FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. PRACTICAS DE VIROLOGÍA. GRADO BIOMEDICINA

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1 FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. PRACTICAS DE VIROLOGÍA. GRADO BIOMEDICINA SEGUNDO CICLO PRACTICA 1: Visualización del efecto citopático. PRACTICA 2: Técnicas de Diagnóstico Serológico (ELISA) PRACTICA 3: Técnicas de Diagnóstico Serológico (Western-blot) PRACTICA 4: Multiplex PCR (Realtime-PCR) de virus herpes. Día 1: Visualización del efecto citopático Desarrollo de la Tecnica de ELISA Western-Blot (Incubación con anticuerpo primario) Día 2: Visualización del efecto citopático Western-Blot (Detección) Día 3: Visualización del efecto citopático Multiplex PCR (Realtime-PCR) de virus herpes

2 PRACTICA 1: Visualización del efecto citopático. Para cultivar virus se utilizan tipos específicos de células de cultivo tisular. Los cultivos de células primarias se obtienen por tratamiento de algún órgano animal específico con tripsina o colagenasa. Las células obtenidas con este método se cultivan en monocapa (fibroblasto o células epiteliales) o en suspensión (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero bovino o alguna otra de factores de crecimiento. Las células primarias se puedn separar con tripsina, se diluyen y crecen en nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares secundarios. Las líneas de células diploides son cultivos de un único tipo de células con los que se puede hacer un gran número de pases, aunque finito, antes de presentar signos de senescencia o experimentar cambios significativos en sus características. Las líneas celulares tumorales y las líneas celulares inmortalizadas, iniciadas a partir de tumores de pacientes o por efecto de virus o compuestos químicos respectivamente, se componen de células de un solo tipo que pueden ser sometidas a pases continuos sin envejecer. Las células primarias de riñón de mono son muy adecuadas para llevar a cabo el aislamiento del virus de la gripe, paramixovirus, muchos enterovirus y alguno adenovirus. Las células diploides fetales humanas, que generalmente son fibroblastos, permiten el crecimiento de un amplio abanico de virus (VHS, VVZ, CMV, adenovirus, picornavirus). Las células HeLa, una línea continua de células epiteliales derivadas de un cancre humano son excelentes para aislar el VRS, los adenovirus y los VHS. Muchos virus con importancia clínica se pueden aislar con algunos de estos cultivos celulares. Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. Estos efectos se usan para reconocer las células infectadas por virus en un cultivo. Los efectos citopáticos inducidos por los virus se pueden examinar con un microscopio de luz invertida de baja potencia. Se determinan características como redondeamiento y contracción de las células, aumento de la refractabilidad, fusión o formación de sincitios, agregación, pérdida de adherencia y lisis o muerte celular. Los efectos citopáticos se producen como resultado de: Ingreso del virus en el huésped (paso a través de la membrana plasmática) Inhibición de la transcripción celular o estimulación de la actividad de la RNA polimerasa celular Interacciones del virus con las vías de procesamiento del RNA Interacciones del virus con el aparato de traducción Respuesta del huésped a la infección viral Los efectos citopáticos son los criterios más simples y utilizados con más frecuencia para reconocer las infecciones virales, aunque no todos los virus causan estos efectos. Por tal razón deben usarse otros métodos para detectar las infecciones virales. Células A-549: Línea diploide de epitelio alveolar de pulmón humano (Se utiliza para cultivo de Herpevirus). Línea celular tumoral. Células MRC-5: Línea diploide de fibroblasto de pulmón humano (Se utiliza para cultivo de CMV). Línea celular tumoral. La práctica consistirá en la visualización del efecto citopático de los virus VHS y CMV a lo largo de tres días consecutivos.

3 Efecto citopático inducido por Virus Herpes Simplex. Muestra de Biopsia Hepática. (A) Cuerpo de inclusión eosinófilo. (B) Célula infectada con nucleo condensado más pequeño. Efecto citopático inducido por Virus Herpes Simplex. Cultivo de células Vero (estirpe celular de riñón de mono verde verde africano) no infectada. (B) Células de riñón de mono verde verde africano infectadas por VHS-1 en la que se aprecian células redondeadas, células multinucleadas y desaparición de la monocapa. Las flechas indican los sincitios.

