Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares
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- María Ángeles Espinoza Márquez
- hace 8 años
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1 Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares Dolores Moreno León. Técnico Superior Anatomía Patológica y Citología INP (Instituto Neuropatología) IDIBELL HUB (Hospital Universitari de Bellvitge). L Hospitalet de Llobregat. CIBERNED
2 Introducción Anatomía del músculo esquelético Músculo esquelético Fascículo Fibra muscular (varios mm a varios cm)
3 Introducción Anatomía del músculo esquelético Motoneurona Tipo I Miofibrillas Fibras tipo I y tipo II, y contracción muscular Fibra muscular Tipo I Tipo I rojas +++ lenta, +++ mitocondrias +++ actividad oxidativa +++ mioglobina +++ gotas lipídicas Motoneurona Tipo II Miofibrillas Tipo IIb blancas +++ rápida, +++ glucógeno +++ miofibrillas IIa intermedias ++ rápidas IIIc regenerativas Fibra muscular Tipo II
4 Introducción Esquema fibra muscular Complejo Sarcoglicanos α 2 β γ 1 1 Laminina 2 α δ γ α β β Complejo Distroglicano Caveolina B B T T B T Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina Mitocondrias Banda Z α-actina α B-cristalina Miotilina Teletonina lípidos Desmina sarcómero Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma Núcleo Sarcolema Glucógeno
5 Introducción Complejo Sarcoglicanos α 2 β γ 1 1 Laminina 2 α δ γ α β β Complejo Distroglicano Caveolina Proteínas membrana: Patrón distrófico B B T T B T Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina Mitocondrias Banda Z α-actina α B-cristalina Miotilina Teletonina lípidos Desmina sarcómero Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma Núcleo Sarcolema Glucógeno
6 Introducción α 2 Complejo Sarcoglicanos β γ 1 1 Laminina 2 α δ γ α β β Complejo Distroglicano Caveolina B B T T B T Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina Mitocondrias MFM= miopatia miofibrilar α B-cristalina Miotilina Teletonina lípidos Glucógeno Desmina sarcómero Proteínas de sostén: patrón MFM Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma Banda Z α-actina Núcleo Sarcolema
7 Introducción α 2 Complejo Sarcoglicanos β γ 1 1 Laminina 2 α δ γ α β β Complejo Distroglicano Caveolina B B T T B T Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina Mitocondrias Banda Z α-actina Fallo en el metabolismo de la fibra: enfermedades metabólicas α B-cristalina Miotilina Teletonina lípidos Glucógeno Desmina sarcómero Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma Núcleo Sarcolema
8 Introducción α 2 Complejo Sarcoglicanos β γ 1 1 Laminina 2 α δ γ α β β Complejo Distroglicano Caveolina Infiltrados Inflamatorios: miositis B B T T B T Distrofina Lamina A/C Miofibrillas Actina asociada al esqueleto Miosina Titina Emerina Mitocondrias Banda Z α-actina α B-cristalina Miotilina Teletonina lípidos Desmina sarcómero Actina Troponina Tropomiosina Nebulina Sarcoplasma Núcleo Sarcolema Glucógeno
9 Introducción Las enfermedades neuromusculares - La mayoría son de carácter genético y generalmente hereditarias - Son enfermedades crónicas y progresivas - Afectan a la musculatura y al sistema nervioso periférico - Su aparición puede producirse en el nacimiento o en otras etapas de la vida - Las características más importantes son la pérdida progresiva de fuerza muscular, y la degeneración de los músculos y de los nervios periféricos
