INGENIERÍA GENÉTICA 2010 SDS-PAGE. (SDS polyacrilamide-gel electrophoresis)

Transcripción

1 (SDS polyacrilamide-gel electrophoresis)

2 Qué es electroforesis? ANIONES (-) + ÁNODO CATIONES (+) - CÁTODO

3 La poliacrilamida posee ciertas características que la hacen útil para ser usada en electroforesis: i) termo-estabilidad, ii) transparencia, iii) resistencia, iv) químicamente inerte, v) se pueden preparar varios tamaños de poro, vi) resiste grandes gradientes de voltaje, vii) permite realizar varias tinciones de proteínas, viii) se pueden extraer las proteínas, ix) se puede secar

4 Acrilamida. Autopolimeriza espontánea pero muy lentamente. En presencia de radicales libres, el proceso se ve acelerado. Éstos provienen del APS en presencia de TEMED. Los polímeros que se forman, sin embargo, sólo forman una solución viscosa porque las cadenas se deslizan una sobre otra. La bisacrilamida es capaz de unir cadenas de acrilamida entre sí (crosslinker), llevando a la formación de un gel.

5 %T (densidad del gel) = (g acrilamida + g bisacrilamida) 100 ml %C (entrecruzamiento) = g bisacrilamida (g acrilamida + g bisacrilamida) x 100 x 100

6 Sistema de geles verticales para

7 El SDS (detergente iónico) permite independizarse de la forma y la carga de las proteínas. Al quedar desnaturalizadas, las proteínas adquieren cargas negativas de una manera proporcional a su peso molecular. - - Grupos cargados Regiones hidrofóbicas H + H H

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9 Muestra A esta se le añade un buffer que contiene SDS, b-mercaptoetanol o DTT Ambos son agentes reductores y se usan para i) terminar de desnaturalizar proteínas con puentes disulfuro intracatenarios y ii) desarmar estructuras cuaternarias mantenidas por las mismas uniones El buffer además posee: glicerol y azul de bromofenol La muestra se calienta a C por 3-5 min y está lista para ser sembrada en el gel

10 Una vez que la muestra y el gel están listos, se siembra en las calles y se aplica voltaje para que las muestras migren El sistema que usaremos es un gel discontinuo (el más comúnmente usado) que consiste en dos porciones de gel diferentes: Stacking gel y Resolving gel Stacking gel Resolving gel

11 - Tris-HCl ph 6,8 Tris-Glicina ph 8,3 Tris-HCl ph 8,8 + El buffer de corrida (ph 8,3) posee Tris-Glicina, mientras que el Stacking y el Resolving gel poseen buffer Tris-HCl ph 6,8 y ph 8,8 respectivamente. Al aplicar voltaje, los iones Cl - al igual que las proteínas (cargadas negativamente), comienzan a migrar hacia el polo +

12 - + En el stacking, los iones Cl - marcan el frente de corrida por su alta relación q/m. El ph del stacking -6,8- desplaza levemente el equilibrio de la glicina (pi 6,1) hacia la forma cargada negativamente, haciendo que ésta migre lentamente. De este modo se genera una zona de alta resistencia, localizada entre los iones Cl - y la glicina. Dado que las proteínas no pueden migrar más rápido que los iones Cl -, sumado a que se utiliza un porcentaje bajo de acrilamida (3-5%), las proteínas tienden a apilarse en esta zona de baja conductancia.

13 - + Una vez que llegan al gel resolvedor (ph 8,8), la glicina gana cargas negativas y el voltaje se hace homogéneo a lo largo del gel. Desde aquí, el factor clave en la migración de las proteínas es el % de acrilamida y las proteínas migran de acuerdo a su peso molecular

14 O: Origen de siembra A: Stacking gel B: Resolving gel C: Interfase

15 HOJA DE RUTA. Gel discontinuo: Stacking gel (concentración de la muestra) Running gel (separación)

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17 La resolución va a depender del %T: 15%: kda 10%: kda 5%: kda

18 Geles con gradiente de acrilamida

19 Migración de proteínas en geles de SDS a distintas concentraciones de acrilamida (%T). Se muestra la migración de nueve proteínas que van desde 94 kda 14,4 kda.

