB testing for human, Balfour HH Practical diagnostic immunodeficiency virus, Clin Microbiol Rev 1: Lacroix M, Penney CL, Dwyer RJ, Stern MD, Bellini F, Dionne G, Tsoukas C A peptide-based microtiter ELISA kit for the detection of antibodies to HIV-1 and to HIV-2, Fifth International Conference on AIDS. Montréal. W.B.P.111. Gnann Jr,JW, McGormick JB, Mitchell S,Nelson JA, Oldstone Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV type 1 and type 2 infections. Science 237: Myers RA, Patel JD, Joseph JM Identifying HIV-2-seropositive individuals by reevaluating HIV-1 indeterminate sera. J Acquir Immunedef Syndr 5: Sarngadharan MG, Veronese F, Lee S, Gallo RC Immunological properties of HTLV-III antigens recognized by sera of patients with AIDS and AIDS-related complex and of asymptomatic carriers of HTLV-III infection. Cancer Res 45:4574s-4577s. Version: (05/2009) 4

5 Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs. a temperatura ambiente o 20 min. a 37 C Tomar las muestras y controles Agregar muestras y controles en la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar Perforación de la fila B Absorber liquido adherido a los dientes Insertar Peine y agitar en la fila B. Incubar Después de mezclar/agitar e incubar en filas C, D y E Reacción de color en la Resultados fila F Resumen del Procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 CombFirm. (Para instrucciones detalladas favor de referirse al texto completo) 1. Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente. 2. Vierta 50 µl de cada muestra y control en pocillos separados de la fila A de la Bandeja de Desarrollo y mezcle. 3. Inserte el Peine en la fila A y continúe segun se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Paso Fila Proceda como se indica Reacción antígeno-anticuerpo A Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión del Conjugado C Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Lavado D Agite; incube 2 minutos; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de Color F Mezcle; incube 10 minutos. Detención de la reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. Manera de romper el Peine 1 2 5

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