10 Introducción Enfermedades neuromusculares Motoneurona Periférica (Asta anterior de la médula espinal) Nervio periférico (fibra nerviosa) Unión Neuromuscular Fibra Muscular DISTROFIAS MUSCULARES CONGÉNITAS DISTROFIAS MUSCULARES GLUCOGENOSIS MITOCONDRIALES METABÓLICAS MIOPATÍAS LIPÍDICAS MIOSITIS MFM (Miopatia Miofibrilar) MIOPATÍAS CONGÉNITAS Hereditarias:.-Amiotrófias espinales Adquiridas:.-Virales: poliomielitis.-degenerativas: Esclerosis lateral amiotrófica(ela) Neuropatías sensitivo-motora Hereditarias:.-Enfermedad Charcot-Marie-Tooth.-Leucodistrófias Adquiridas:.-Inflamatorias: S. Guillain Barré, polineuropatía desmielinizante crónica inflamatoria (PCDI).-Infecciosas.-Tóxicas.-Metabólicas (e.j. diabetes) Enfermedades de la unión neuromuscular Hereditarias: Síndromes miasténicos Congénitos Adquiridas: Miastenia gravis MIOPATÍAS DISTALES MIOTONÍAS CONGÉNITAS PARÁLISIS PERIÓDICA DISTROFIAS MIOTÓNICAS
11 Introducción Distrofias musculares I Distrofia muscular de Duchenne recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina) Distrofia muscular de Becker recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina) Distrofinopatías menores recesivas ligadas a X, Xp21,2(distrofina) Distrofia muscular con déficit de adhalina o de alfasarcoglicano (LGMD 2D) autosómica recesiva, 17q12-q21 (adhalina o alfasarcoglicano) Distrofia muscular con déficit en betasarcoglicano (LGMD 2E) autosómica recesiva, 4q12 (betasarcoglicano) Distrofia muscular con déficit en gammasarcoglicano (LGMD 2C) autosómica recesiva, 13q12 (gammasarcoglicano) Distrofia muscular con déficit en deltasarcoglicano (LGMD 2F) autosómica recesiva, 5q33 (deltasarcoglicano) Distrofia muscular de cinturas tipo Erb (LGMD 2A) autosómica recesiva, 15q15 (calpaina 3) Distrofias musculares de cinturas (LGMD 1A) autosómica dominante, 5q22-q34 (LGMD 2B) autosómica recesiva, 2p13-p16 Distrofia muscular facioescapulo-humeral (Miopatía de Landouzy-Déjérine) autosómica dominante, 4q35 Distrofias musculares II Distrofia muscular de Emery-Dreifuss recesiva ligada a X, Xq28 (emerina) Miopatía de Bethlem autosómica dominante, 21q22,3 (sub-unidades a1 y a2 del colágeno VI) 2q37 Distrofia muscular congénita con déficit de merosina autosómica recesiva, 6q22 23 (merosina) Distrofia muscular congénita de tipo Fukuyama autosómica recesiva, 9q31 q32 (déficit parcial de 43 DAG y de merosina) Síndrome de Walker-Warburg autosómica recesiva Síndrome MEB (Músculo-Ojo-Cerebro o enfermedad de Santavuori) autosómic recesivo Distrofia muscular oculofaríngea autosómica dominante, 14q11.2q13 Enfermedades musculares inflamatorias Polimiositis adquiridas Dermatomiositis adquiridas Miositis por cuerpos de inclusión (IBM o inclusion body myositis) esporádica Miopatías metabólicas Miopatías mitocondriales transmisión materna, autosómica dominante, autosómica recesiva ligada a X, esporádica Lipidosis musculares: Miopatías con déficit de carnitina autosómica recesiva Miopatías con déficit de carnitina palmitiltransferasa de tipo II (CTP II) autosómica recesiva, 1p32 (carnitina palmitiltransferasa) Lipidosis con déficit en acil CoA deshidrogenasa autosómica recesiva, 12q22-qter (acil CoA deshidrogenasa) Glucogenosis musculares: Enfermedad de McArdle autosómica recesiva, 11q13 (fosforilasa muscular) Enfermedad de Tauri autosómica recesiva, 12q13.3 (fosfofructoquinasa) Enfermedad de Pompe autosómica recesiva, 17q225 (maltasa ácida) Miopatias Miofibrilares (MFM) Desmina autosómica dominante 2q35 Miotilina autosómica, dominante 5q31 FLNC, autosómica dominante, 7q32.0 Zasp autosómica dominante 10q Alfa-B-cristalina autosómica dominante, 11q21-23