4 PRACTICA 2: Técnicas de Diagnóstico Serológico (ELISA) Los métodos serológicos son especialmente útiles para estudiar virus de difícil desarrollo en cultivos celulares y virus que causan enfermedades de curso lento. Se puede utilizar el suero del paciente (que contiene anticuerpos) para identificar cepas virales o serotipos, evaluar el curso de una infección y evaluar si la infección es reciente o crónica. La detección de anticuerpos contra un virus es una determinación indirecta de la infección viral. Indica la respuesta antiviral de un huésped más que la presencia de partículas virales. Cuando un individuo se encuentra por primera vez con un virus, el organismo responde mediante la producción de un tipo de anticuerpos específicos contra el virus denominado IgM. Los anticuerpos IgM son proteínas que se encuentran en el suero durante las primeras dostres semanas de una infección primaria. La presencia de anticuerpos IgM específicos indica una infección reciente. Luego aparecen los anticuerpos IgG. Estos son los más comunes ya que representan hasta el 75% de anticuerpos totales. Si una persona se reinfecta con un virus, la respuesta del anticuerpo IgM es similar a la respuesta primaria, pero para la IgG se activan células de memoria que producen anticuerpos IgG específicos en un corto periodo de tiempo. Mediante el examen de los perfiles de anticuerpos se pueden diferenciar infecciones crónicas de infecciones recientes. Las enfermedades de curso lento como la mononucleosis infecciosa causada por el virus Epstein-Barr y la hepatitis B y C, son pasibles a ser diagnosticadas de este modo. TOMA DE MUESTRA. Estas determinaciones, salvo excepciones (LCR...) se van a realizar en suero. Con estas técnicas podremos determinar tanto las inmunoglobulinas globales (IgG + IgM) o bien sólo la IgM, la IgG, o en algunos casos especiales otras Ig (IgA). siguiente: La evolución de estas inmunoglobulinas en el curso de una infección primaria es la F Aguda F Convalescencia

5 La detección de inmunoglobulinas totales o de IgG en una muestra de suero nos indicará la prevalencia de anticuerpos frente a una infección o bien que el paciente ha tenido previo contacto con el agente infeccioso. Solamente en caso de títulos muy altos podría tener valor diagnóstico. La presencia de IgM indica que la infección está en actividad por lo que una sola determinación podría ser diagnóstica (aunque existen excepciones). Normalmente lo que se hace es la determinación de inmunoglobulinas totales en dos sueros del paciente, uno tomado en la fase aguda de la enfermedad y otro en la fase de convalecencia (separación días) y lo que vamos a valorar es un aumento significativo (4 diluciones ó más) en los títulos de anticuerpos. A esto lo denominamos Seroconversión. TÉCNICAS. Aglutinación: Se usa cuando queremos poner de manifiesto anticuerpos frente a antígenos grandes. Si hay Ac, estos se unirán al Ag formando una malla tridimensional que se ve a simple vista. Si no hay Ac, el Ag sedimentará en el fondo del pocillo formando un botón. - Lectura positiva: Malla que cubre todo el fondo del pocillo. - Lectura negativa: Punto o botón en el centro del pocillo. Hemaglutinación: Para Ags pequeños se utiliza un soporte que haga la reacción visible. En este caso son hematíes. Aglutinación con partículas de Latex: Es similar a la hemaglutinación, Aquí el soporte son partículas de látex. Fijación del complemento: Pone de manifiesto la IgM (que es la que más fija el complemento) o grandes cantidades de IgG. Por tanto es útil para detectar una infección en actividad y no para determinar el estado inmune. Si hay Ac, frente al Ag estudiado, la unión Ag-Ac va a fijar el complemento y a consumirlo. Para poderlo visualizar vamos a utilizar como sistema indicador el complejo Hematíes-Hemolisina.

