XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DETECCIÓN DE GLICOMACROPEPTIDO (GMP) EN LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS MEDIANTE WESTERN BLOT.

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1 DETECCIÓN DE GLICOMACROPEPTIDO (GMP) EN LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS MEDIANTE WESTERN BLOT. Chávez Vela N.A a*, Salinas Miralles E.M a, Jáuregui Rincón J a, Palomares Aguilera L A b, Fernando Bon Rosas F a. a Depto. de Ingeniería Bioquímica, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes, Av. Universidad # 940, C.P , Aguascalientes, Ags. México. * b Depto.de medicina molecular y bioprocesos, Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México, Apartado Postal 510-3, C.P , Cuernavaca, Mor. México. RESUMEN: La leche contiene una gran cantidad de compuestos biológicamente activos. Un péptido de gran interés presente en el lactosuero es un glicomacropéptido (GMP) que resulta de la digestión de la κ-caseína. Este péptido tiene numerosas funciones biológicas como estimulante de bifidobacterias, fuente de ácido siálico, actividad antiviral, modulador de las secreciones gástricas, modulador de la respuesta inmune y da lugar a péptidos con actividad antitrombótica. Actualmente en el mercado hay alimentos novedosos que dicen contener GMP, por tanto, es necesario tener un método para detectar este péptido como un control de calidad. Los métodos existentes que detectan GMP requieren mucho trabajo, tiempo y presentan problemas de sensibilidad y precisión a bajas concentraciones. Así pues se requiere una metodología rápida, sensible y precisa para detectar GMP. Las técnicas inmunológicas presentan estas características, razón por la cual en este trabajo se desarrolló un inmunoensayo mediante la técnica de western blot usando anticuerpos policlonales anti-gmp. Este ensayo resultó ser más sencillo, rápido sensible y específico que otros que se han reportado hasta ahora. El método puede detectar hasta 0.001% p/v y con este se logró detectar exitosamente GMP en alimentos comerciales. ABSTRACT: Milk contains a large number of biologically active compounds. A peptide of interest present in the whey is a glycomacropeptide (GMP) resulting from the digestion of κ-casein. This peptide has many biological functions as a stimulant of bifidobacterias, a source of sialic acid, antiviral activity, gastric secretions modulator, modulator of the immune response and results in peptides with antithrombotic activity. At present, there are novel commercial foods that claim to contain GMP, therefore, is necessary a method to detect this peptide as a quality control. Existing methods to detect GMP require much work, time and have problems with sensitivity and precision at low concentrations. Immunological techniques are of great sensitivity and specificity, based mainly on the high specificity of the antibodies to an antigen. Antigens can be detected and measured in samples without prior purification, concentration, extraction or special treatments. The aim of this study was to develop a novel western blot analysis for GMP detection, using anti-gmp polyclonal antibodies. This assay is easy, rapid, sensitive and specific and can detect 0.001% w/v furthermore, it can be used successfully to detect GMP in various food matrices containing this peptide. Palabras clave: Glicomacropeptido, Western blot, anticuerpos policlonales. LA621