12 Recepción Recepción de la biopsia muscular Historia clínica. Pruebas complementarias Biopsia muscular M.E. Congelación/OCT Reserva s/m Banco Tejidos Estudio ultraestructural Cortes criostato Extracción de proteínas Extracción ADN Banco ADN Estudio EHQ/HQ/IHQ western blotting PCR DIAGNÓSTICO Consejo Genético
13 Recepción Recepción de la biopsia muscular - Comprobación de datos del paciente y número de registro - Separación de diferentes fragmentos para sus diferentes estudios: -OCT - Reserva sin montar para western blotting y/o ADN - PFA 4% (paraformaldehído) - m.e. (microscopía electrónica) - Congelación de la biopsia muscular al corte transversal en isopentano enfriado en nitrógeno líquido y posterior montaje en OCT - Conservar la muestra a -80ºC - Cortes de criostato entre 6 y 8 μm. Montaje en portas pretratados
14 Recepción de la biopsia muscular Recepción Fibras sin orientar Seleccionar los diferentes fragmentos Orientar las fibras en la misma dirección Mantener el número asignado durante todo el proceso de congelación Comprobarción de los datos y número de laboratorio
15 Congelación de la biopsia muscular Congelación N 2 Metilbutano Congelación durante 10 en metilbutano frio Inclusión en OCT con la orientación transversal al corte Bloque de OCT Reserva sin montar Diferentes pasos de la congelación de la muestra
16 Tinciones Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular: -H-E (hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrómico de Gomori) -PAS, PAS+D (ácido periodico de Schiff, más diastasa) -NADH (nicotin-adenina deshidrogenasa) -ATPasas (ATPasas miosínicas) -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -Fosforilasa -Fosfofructocinasa -oil red/sudán negro
17 Tinciones Hematoxilina-eosina (Tinción topográfica de rutina) Hematoxilina de Harris: Colorante natural (haematoxylon campechianum): - oxidación - mordiente (alumbre) Vacuolas festoneadas - progresiva/regresiva - diferenciación/viraje Eosina: Colorante artificial derivado del xanteno -regresiva -diferenciación Diferentes tamaños de fibras Músculo normal Valoración: Forma y tamaño de las fibras, necrosis, atrofias, hipertrofias, inclusiones citoplasmáticas, infiltrados inflamatorios.
18 Tinciones Tricrómico de Gomori (TG) (Técnica estructural) Tinción nuclear con Hx de Harris/Weigert Mezcla de colorantes citoplasmáticos: - Cromotopo 2R - Fast green - ácido fosfostúngstico Bastones Nemalínicos Ragged-red Músculo normal Inclusiones citoplasmáticas Bastones Nemalínicos Vacuolas rimmed Valoración: Las mitocondrias, las fibras ragged-red (rojo-rasgadas), las vacuolas rimmed (festoneadas), los cuerpos nemalínicos, la mielina y los nervios se tiñen de rojo. Resto del citoplasma de color verde oscuro; los núcleos de color lila/negro.
19 Tinciones Oil red O/ sudán negro (Tinción de lípidos) Oil Red Con contraste nuclear - Colorante Oil Red O o Sudan negro a saturación en solución alcohólica. - Capacidad de tinción por comodidad del colorante. - Contraste nuclear con H. de Harris Sudan Black Valoración: Las vacuolas lipídicas y los lípidos neutros se tiñen de rojo o de negro dependiendo del colorante (Oil Red O o sudán negro)
20 Tinciones PAS y PAS + diastasa (Técnica histoquímica) Oxidación de los grupos hidroxilo del glucógeno con ácido periódico O CH CH 2 OH 2 OH CH OH OH CH 2 CH 2 2 O O O O OH H H OH H OH O OH H O OH OH H O C H C O H O C O H C O H O C O H Valoración: Núcleos lilas y depósitos de glucógeno fucsia. PAS+diastasa: diferencia glucógeno vs mucinas: el glucogeno se va