20 Visualización: tinción de proteínas totales Coomassie brillant blue Nitrato de plata Método Límite de detección Coomassie R ng Coomassie G-250 Plata ng 1-10 ng

21 Determinación del peso molecular - Se realiza un corriendo en paralelo proteínas de PM conocido con la proteína de tamaño desconocido. - Se grafica la movilidad de los fragmentos conocidos en función del logaritmo de su PM (relación lineal inversa). - Se interpola la movilidad del fragmento desconocido y así podemos determinar su PM.

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23 Algunas aplicaciones del Evaluar los componentes de una muestra compleja (ej. lisado bacteriano) Determinación del peso molecular Evaluación de la eficiencia de un paso de purificación Evaluar la inducción de proteínas recombinantes en un cultivo bacteriano Primer paso de un Western Blot Segundo paso de una electroforesis en gel en 2D (el primer paso es un Isoelectroenfoque)

24 En nuestro TP Purificación GST GST-hnRNP K GST-MDM2 Armado de geles 15 % (x 2) 8 % (x 2) 6 % (x 2) Tinción con Coomassie brillant blue Cuantificación de las proteínas

25 GST BSA: 100 ng/ l

26 GST-hnRNP K BSA: 100 ng/ l

27 GST-MDM2 BSA: 100 ng/ l

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29 Western Blot

30 Western Blot (Immunoblotting) Provee información acerca de la presencia, peso molecular y abundancia de un antígeno específico por combinar la separación de proteínas por con el reconocimiento específico de antígenos por anticuerpos. Ya que la electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, sólo pueden utilizarse para WB anticuerpos que reconozcan la forma desnaturalizada del antígeno.

31 Comparación de proteínas observadas por y WB sobre una misma muestra Western Blot

32 PASOS DE UN WESTERN BLOT: 1) 2) Transferencia a membrana 3) Bloqueo 4) Incubación con anticuerpo primario 5) Incubación con anticuerpo secundario 6) Detección

33 HOJA DE RUTA

34 1)

35 HOJA DE RUTA. Gel discontinuo: Stacking gel (concentración de la muestra) Running gel (separación)

36 %T (densidad del gel) = (g acrilamida + g bisacrilamida) 100 ml %C (entrecruzamiento) = g bisacrilamida (g acrilamida + g bisacrilamida) x 100 x 100

37 2) Transferencia a membrana

38 TRANSFERENCIA Una vez finalizada la corrida, las proteínas son (electro)transferidas a una membrana (nitrocelulosa o PVDF)

39 Electrotransferencia (blotting) - +

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41 La transferencia puede hacerse en 2 condiciones: 1)Húmeda Buffer de transferencia: Tris-Glicina 1X + metanol 20% Semi-seca Más rápida. No recomendada para proteínas mayores a 100 KDa

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44 Visualización de las proteínas en el gel pre-transferencia: NO Coomassie brillant blue ya que produce una tinción irreversible. Tinción con cobre (CuCl2), luego los geles pueden ser desteñidos completamente por varios lavados en 0,1-0,25 M Tris/0,25 M EDTA ph 8. Visualización de las proteínas en la membrana: Ponceau Red Visualización de las proteínas en el gel post-transferencia: Coomassie brillant blue para chequear la eficiencia de la transferencia.