2 INTRODUCCIÓN La fracción proteica de la leche contiene una gran cantidad de compuestos biológicamente activos, como son proteínas y péptidos que normalmente son inactivos dentro de la secuencia de la proteína nativa pero que una vez que son liberados por hidrólisis enzimática, ya sea durante la digestión gastrointestinal o durante el procesado de alimentos, estos péptidos presentan una actividad moduladora de numerosos procesos dentro del organismo. Uno de estos péptidos es un glicomacropéptido (GMP), que obtiene por la acción de la hidrólisis por la acción del cuajo de la κ-caseína que se encuentra en leche. Glicomacropeptido (GMP). Cuando la κ-caseína es tratada con la quimosina durante la obtención de quesos, la proteína es hidrolizada entre los aminoácidos 105 y 106 de la κ-caseína, que son fenilalanina y metionina respectivamente, dando como resultado dos fracciones que son: para-κ-caseína (residuo 1 105) y GMP (residuo ) el cual es removido con el suero de quesería. El GMP queda soluble en el suero después de separar la cuajada, pero no está presente en la leche, por lo tanto la detección de GMP puede utilizarse como indicador de la presencia de suero de quesería. Este es péptido de gran interés ya que se le atribuyen numerosas funciones biológicas como ser factor estimulador de bífido bacterias (al contener oligosacáridos), fuente de ácido siálico (importante para el desarrollo cerebral) del lactante, actividad antiviral (debido a los residuos de ácido siálico), modulador de las secreciones gástricas y puede ser objeto de nuevas digestiones dando lugar a péptidos bioactivos con actividad antitrombótica (Jiménez et al., 2001). Detección del GMP. Actualmente en el mercado hay alimentos novedosos que dicen contener GMP, por tanto, es necesario tener un método para detectar este péptido como un control de calidad. El empleo de técnicas cromatográficas para la determinación de GMP ha dado muy buenos resultados; Olieman y van de Bedem (1983) desarrollaron un método cromatográfico capaz de detectar la presencia del GMP, los resultados de esta investigación sugirieron un límite inferior en la detección del GMP del 0.8%, sin embargo, el método tiene el inconveniente de dar resultados falsos positivos en el caso de leches en las que se haya desarrollado una población relativamente alta de bacterias psicrotrofas como Pseudomonas sp. ya que durante el almacenamiento refrigerado antes de su procesado, se generan péptidos de peso molecular similar al del GMP. Galindo et al. (2006) mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) detectaron GMP, sin embargo este método también presenta el inconveniente de dar falsos positivos. Todos estos métodos además de presentar el inconveniente de dar resultados falsos positivos, requieren mucho tiempo (desde 1 a 3 días) pues se tiene que obtener y purificar previamente el GMP (Tomczak et al.,, 2007). Así pues se requiere una metodología más rápida, sensible y precisa para poder detectar este péptido. Técnicas que son más rápidas, sensibles y precisas son las inmunológicas, LA622

3 debido a la alta especificidad de los anticuerpos hacia un antígeno. Los antígenos pueden ser detectados y medidos en muestras sin purificación previa, concentración o tratamientos especiales. Debido a lo anterior, en este trabajo se desarrolló un inmunoensayo con el fin de detectar GMP en productos comerciales. El inmunoensayo desarrollado fue el western blot para el cual se utilizaron anticuerpos policlonales anti-gmp de obtención propia. Este método es más rápido, sensible y preciso. METODOLOGÍA Muestras: GMP (CGMP-10; Arla Foods Amba, Denmark), leche cruda de vaca (control negativo de GMP) y suero proveniente de quesería (control positivo de GMP). a) Obtención de anticuerpos policlonales anti-gmp.- Se inmunizaron 7 conejos hembras, adultos, de la cepa Nueva Zelanda. Se realizaron 4 pautas de inmunización, inoculando 1 mg/ml de GMP en cada una y utilizando Adyuvante de Freund como estimulador de la respuesta inmune del animal. La producción de anticuerpos anti-gmp se verificó mediante electroforesis y western blot. Los anticuerpos obtenidos se purificaron utilizando: 1º ) (NH 4 ) 2 SO 4, 2º) ácido caprílico y 3º) por inmunoafinidad en una columna de cromatografía con GMP unido. Con los anticuerpos puros se desarrollaron western blots a muestras de GMP, de n suero de quesería con el fin de detectar GMP. Se verificó la pureza de los anticuerpos por electroforesis SDS-PAGE 10% (Holden et al., 2005) b) Desarrollo de western blot.- Se llevó a cabo una separación electroforética de proteínas de las muestras a analizar (leche y productos con suero de leche o GMP, GMP) por SDS-PAGE 13.5% bajo condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente del gel a membranas de nitrocelulosa de un kit (One-Step Western Kit) por 2 h a 100 mamp. La detección de GMP se realizó con los anticuerpos anti-gmp purificados (dilución 1:1000) y con una solución con cromosensor del kit. Con esta metodología se analizaron también muestras de leche con diferentes porcentajes de GMP con el fin de determinar el límite de detección del análisis. De manera adicional se llevó a cabo un western blot de productos comerciales como yogurt, margarina y suplemento dietético que contenían suero de quesería, para determinar si en estos se podía detectar el GMP. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se obtuvieron anticuerpos policlonales anti-gmp puros, lo que se comprobó por electroforesis y western blot: en el primer análisis se observó la presencia de dos bandas proteicas de 25 y 50 kda que son las que corresponden al PM de las IgG; mediante western blot se comprobó la actividad de los anticuerpos frente al GMP, donde aparecen dos bandas proteicas de PM de 14 y 20.1 kda que son las que corresponden al PM del GMP (figura 1). Por este análisis se probó también la LA623