6 - Lectura positiva: botón o punto. Si había Ac frente al Ag no quedará complemento libre y la hemolisina no lisará los hematíes ocurriendo la precipitación de los mismos (Botón en el fondo). - Lectura negativa: no sedimentación de hematíes (agua de lavar carne) Si no había Ac, quedará complemento libre y éste será fijado por el complejo hemolisina-hematíes ocurriendo la lisis de hematíes. (Agua de carne). Inmunofluorescencia indirecta: Para poner de manifiesto la unión Ag-Ac utilizamos antigammaglobulinas, es decir, anticuerpos dirigidos contra gammaglobulinas (anticuerpos) humanos marcados con fluoresceína. Podemos poner de manifiesto bien los anticuerpos totales ó solo la IgM. Es una de las técnicas más usadas en la actualidad. Se emplea por ejemplo para el diagnóstico de las infecciones producidas por Treponemma pallidum, Legionella, Toxoplasma, virus de Epstein Barr,... Ensayos inmunoenzimáticos (ELISA): En este caso la unión Ag-Ac se pone de manifiesto mediante anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos humanos que van unidos a un enzima. Este enzima va a catalizar una reacción de cambio de color cuando se le añada un sustrato específico. - Lectura positiva: Cambio de color. - Lectura negativa: Permanece el mismo color. Se utiliza frecuentemente para el diagnóstico de adenovirus, citomegalovirus, Epstein- Barr, Varicella-Zoster, Influenza, Herpes Simplex o VIH. Inmunoblotting o Western-blotting. Permite detectar Ac frente a proteínas (antígenos) de los microorganismos, previamente separadas mediante electroforesis y posteriormente transferidas a una membrana, mediante la realización de un inmunoensayo empleando la metodología antes indicada. Es una técnica de gran especificidad y se emplea, además de cómo herramienta de investigación, en el diagnóstico de las infecciones por virus, por ejemplo el VIH. Los ensayos de ELISA, que a veces se conocen como ensayos enzimáticos (EIA), se utilizan rutinariamente en el laboratorio de diagnóstico para detectar antígenos virales en las muestras clínicas y para identificar y cuantificar anticuerpos virales en suero. Se basan en la unión de los anticuerpos a sus antígenos y en la detección de esta reacción mediante anticuerpos comerciales conjugados con una enzima activa. La enzima reacciona son su sustrato y produce un cambio de color. La observación y la medición del color determinan el resultado de la prueba. El ELISA es un método muy sensible y reaccionará incluso cuando solo 1 o 2 anticuerpos de se hallen en la muestra de suero. En el caso de HIV, si la muestra es reactiva o positiva, se repite. Si la segunda muestra es también positiva se debe realizar una confirmación mediante Western-blot. El uso de las dos pruebas juntas proporciona la máxima seguridad diagnostica. Aunque los ELISA son muy sensibles y altamente específicos, se pueden producir reacciones falsas positivas debido a las reacciones cruzadas de los anticuerpos.

7 Nosotros en la práctica realizaremos un diagnóstico serológico de anticuerpos totales (IgG/IgM) frente al virus de la gripe (Influenza A). INFLUENZA A ELISA IgG/IgM La gripe o influenza es una enfermedad infecciosa causada por un tipo de virus de ARN. Los virus de gripe se caracterizan por una variabilidad genética pronunciada, pudiendo ser clasificados en los tipos A, B y C. Un elevado número de mutaciones conduce a modificaciones en las glicoproteínas, responsables de las típicas pandemias y endemias de los virus de la gripe A y B. La capacidad de intercambio genético entre virus humanos y animales de la gripe A conduce a la generación de nuevos subtipos como el H5N1 o el H1N1. Métodos de Diagnóstico: En época epidémica, el diagnóstico clínico es difícil debido que puede confundirse con otras enfermedades respiratorias. El diagnóstico de laboratorio es especialmente útil para enfermos con riesgo de sufrir enfermedad grave (inmunodeprimidos, mayores de 60 años, embarazadas de tercer trimestre). Las técnicas serológicas más empleadas son fijación de complemento, IFI y ELISA, aunque la mayor parte de los casos se detectan con biología molecular, cultivo y detección de antígeno. INFLUENZA A ELISA IgG/IgM INFLUENZA A ELISA IgG/IgM es una prueba inmunoenzimática indirecta para determinar anticuerpos IgG y/o IgM frente a Influenza A en suero o plasma humano. El kit contiene 96 tests. La presentación G/M incluye todos los reactivos necesarios para llevar a cabo todas las combinaciones posibles de determinaciones IgG e IgM con una sola referencia. El método de ELISA se basa en la reacción de los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie de poliestireno. Las inmunoglobulinas no unidas por reacción con el antígeno son eliminadas en el proceso de lavado. En un paso posterior la globulina antihumana reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo, y la que no se une es eliminada por los lavados; la unida reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reacción coloreada azul, que cambia a amarillo tras la adición de la solución de parada.