21 Tinciones Técnicas EHQ (ATPasas miosínicas, NADH, COX, SDH, fosforilasa, fosfofructocinasa) Técnicas que ponen de manifiesto si existe la actividad del enzima en estudio E P S Solución tamponada ph Sustrato Capturdor de color Capturador de color Producto Visible al MO E= Enzima S= sustrato P= Producto MO= Microscópio óptico EHQ= enzimohistoquímica
22 Tinciones Técnicas EHQ: ATPasa miosínica ph Sustrato: Adenosina-trifosfato - Acetato sódico/ácido acético; veronal/cloruro cálcico - Incubación a 3 ph diferentes - El capturador de color es cloruro de cobalto y sulfuro de amonio ph 4.63 ATP=ADP+P P+ClCo=Co3(PO4)2 Co3(PO4)2+(NH4)2S =CoS Tipo I rojas, lentas, +++ mitocondrias+++actividad oxidativa Tipo II blancas, rápidas, +++ glucógeno ph 9.4 Valoración: ph 4.35 fibras tipo I, IIc ph 4.63 fibras tipo I, IIb, IIc ph 9.4 fibras tipo II
23 Tinciones Técnicas EHQ: NADH (NAD Diaforasa) Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana Cit C - Sustrato: Nicotinamida-adenina-dinucleótido Membrana interna C-I C-II C-III C-IV - Capturador de color: NBT (cromógeno) - Solución tampón: Tris NADH + Normal Succinato NAD Fumarato Fosforilación Oxidativa Transporte de Electrones ½O 2 H 2 O 2 -ph7.4 NADH=NAD+H H + NBT = NBT - Refuerzo subsarcolémico Normal Targets: fibras en diana Lesión tipo core Central core Valoración: Actividad mitocondrial lila. Complejo I de la respiración mitocondrial. Diferenciación de tipos de fibras.
24 Tinciones Técnicas EHQ: COX (citocromo oxidasa) Citoplasma Membrana Externa - Sustrato: Citocromo C + catalasa - Capturador de color: DAB (cromógeno reducido) Membrana interna Espacio intermembrana C-I C-II C-III Cit C C-IV - Solución tampón: tampón fosfato -ph7.4 NADH + Normal COX Succinato NAD Fumarato Fosforilación Oxidativa Transporte de Electrones ½O 2 H 2 O 2 COX Valoración: Actividad mitocondrial marrón pardo. complejo IV de la respiración mitocondrial diferenciación de tipos de fibras Actividad COX -
25 Tinciones Técnicas EHQ: SDH (succinato deshidrogenasa) Citoplasma Membrana Externa - Sustrato: Succinato sódico - Capturador de color: NBT (nitroblue tetrazolium) Membrana interna Espacio intermembrana C-I C-II C-III Cit C C-IV - Solución tampón: tampón fosfato -ph7.4 NADH + Normal Succinato NAD Fumarato Normal Fosforilación Oxidativa Transporte de Electrones ½O 2 H 2 O 2 SucNa = sucna+h H + NBT = NBT - Normal Normal Valoración: Actividad mitocondrial lila Complejo II de la Respiración mitocondrial Diferenciación de tipos de fibras Refuerzo SDH Fibras ragged-blue
26 Tinciones Técnicas EHQ: fosforilasa - Sustrato: AMP, glucógeno, glucosa 1-fosfato - Capturador de color: Lugol - Solución tampón: tampón acetato sódico/ ácido acético -ph 5.6 NADPH Ribulosa-5-fosfato Ribosa-5-fosfato NADPH Ruta de las pentosas Glucógeno ATP AMP Glucogenolisis Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato ATP Fructosa-1,6-bifosfato 2-NADH 2-ATP 2-ATP Ac. Pivúrico La fosforilasa, activada por el AMP, actúa sobre la glucosa 1-fosfato en presencia de glucógeno formando un polisacárido. El polisacárido formado reacciona con el lugol Valoración: Actividad fosforilasa lila Diferenciación de tipos de fibras
27 Tinciones Técnicas EHQ: fosfofructocinasa - Sustrato:Arsenato sódico ATP B-nicotinamida adenina dinucleótico (B-NAD) - Capturador de color: NBT - 2 Soluciones incubación: fructosa 1,6 difosfato ph 8.6 fructosa 6 fosfato sulfato de magnesio ph 7 NADPH Ribulosa-5-fosfato NADPH Ribosa-5-fosfato Ruta de las pentosas Glucógeno ATP AMP Glucogenolisis Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato ATP Fructosa-1,6-bifosfato 2-NADH 2-ATP 2-ATP Ac. Pivúrico Fosk 6 Fosk 1-6 Valoración: Actividad fosfofructocinasa lila Diferenciación tipos de fibras