45 3) Bloqueo

46 Evita pegado inespecífico de los anticuerpos a la membrana Soluciones de bloqueo: Fuente de proteínas: BSA o leche en polvo descremada Detergente: Tween-20 o Tritón X-100 (entre 0,05 y 0,2%) Receta solución de bloqueo del TP: TBS 1X Tween-20 0,1% Leche en polvo descremada 5% (Svelty 0% grasa)

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48 4) Incubación con anticuerpo primario

49 3 clases de anticuerpos: Anticuerpos que reconocen al antígeno independientemente de su conformación. Anticuerpos que reconocen sólo epitopes específicos de la forma nativa del antígeno. Anticuerpos que reconocen sólo formas desnaturalizadas de la proteína.

50 Puntos clave en la incubación de la membrana con la solución de anticuerpo primario: Dilución del anticuerpo primario: (1:100-1:3000), sn. de bloqueo o TTBS sin agente bloqueante. Tiempo de incubación: varía de pocas horas a ON, depende de la afinidad del anticuerpo por el antígeno y de la abundancia del antígeno. Temperatura de la incubación: T amb o 4 C. Si se incuba ON poner a 4 C. Con agitación. Cantidad y duración de los lavados. Parámetros que dependen de cada complejo antígeno-anticuerpo

51 En nuestro TP Anticuerpo primario Recuperar los anticuerpos (son muy caros y peden reutilizarse)!!!!!!

52 5) Incubación con anticuerpo secundario

53 Puntos clave en la incubación de la membrana con la solución de anticuerpo secundario: Dilución del anticuerpo secundario: (1:1000-1:20.000), sn. de bloqueo o TTBS sin agente bloqueante. Tiempo de incubación: 1-2 horas. Temperatura de la incubación: T amb. Con agitación. Cantidad y duración de los lavados. Parámetros que dependen de cada complejo antígeno-anticuerpo

54 En nuestro TP Anticuerpo secundario anti-igg de ratón o anti-igg de conejo dependiendo de la especie del anticuerpo primario, conjugado a peroxidasa de rabanito (HRP). Dilución 1: en solución de bloqueo.

55 6) Detección

56 DETECCIÓN Existen diferentes métodos para la detección de la proteína de interés

57 Western blot: sistemas de detección colorimétrica Ac 2 ario conjugado a Ez Ac 2 ario conjugado a Biotina + Avidina-Ez Ez: Peroxidasa de rabanito (HRP) Fosfatasa alcalina (AP)

58 Western blot: sistemas de detección quimioluminiscente

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60 Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents High sensitivity: broad dynamic range on film and imager, which allows a quantitative detection. Chemiluminescent and chemifluorescent detection. Extended signal duration - up to 24 h - enables multiple exposures to be made. Compatibility with Hybond ECL and Hybond-P membranes. Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent High signal intensity and sensitivity allows the use of highly diluted primary and secondary antibodies with no reduction in sensitivity. Stable signal allows multiple exposures and makes the reagent suitable for large experimental series, allowing convenient handling time between the end of the experiment and detection. Optimized for imaging with ImageQuant LAS 4000 (CCD-based imaging) and compatible with Amersham Hyperfilm. Compatible with Rainbow Molecular Weight Markers and Amersham ECL DualVue Western Blotting Markers. Optimized for use with Amersham Hybond P (PVDF) membranes and compatible with Amersham Hybond- ECL (nitrocellulose) membranes. Ge Healthcare:

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63 Quimioluminiscencia Revelado con películas autorradiográficas Imágenes digitales. Los aparatos de última generación no sólo detectan quimioluminiscencia (Ac 2 ario -HRP) sino fluorescencia (Ac 2 ario -fluorocromo) Odyssey Infrared Imaging System STORM Analysers

