VI JORNADA DE FORMACIÓN INTERHOSPITALARIA DEL LABORATORIO CLÍNICO

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1 VI JORNADA DE FORMACIÓN INTERHOSPITALARIA DEL LABORATORIO CLÍNICO

2 3. TÉCNICAS EN EL LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD PATRICIA MORAIS FERREIRA RI. BIOQUÍMICA CLÍNICA

3 PRINCIPALES TÉCNICAS DE INMUNOANÁLISIS Aglutinación Inmunoprecipitación en medio líquido Turbidimetría Nefelometría Inmunodifusión doble Contrainmunoelectroforesis Inmunofluorescencia Citometría de flujo Inmunoanálisis con indicadores marcados ELISA Inmunotransferencia Western blot, Slot blot

4 AGLUTINACIÓN Primeras técnicas empleadas en los estudios de autoinmunidad. Antígeno particulado + Acs agregados macroscópicos con aglutinación.

5 Se realiza generalmente en placa, también en tubo. Se mezcla la suspensión de células o partículas con el suero. Se hace oscilar la placa durante unos minutos y se observa la aglutinación. Ventajas: facilidad de realización no equipamiento Desventajas: baja sensibilidad dificultad de cuantificar

6 APLICACIONES Detección del factor reumatoide isotipo IgM aglutina partículas recubiertas con IgG humana. Determinación anticuerpos contra el núcleo (ANA). Algunos anticuerpos específicos de órgano. Anticuerpos contra la actina. Anticuerpos contra los espermatozoides.

7 INMUNOPRECIPITACIÓN Antígeno soluble + Anticuerpos precipitación

8 ZONA DE EQUIVALENCIA

9 INMUNOPRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO TURBIDIMETRÍA Mide la disminución de la intensidad de la luz cuando atraviesa una solución proporcional a la cantidad y tamaño de las partículas. NEFELOMETRÍA Mide la luz dispersada a diversos ángulos por la suspensión particulada proporcional a la concentración de partículas del medio.

10 INMUNOPRECIPITACIÓN EN GELES

11 INMUNODIFUSIÓN DOBLE Patrón de identidad Patrón de disparidad Patrón de semiidentidad

12 CONTRAINMUNOELECTROFORESIS Migración electroforética Atg (-) ánodo (+) Ac (+) cátodo (-) Más sensible que la inmunodifusión Cualitativa ANODO (+) CATODO (-)

13 INMUNOFLUORESCENCIA Emplea anticuerpos que llevan unidos compuestos fluorescentes o fluorocromos. Excitación Emisión Isotiocianato de fluoresceína 488nm 530nm Rodamina B 545nm 585nm Ficoeritrina 488nm 576nm directa indirecta

14 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Aparición fluorescencia presencia de autoanticuerpos Patrones de fluorescencia posibilidad de orientar y caracterizar el autoanticuerpo Corte de tejido Antiinmunoglobulina marcada

15 Ventajas: posibilidad de discriminar entre diversos patrones buen método de escrutinio Desventajas: interpretación subjetiva margen de referencia baja sensibilidad difícil de estandarizar no es posible la automatización

16 ELISA Enzimoinmunoanálisis conjugación del anticuerpo con un enzima que produce una reacción cuyo producto puede ser medido espectofotométricamente. Enzimas: peroxidasa de rábano fosfatasa alcalina B-galactosidasa G6PD

17 ELISA INDIRECTO + + E E suero antianticuerpo marcado Espectrofotometría 450nm E E sustrato

18 Evaluación cuantitativa -curva de saturación de los calibradores : absorbancia de cada calibrador frente a su concentración. -la concentración de autoanticuerpos se obtiene al leerla en la curva de calibración. Evaluación cualitativa DOCut-off = DOCP* Factor

19 INMUNOTRANSFERENCIA La transferencia de proteínas o `blotting supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas ya sea mediante transferencia o mediante aplicación directa. Detección reacción antígeno-anticuerpo: Métodos radioquímicos ionizantes. Enzimas peroxidasa, fosfatasa alcalina emiten radiaciones Reacción de quimioluminiscencia y radiografía

20

21 WESTERN BLOT

22 SLOT BLOT

23 CITOMETRÍA DE FLUJO Tecnología que permite la determinación simultánea de varios autoanticuerpos en células en suspensión mediante el empleo de fluorocromos.. Utiliza conjuntos de microesferas de látex marcadas internamente con diferentes proporciones de dos fluorocromos.

24 biotina Atg suero estreptavidina-ficoeritrina 576 nm

25 PARÁMETROS Dispersión frontal captada por la lente del detector Forward Scatter (FSC). En posición frontal respecto a la fuente de luz. Relacionado con el tamaño de la partícula. Dispersión lateral captada por el detector Side Scatter (SSC). Medida relativa de la complejidad interna de la célula. Fluorescencia de los dos fluorocromos internos de las microesferas. Fluorescencia de los conjugados unidos a las microesferas (detectores de fluorescencia).

26 láser Argón 488nm complejidad side scatter FL1 FL2 FL3 FL4 forward scatter forward scatter tamaño

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