SI TRABAJAS CON GENES

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1 Catálogo de Capacidades Científico Técnicas 1

2 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO TABLA DE CONTENIDO SI TRABAJAS CON GENES ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA 1. Análisis de la actividad de promotores mediante genes reporteros Microarrays PCR cuantitativa a tiempo real Ensayos Run-On Short interfering RNA/Small interfering RNA (sirna) Microinyección de morfolinos Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP y ChIP on Chip) Northern-Blot Southern-Blot Primer Extension Librerías de microrna ANÁLISIS DE INTERACCIÓN PROTEÍNA-DNA O PROTEÍNA-RNA 1. Ensayos de cambio de movilidad electroforética (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA/ Band Shift) Huella genética o Footprinting TRANSGÉNESIS GENÓMICA COMPARADA ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS HIBRIDACIÓN IN SITU 2

3 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS IN VITRO 1. Modelo de adhesión leucocitaria en monocapas endoteliales Modelo de migración o extravasación leucocitaria a través de monocapas endoteliales Modelo de permeabilidad del endotelio Modelo de formación de angiotubos en matrigel Modelo de invasión en colágeno I Modelo de isquemia cerebral murina Modelo de migración celular y cierre de herida (Modelo in vitro de reendotelización) Modelo de diferenciación de células dendríticas Modelo de activación de linfocitos y estudio de la polarización de la respuesta inmune Modelo de generación de sinapsis inmunológica de presentación antígeno y superantígeno dependientes Modelo de silenciamiento de ILK en células endoteliales MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS IN VIVO 1. Modelo de air-pouch de extravasación o reclutamiento leucocitario Modelo de neovascularización Modelo de implantación de matrigel subcutáneo Modelo de implantación tumoral Modelo de retinopatía isquémica Modelo de hipertrofia cardiaca en ratas inducida por hipertensión arterial sistémica Modelo de isquemia en extremidad inferior (Limb isquemia o ligación de arteria femoral) Modelo de infarto de miocardio en ratón Modelo de isquemia/reperfusión de miocardio en ratón Modelos de generación de transgénicos en pez cebra Modelo de isquemia cerebral reversible murina Procedimiento para la generación de modelos murinos de aneurismas de aorta abdominal

4 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO 13. Modelo murino de denudado de arteria aorta Modelos de peces cebra con alteraciones en el desarrollo cardiaco Modelo de activación de linfocitos y estudio de la polarización de la respuesta inmune Modelos murinos para el estudio del envejecimiento de las células madre hematopoyéticas Modelo de edema en oreja de ratón Modelo de inducción de endotoxemia por administración de LPS o LPS/D-galactosamina Modelo murino de asma alérgico Modelo murino de inflamación aguda DETECCIÓN ANATÓMICA DE ÓRGANOS AISLAMIENTO DE ÓRGANOS 4

5 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO SI TRABAJAS CON PROTEÍNAS EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES 1. Expresión de proteínas en bacterias Expresión de proteínas en eucariotas mediante sistemas virales SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS 1. Electroforesis bidimensional clásica (2D) Electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) Cromatografía de afinidad IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS 1. Digestión enzimática automatizada de proteínas en gel para su identificación por espectrometría de masas Determinación de huella peptídica de masa mediante MALDI-TOF Determinación de huella peptídica de fragmentación mediante MALDI-TOF/TOF Análisis de mezclas poco complejas de proteínas mediante cromatografía líquida acoplada a trampa iónica (nlc-ms/ms) Secuenciación de péptidos en disolución mediante nanospray off-line Análisis de mezclas complejas de proteínas mediante cromatografía bidimensional acoplada a trampa iónica (MudPIT) DETERMINACIÓN DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES EN PROTEÍNAS 1. Identificación de modificaciones post-traduccionales mediante cromatografía líquida acoplada a trampa iónica nlc-ms/ms Identificación de modificaciones post-traduccionales mediante cromatografía líquida conectada a trampa iónica lineal conectada a un analizador de masas electrostático de alta resolución Orbitrap y fragmentación ETD Análisis de espectros de fragmentación mediante espectrómetro de masas híbrido (triple cuadrupolo-trampa iónica lineal) CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 1. Electroforesis bidimensional diferencial en gel (Differential Gel Electrophoresis-2D-DIGE) Marcaje isobárico diferencial (itraq) ANÁLISIS DE INTERACCIONES PROTEÍNA-LIGANDO 1. Co-Inmunoprecipitación

6 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO 2. Ensayos Pull-Down Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP y ChIP on Chip) Ensayos de cambio de movilidad electroforética (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA/ Band Shift) Huella genética o Footprinting TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS 1. Western-Blot Western-Blot 2D ELISA

7 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO SI TRABAJAS CON CÉLULAS Y TEJIDOS CULTIVOS CELULARES 1. Cultivo celular en condiciones de normoxia (21% o2) e hipoxia (3% o2) Cultivo de progenitores linfohematopoyéticos murinos y humanos Cultivo de larga duración de médula ósea murina Cultivo de líneas y Cultivos primarios de células gliales murinos Cultivo de endotelio de aorta de ratón Cultivos de líneas y cultivos primarios de células endoteliales de aorta vaca Cultivos de líneas y cultivos primarios de células endoteliales de cordón umbiilical humano (huvec) Cultivos de líneas y cultivos primarios de hepatocitos de ratón Cultvos de líneas y cultivos primarios fibroblastos embrionarios de ratón (MEF: Mouse Embryonic Fibroblasts) Cultivos primarios de células endoteliales de pulmón de ratón Cultivos primarios de células de músculo liso de ratón Cultivos primarios de células madre hematopoyéticas. subpoblaciones long-term, short-term y progenitoras Cultivos primarios de macrófagos peritoneales Cultivos primarios de células de médula ósea Cultivos celulares primarios de endotelio de vasculatura coronaria de ratón Cultivos celulares inmortalizados de endotelio de pulmón de ratón Cultivos celulares inmortalizados de endotelio de vasculatura coronaria de ratón SEPARACIÓN DE CÉLULAS 1. Separación de poblaciones celulares mediante citometría de flujo (cell sorting) Aislamiento de células mediante catapultado por presión de láser (Laser Pressure Catapulting) en cultivo o de muestras procedentes de muestras de tejido Separación de células mediante métodos inmunomagnéticos ANÁLISIS DE POBLACIONES CELULARES 1. Determinación de parámetros estructurales y funcionales mediante citometría de flujo Inmunofenotipaje celular