64 Detection kits For HRP-conjugated antibodies: ECL and ECL+ (home made or commercially available) are the traditional kits used and we recommend ECL+. For the new generation detection machines such as Genegnome, use the detection kit recommended by the manufacturer of the machine. We do not recommend ECL or BCIP/NBT detection kits as they are not as sensitive. X-ray films Manual film development is traditionally used and enables the scientist to control the incubation time of the x-ray film in the developing agent and fixation agent. Automated x-ray film developers are also widely used and easy to use. Remember that an over-exposed film is not suitable for analysis as determination of the relative amount of protein is not possible. Overexposed films show totally black bands with no contrast, and/or numerous non-specific bands. Digital images: The new generation of film developers are units with a camera inside an enclosure, removing the need for a darkroom. The camera detects the chemiluminescence emanating from the membrane, transforming the signal into a digital image for rapid analysis with software provided with the detection machine. A range of machines are now commercially available. At the front of the next generation are systems which do not use HRP-conjugated antibodies (i.e chemiluminescence): for example, STORM Analysers detect fluorescence from fluorochrome-conjugated secondary antibodies. The Odyssey Infrared Imaging System detects infrared fluorescence.

65 The LI-COR Odyssey Infrared Imaging System is useful for detecting infrared dyes. It is a two channel laser-based infrared detection system made by LI-COR Biosciences. It provides high sensitivity, multiplexing capabilities and accurate quantitation. The instrument can be used to identify fluorescent molecules that excite at 680 nm and emit at 700 nm in one channel, and molecules that excite at 780 nm and emit at 800 nm in the second channel.

66 The Odyssey Fc System can acquire images in both fluorescent and chemiluminescent modes. IR Fluorescence: Lasers are used to excite 700 nm and 800 nm IRDye fluorophores for 2 channel detection. Fluorescent emission is then detected to generate an image of the sample. At these IR wavelengths, membrane autofluorescence is very low. This method directly detects the fluorescently labeled conjugates. Because the fluorescent signal is very stable, samples can be archived and re-imaged. Chemiluminescence: Luminol substrate is applied to the sample, and is oxidized by horseradish peroxidase (HRP) enzyme in a light-generating reaction. This method is indirect, because it relies on the enzymatic reaction to report the location of the HRP conjugate. Chemiluminescent signals are dynamic and time-dependent. Light emission is initially strong, but diminishes over time.

67 Revelado: fluorescencia vs. Quimioluminiscencia LI-COR ODYSSEY

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69 Thermo Scientific: DyLight Fluorescent Western Blotting Kits Complete kits for dual-fluorescent (549/649) and dual-infrared (680/800) Western blot detection, complete with corresponding fluorescent MW markers.

70 Revelado: fluorescencia vs. Quimioluminiscencia LI-COR ODYSSEY: Rango lineal

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72 Clean-Blot IP Detection Reagent and Kit Specially formulated AP and HRP conjugates for clear, specific Western Blot detection with immunoprecipitation (IP) experiments. Figure 2: Easily distinguish your target protein on Western blot with Clean-Blot IP Detection Reagent (HRP). Mouse liver extract (50 µg) total protein was separated on a Bio-Rad Criterion gel, transferred to PVDF membrane and blocked with 1% milk in TBST. The membrane was probed with mouse monoclonal anti-cdk1 (LabVision) (0.2 µg/ml) and goat anti-mouse HRP (0.16 µg/ml) or Clean-Blot IP Detection Reagent (HRP) (0.2 µg/ml).

73 Far-Western Blot Kit for Biotinylated Proteins Far-Western blotting is the method of probing a membrane containing transferred protein with another protein to detect specific protein-protein interactions. ProFound Far-Western Biotinylated-Protein:Protein Interaction Kit This kit utilizes biotin modification of a purified "bait" protein probe. Prey proteins separated in-gel or transferred to a membrane can be probed with this biotinylated bait. Detection of an interaction with "prey" protein(s) is achieved with a streptavidin-horseradish peroxidase conjugate and a chemiluminescent substrate.

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76 Pelisch et al. J Biol Chem :

77 Barrionuevo et al. J Immunol :

78 Barrionuevo et al. Clin Exp Immunol :

79 Applications Immunological detection (with known Ab) Identification of antigens recognized by unknown Abs (serum) Evalutaion of cross reactivity Can be used after either 1D-electrophoresis or 2D-electrophoresis