28 Resultados Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular: utilidad en las diferentes patologías -H-E (Hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrómico de Gomori) -PAS, PAS + D -NADH -ATPasas -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -fosforilasa -fosfofructoquinasa -oil red/sudán negro Denervación Glucogenosis 3 Mitocondrial Miopatías lipídicas 5 Patrón inflamatorio: Miopatías inflamatorias 6 7 Patrón MFM Patrón distrófico MFM= miopatia miofibrilar
29 Resultados 1. Denervación H-E Gomori ATPasa 4.35 músculo normal NADH: targets (fibras en diana) ATPasa 4.35: agrupación por tipos
30 2. Glucogenosis IV: McArdle Resultados m.e.: Depósito de glucógeno subsarcolémico H-E Fosforilasa Negativa Control Fosforilasa Vacuolas subsarcolémicas Glucógeno PAS Depósito de glucógeno subsarcolémico NADH NADPH Ribulosa-5-fosfato NADPH Ribosa-5-fosfato Ruta de las pentosas ATP AMP Glucogenolisis Glucosa-6-fosfato Glucolisis Fructosa-6-fosfato ATP Fructosa-1,6-bifosfato 2-NADH 2-ATP 2-ATP Vacuolas subsarcolémicas Ac. Pivúrico
31 Resultados 3. Miopatía mitocondrial Citoplasma Membrana Externa Espacio intermembrana Cit C H-E TG/ Ragged Red Membrana interna C-I C-II C-III C-IV NADH + Normal Succinato NAD Fumarato Fosforilación Oxidativa Transporte de Electrones ½O 2 H 2 O 2 m.e.: megamitocondrias con inclusiones Refuerzo SDH Actividad COX- Refuerzo NADH
32 Resultados 4. Miopatías lipídicas H&E NADH m.e. Sudan black Oil Red O
33 Resultados Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular -H-E (Hematoxilina-eosina) -T. Gomori (Tricrómico de Gomori) -PAS, PAS + D -NADH -ATPasas (Atpasa miosínicas) -COX (citocromo oxidasa) -SDH (succinato deshidrogenasa) -fosforilasa -fosfofructoquinasa -oil red/sudan Black Técnicas de IEHQ 5 Patrón inflamatorio Miopatías inflamatorias 7 Patrón Distrófico 6 Patrón MFM MFM= miopatia miofibrilar DM= Dermatomiositis IBM= Inclusión Body Miositis
34 IEHQ Técnicas IEHQ en la biopsia muscular: Técnica Strep-ABC H 2 O 2 +DAB - = DAB + =COLOR - Fijación con acetona-metanol - Bloqueo de la peroxidasa endógena -Bloqueos de las uniones inespecíficas con suero normal - Incubación en primario especifico - Incubación en secundario biotinilado - Incubación Strep-ABC Anti-human made in mouse anti-mouse made in goat biotilinado - Revelado con diaminobencidina: DAB IEHQ= inmunoenzimohistoquímica
35 IF Técnicas inmunofluorescencia desmina miotilina - Fijación con acetona-metanol - Bloqueos de las uniones inespecíficas con suero bovino fetal 10% - Incubación en anticuerpo primario especifico - Incubación en secundario marcado con fluorocromo anti-ratón hecho en cabra conjugado con fluorocromo anti-humano hecho en ratón IF= inmunofluorescencia
36 Técnicas IF confocal desmina miotilina merge IF Confocal -Fijación con acetonametanol - Bloqueos de las uniones inespecíficas con SBF10% - Incubación con 2 primarios específicos - Incubación con 2 secundarios marcado con fluorocromos de diferentes longitudes de ondas de emisión - Análisis con microscopio confocal Anti-human made in rabbit anti-rabbit made in goat conjugado con fluorocromo Y anti-mouse made in goat conjugado con fluorocromo X Anti-human made in mouse