8 Protocolo: 1. Sacar los reactivos para que se atemperen. 2. Agitar todos los componentes. 3. Cada alumno trabajará con un suero problema, un control positivo y un control negativo. Dilución para IgG 4. Añadir a un tubo eppendorf 100 L de diluyente de muestra. 5. Añadir a cada tubo 5 L de suero, control positivo o control negativo. 6. Homogeneizar con la pipeta durante 1 minuto. 7. Añadir a cada pocillo 105 L de cada mezcla. Dilución para IgM 8. Añadir a un tubo eppendorf 25 L de sorbente. 9. Añadir a cada tubo 5 L de suero 10. Añadir a un tubo eppendorf 75 L de diluyente de muestra. 11. Homogeneizar con la pipeta durante 1 minuto. 12. Añadir a cada pocillo 105 L de cada mezcla. 13. Tapar mediante lámina adhesiva e incubar en estufa a 37ºC durante 45 minutos. 14. Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solución de lavado, asegurándose que no quedan restos de solución de lavado. 15. Añadir inmediatamente 100 μl de conjugado IgG o IgM a todos los pocillos. 16. Tapar mediante lámina adhesiva e incubar en estufa/baño durante 30min. a 37±1ºC. 17. Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solución de lavado 9, asegurándose que no quedan restos de solución de lavado. 18. Añadir inmediatamente 100 μl de solución de sustrato a todos los pocillos. 19. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, en la oscuridad. 20. Añadir inmediatamente 50 μl de solución de parada a todos los pocillos. 21. Valorar espectrofotométricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de acabado el ensayo.

9 PRACTICA 3: Técnicas de Diagnóstico Serológico (Western-blot) El análisis de transferencia de Western-blot es una variante del análisis de ELISA. Esta tecnica consiste en la transferencia de proteína víricas separadas mediante técnicas electroforéticas según su peso molecular y su carga eléctrica a un papel de filtro (nitrocelulosa, nailon, ). Cuando se expone al suero del paciente, las proteínas inmovilizadas atrapan los anticuerpos antivíricos específicos y éstos se visualizan mediante anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. Esta técnica muestra las proteínas reconocidas por el suero del paciente. El análisis de transferencia de Western-blot se usa como prueba confirmatoria de los resultados de análisis de ELISA sn sujetos con sospecha de infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Simulación de Western-blot de VIH a realizar en la práctica. ELECTROFORESIS Cargar el gel de proteínas virales y correr (dejar correr todo el frente) TRANSFERENCIA NEGRO ESPONJA WATMAN MEMBRANA GEL WATMAN ESPONJA TRANSPARENTE

10 La transferencia se realiza desde el ánodo ( - ) al cátodo ( + ) DETECCIÓN (Rehidratar la membrana con metanol) BLOQUEO TTBS 5% leche en polvo 2 horas ó O/N Tº Ambiente Lavado suave con H 2 O MQ ó destilada INCUBACIÓN Ac 1º (suero del paciente) Dilución 1/2000 del Ac en TTBS BSA 0,4 % 2 horas Tº Amb en agitación 3 lavados de 10 min con TTBS INCUBACIÓN Ac 2º (anti human marcado con peroxidasa) Dilución 1 / del Ac en TTBS BSA 0,4 % 1 hora Tº Amb en agitación 3 lavados de 10 min con TTBS REVELADO Se utilizará el reactivo SIGMAFast 3,3 -Diaminobenzidina en tabletas (sustrato del enzima peroxidasa). Éste es un sustrato precipitable de color negro para la detección de este enzima. Las tabletas se disuelven en 15ml de H2O destilada que produce una solución que consiste en 0.7mg/L DAB+0.67mg/L Peróxido de Urea+ 60mM Tris buffer. Esta solución está lista para su uso (usar la solución en un periodo de 1 hora).

11 Quitar el exceso de TTBS Cubrir la membrana con una pipeta con la solucion que contiene DAB. Esperar 1 minuto. El desarrollo de un precipitado de color negro ocurre rapidamente. En la muestra positivas debe apreciarse una banda de color negro mientras que en las muestra negativas la membrana se mantiene de color blanco. SOLUCIONES TRANSFER BUFFER G Tris 5.76 g Glicina ENRASAR A 2000 ml 800 ml Metanol TTBS TWEEN 20 1 ml 1 M TRIS7HCL Ph ml NaOH 5M 5 ml ENRASAR A 2000 ml Solución Ponceau: Ponceau-S al 2% en acético al 1%