4 especificidad de los anticuerpos por el GMP, ya que al analizar muestras de leche sin GMP, estas no dieron reacción, lo que indica que no hay reactividad cruzada con otros componentes de la leche (figura 1). La sensibilidad del método western blot fue mayor para detectar GMP ya que Olieman y van de Bedem (1983) lograron detectar 0.8% p/v de GMP mediante un método cromatográfico y Galindo et al. (2006) por HPLC lograron detectar hasta 1% mientras que por western blot, la sensibilidad fue hasta 0.001% p/v (figura 1). Los métodos reportados requieren equipo más complejo y caro que el western blot y se requiere la separación y purificación previa del GMP del producto donde se encuentre lo que requiere un tiempo al menos de 6 horas, además del tiempo de análisis. Con el western blot el tiempo total de análisis desde que se tienen las muestras fue de 4.5 h. Por tanto, el método western blot para detectar GMP por anticuerpos policlonales anti-gmp resultó ser un método más sencillo, rápido, más sensible y menos caro L % de GMP en leche (p/v) Figura 1. Límite de detección de GMP mediante análisis western blot usando anticuerpos policlonales anti-gmp. Leche con concentraciones crecientes de GMP. Los anticuerpos se usaron a una dilución de 1:1,000; L: 10 µl de leche procesada sin suero o sin GMP (control negativo). Las flechas indican las bandas de PM características del GMP. Otra ventaja del método western blot es su especificidad para detectar GMP, mientras que en otros métodos tales como HPLC y SDS-PAGE, no es definitiva la identificación del GMP, debido a péptidos de peso molecular similar al GMP que pueden estar presentes en la leche por acción de microorganismos psicrófilos (Alcázar et al., 2000). Estos pueden dar resultados falsos positivos en el análisis de leche y productos lácteos. LA624

5 El análisis western blot detectó exitosamente GMP en alimentos comerciales que contiene suero de leche o GMP, tales como suplemento dietético, yogur y margarina. En la margarina se identificaron tres bandas proteicas de 45, 20.1 y 14 kda de PM. En el suplemento dietético y yogur, solamente el agregado de 20.1 kda fue detectado (figura 2). kda kda 14 L SD MA YO GMP Figura 2. Análisis western blot de diferentes alimentos comerciales con suero de quesería (GMP) usando anticuerpos policlonales anti-gmp diluidos 1:1,000. L: 10 µl de leche procesada sin suero o sin GMP (control negativo); SD: 10 µl de suplemento dietético procesado; MA: 5 µl de margarina procesada; YO: 10 µl de yogur procesado; GMP: 10 µg de GMP puro (control positivo). Las flechas indican las bandas de PM características del GMP. CONCLUSIONES En este trabajo se logró desarrollar un método mediante inmunoensayo para detectar GMP, un péptido de interés biológico. Este método fue el western blot y resultó ser más sensible, rápido, exacto, específico y precisos que otros métodos que se han desarrollado hasta ahora. Para el desarrollo del método se utilizaron anticuerpos policlonantes anti-gmp de obtención propia. La detección del GMP fue exitosa tanto en leche a la que se le adicionó GMP o suero de quesería, así como en productos alimenticios que contienen lactosuero o GMP. Además el western blot es menos costoso que otros métodos que requieren equipo y reactivos caros. LA625

6 El sistemas desarrollados son una buena alternativa para aplicarse en el análisis como control de calidad de productos que dicen contener este péptido. REFERENCIAS Alcázar MC, Rosas J, Jaramillo AC, Peña S Detección de glucomacropéptido (GMP) como indicador de adulteración con suero de quesería en leche deshidratada. Veterinaria México. 37(3): Galindo L, Valbuena E, Rojas E Estandarización de la detección del glicomacropéptido por PAGE-SDS como índice de adulteración de leche. Revista Científica FCV-LUZ 16(3): Holden L, Fæste C, Egaas E Quantitative Sandwich ELISA for determination of Lupine (Lupinus spp.) in foods. Journal Agricultural Food Chemistry. 53: Jiménez B, Martínez A, J Bouza Bioactive milk peptidos and proteins. Asr Pharmaceutical. 42: Olieman, C,. Van dem Dedem A sensitive HPLC method of detecting and estimating rennet whey total solids in skim milk powder. Neth Milk Dairy. 37:27-36 Tomczak TL, Noemberg LE, L Bileski C Review: Isolation and purification of milk whey glycomacropeptide. B.CEPPA.Curitiba.25 (1): LA626

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