37 IEHQ Resultado Marcadores Distrofias: Dys 1, Dys 2, Dys 3 utrofina: DRP1, DRP2 α-sarcoglicano β-sarcoglicano δ-sarcoglicano γ-sarcoglicano β-distroglicano emerina merosina (laminina alfa-2) laminina β1 disferlina caveolina Western-Blot Marcadores MFM: miotilina desmina ubiquitina αb-cristalina filamina C Dys1 gelsolina 5 Diagnóstico Marcadores linfocitarios: CD4, CD8, MHC clase I Patrón inflamatorio: miopatías inflamatorias 7 Patrón distrófico 6 Patrón MFM MFM= miopatia miofibrilar DM= Dermatomiositis IBM= Inclusión Body Miositis
38 IEHQ Resultado 5. Miopatías Inflamatorias: dermatomiositis, polimiositis Dermatomiositis Polimiositis Dermatomiositis Polimiositis: atrofia perifascicular Polimiositis MHC clase I Control - DM= Dermatomiositis IBM_ Inclusión Body Miositis
39 6. Miopatía miofibrilar (MFM) IEHQ Resultado H-E Gomori desmina αb-cristalina miotilina ubiquitina m.e. desminopatía C-filamina miotilina BF-10
40 IEHQ Resultado 7. Patrón distrófico H-E COX Gomori NADH ATPasa 4.35 PAS
41 IEHQ Resultado 7. Patrón distrófico DMB Control Dys1 Dys1 Dys2 Dys2 Distrofinas Dys3 Dys3 DMB= Distrofia Muscular de Becker
42 IEHQ Resultado 7. Patrón distrófico DMB Control DMB Control α α δ δ β β γ γ DMB= Distrofia Muscular de Becker Sarcoglicanos
43 IEHQ Resultado Marcadores Distrofias: Dys 1, Dys 2, Dys 3 utrofina: DRP1, DRP2 α-sarcoglicano β-sarcoglicano δ-sarcoglicano Γ-sarcoglicano β-distroglicano emerina merosina (laminina alfa-2) laminina beta 1 disferlina caveolina western-blotting Marcadores MFM: Miotilina Desmina ubiquitina Alfa-Bcristalina Filamina C Dys1 Gelsolina 5 Diagnóstico Marcadores linfocitarios: CD4, CD8, MHC clase I Patrón inflamatorio Miopatías inflamatorias: DM, IBM, Polimiositis 7 Patrón distrófico 6 Patrón MFM
44 Western-Blot Técnica de western blotting 1.-Extracción de proteínas (desnaturalización-estructura primaria) 2.-SDS-PAGE ±% acrilamida + Marcador con p.m. conocidos + electroforesis 3.-Blotting + IEHQ Revelado en un film - quimioluminiscencia PM= pesos moleculares SDS-PAGE=sodium dodecil sulfate polyacrilamide gel
45 Western-Blot Técnica de WB en la biopsia muscular Mini-protean III. Electroforesis SDS-PAGE Geles teñidos con coomassie
46 Western-Blot Técnica de western blotting Semy-dry Ponceau, tinción inespecífica de proteínas en las membranas después de la transferencia
47 Western-Blot Técnica de western blotting en la biopsia muscular Cámaras de incubación para los anticuerpos Revelado en cámara oscura con luz de seguridad
48 Western-Blot Técnica de western blotting Diferentes exposiciones en dos films
49 Western-Blot: resultado Técnica de western blotting: Distrofia de Becker Fig.1 Dys1 Dys2 Dys3 α β δ γ 400 kda 50 kda 35 kda Fig Coomassie 200 kda Fig. 1 Extractos de proteínas de un músculo sano control (carril 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) y el probando (carril 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14) donde se observa una disminución en la inmunotinción de todas las proteínas y un ligero cambio de peso molecular en la Dys 1( patrón típico de la distrofia de Becker) Fig. 2 Control de carga teñido con coomassie 8 6 Control Probando Dys 1 Dys2 Dys3 Alfa Beta Delta Gamma
50 Western-Blot: resultado Técnica de western blotting teletonina disferlina kda kda Miosina Coomassie control probando control Miosina Coomassie control probando control Carril 1 y 3: control de músculo sano. Carril 2: probando. Se aprecia la ausencia de teletonina en una distrofia muscular autosómica recesiva tipo 2G causada por mutación en el gen de la teletonina, y de disferlina en una disferlinopatía
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