12 PRACTICA 4: Multiplex PCR (Realtime-PCR) de virus herpes. Los ácidos nucléicos, tanto ADN como ARN, así como las proteínas de un agente infeccioso son huellas que delatan la presencia de los agentes infecciosos en las muestras clínicas y son muy útiles para su identificación. Las ventajas de los métodos moleculares radican en su sensibilidad, su especificidad y su seguridad. Desde el punto de vista de la seguridad, estas técnicas no requieren el aislamiento del agente infeccioso. Debido a su sensibilidad permiten detectar muestras muy diluidas de material genético en un tejido. Estas técnicas permiten distinguir variantes en función de su genotipo lo cual es especialmente útil para diagnosticar cepas resistentes a los agentes antivíricos, las cuales pueden diferir en un único nucleótido. Son varias las técnicas utilizadas como herramientas de Diagnóstico Molecular: Análisis electroforético y polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Se ha utilizado para diferenciar variantes del VHS y diferenciar VHS-1 de VHS- 2. Sondas genéticas (Hibridación in situ, Southern, Northern). Las sondas de ADN se pueden utilizar de manera semejante a los anticuerpos, como herramientas sensibles y específicas para detectar, localizar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos específicos de muestras clínicas. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Amplifica copias simples de material genético vírico varios millones de veces. Esta técnica es especialmente útil para detectar virus latentes e integrados como es el caso de los retrovirus, herpes o papilomavirus. PCR RT-CPR PCR a tiempo real En la práctica realizaremos una PCR a tiempo real de virus Herpes Simple.

13 RT-PCR Virus de la familia herpesviridae (VHS, VVZ y CMV) PCR VIRUS HERPES SIMPLE FUNDAMENTO PCR anidada en tiempo real 382 pb HSV Os HSV Oa 2719 pb HSV Is HSV Ia 281 pb CEBADORES Sentido Posición Nombre Secuencia (5 3 ) Outer sense HSV Os ATCCGAACGCAGCCCCGCTG Outer antisense HSV Oa TCCGG(G/C)GGCAGCAGGGTGCT Inner sense HSV Is GCGCCGTCAGCGAGGATAAC Inner antisense HSV Ia AGCTGTATA(G/C)GGCGACGGTG Tamaño del amplicón (pb)

14 SEGUNDA PCR (TIEMPO REAL) 1) Preparar la mezcla maestra en un tubo de PCR de 1.5 ml añadiendo los siguientes volúmenes de reactivos (L): MEZCLA MAESTRA Número de reacciones N=1 N=2 N=3 Master Mix 5x activada (tapón verde) Cebador HSV Is (5 M) Cebador HVS Ia (5 M) Agua ) Repartir alícuotas de 8 µl en los capilares. 3) Añadir 2 µl de los productos de la primera PCR (muestra/control). 4) Dar un breve pulso de centrífuga (no superar las 200 rpm) a los capilares. 5) Realizar el Self Test. 6) Introducir los capilares en el Light Cycler. 7) Ejecutar el programa: protocolo EV+VHS+VVZ-READ (carpeta PROTOCOLOS HUV MACARENA/subcarpeta PROGRAMAS DE TRABAJO. 8) El archivo se guarda en la subcarpeta HSV-READ de la carpeta RESULTADOS. Utilizar las iniciales HSV seguido del Nº de la muestra (Ej. HSV ). VALIDACION DE LOS RESULTADOS 1) Para validar la prueba se tienen que cumplir los siguientes requisitos: o Control negativo: no se obtiene curva de amplificación, o si se obtiene una curva, la Tm del producto de PCR es inferior a 85ºC (dímeros de primers). o Control positivo VHS: se obtiene una curva de amplificación y la Tm es de o Control de beta-globina: se obtiene una curva de amplificación y la Tm es de (0.50). 2) Las causas más frecuentes para invalidar la prueba son: o Contaminación del control negativo con ADN o con productos amplificados del control positivo. En este caso hay que repetir la extracción de ADN, la1ª PCR y la 2ª PCR. o No se obtiene amplificación del control positivo. o No se obtiene amplificación de la beta-globina. INFORME DE RESULTADOS Los posibles resultados de la muestra problema son: 1. PCR negativa (no se detecta ADN de VHS): no se obtiene curva de amplificación, o si se obtiene curva, la Tm del producto de PCR es inferior a 85ºC (dímeros de primers).

15 2. PCR positiva (se detecta ADN de VHS): se obtiene una curva de amplificación y la Tm es de PCR no interpretable: no se obtiene amplificación de la beta-globina por inhibición de la PCR (incluso después de diluir la muestra). Si no amplifica el control positivo se repite la PCR de la muestra y de otro control positivo distinto. 4. El resultado de la PCR se pueden CONFIRMAR mediante electroforesis (geles de agarosa al 2%). 5. Los tamaños esperados de los fragmentos amplificados de la muestra problema deben ser: a) 382 pb (primera PCR VHS) y 281 pb (segunda PCR VHS). b) 248 pb (betaglobina).

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