8 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO 3. Análisis de proliferación y ciclo celular Análisis de viabilidad celular Análisis multiplexado Análisis de procesos de migración celular Rastreo de alto contenido (HCS) VEHICULIZACIÓN DE MOLÉCULAS AL INTERIOR CELULAR 1. Microinyección de sustancias Transfección Vehiculización de fármacos al interior celular a través de microesferas MICOSCOPÍA CONFOCAL Y MULTIFOTÓN 1. Localización intracelular de moléculas Obtención de imágenes mediante microscopía de fluorescencia tradicional o confocal Análisis de parámetros morfométricos y de intensidad de fluorescencia de imágenes celulares Adquisición y Análisis de imágenes en 3D y 4D

9 ÍNDICE DE CONTENIDOS DEL CATÁLOGO SI TRABAJAS CON EMBRIONES EMBRIONES DE RATÓN 1. Cultivo de embriones de ratón pre-implantación Microinyección pronuclear de cigotos de ratón con soluciones de ADN Microinyección subzonal o perivitelina con lentivirus recombinantes Producción de quimeras de ratón por agregación de embriones con células madre embrionarias Producción de quimeras de ratón por microinyección de embriones de ocho células o blastocistos con células madre embrionarias Rederivación de líneas de ratón por transferencia embrionaria Fertilización in vitro (FIV) de ovocitos de ratón Inyección Intracitoplásmica de Esperma (ICSI) en ratón Interrupción de genes en células madre embrionarias de ratón Criopreservación de líneas de ratón EMBRIONES DE POLLO 1. Embriología experimental en embriones de pollo Manipulaciones del embrión de pollo Aplicación de moléculas en embriones de pollo in ovo Electroporación en embrión de pollo EMBRIONES DE PEZ ZEBRA 1. Microinyección de moléculas en oocitos de pez cebra Generación de peces cebra mosaicos Hibridación in situ de ARNm en embriones de pez cebra

10 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA SI TRABAJAS CON GENES ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA 1. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DE PROMOTORES MEDIANTE GENES REPORTEROS La actividad de un promotor puede medirse de diversas formas. En esta técnica en particular, el promotor a analizar se fusiona a una secuencia que codifica para una proteína (gen reportero) cuya actividad pueda ser fácilmente cuantificable. De esta forma, midiendo los niveles de la proteína codificada por el gen reportero puede analizarse el nivel de actividad del promotor baja cuyo control se expresa. Dos de los casos más frecuentes utilizan como gen reportero el gen que codifica para la proteína luciferasa o para la proteína verde fluorescente, cuyas actividades pueden medirse fácilmente ya que tienen como resultado la producción de luz blanca o verde fluorescente respectivamente. APLICACIÓN: Analizar la actividad de un promotor. Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelación de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Laboratorio: Regulación de la Expresión Génica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 2. MICROARRAYS Consiste en inmovilizar moléculas de ADN en un soporte físico de manera que dichas moléculas pueden ser identificadas utilizando las técnicas adecuadas. Según el tipo de análisis que se quiera realizar, las moléculas de ADN pueden tener distintas procedencias y pueden inmovilizarse de diferentes formas, dando lugar a diversos tipos de microarrays. El CNIC dispone de distintas plataformas tecnológicas para el análisis de microarrays de DNA, así como conocimiento para el tratamiento estadístico de los datos procedentes de cada una de ellas: 10

11 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA - microarrays de Agilent Technologies - microarrays de Affymetrix APLICACIÓN: Con esta técnica puedes detectar si un determinado gen se expresa en una célula en unas condiciones determinadas y obtener información sobre él (su posición en el genoma, su secuencia, su expresión diferencial en distintas situaciones, etc.) Unidad de Genómica Responsable: Ana Dopazo González 3. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL Consiste en realizar la amplificación de una secuencia de ácido nucleico por PCR y monitorizar la producción de amplificados después de cada ciclo de amplificación mediante fluorescencia, gracias a la utilización de un fluoróforo capaz de unirse al ácido nucleico de doble cadena. De esta forma, tras cada ciclo de amplificación se mide la fluorescencia y, en función del número de ciclos de amplificación necesarios para detectar la fluorescencia del producto amplificado, puede determinarse la cantidad de partida del producto. APLICACIÓN: Esta técnica tiene múltiples aplicaciones. Con ella podrás saber la cantidad de ácidos nucleicos o de un gen determinado que hay en una muestra. Unidad de Genómica Responsable: Ana Dopazo González Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelación de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Células Madre Responsable: Susana González 11

12 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA Laboratorio: Comunicación Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Sánchez-Madrid Laboratorio: Regulación de la Expresión Génica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Laboratorio: Moléculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martín 4. ENSAYOS RUN-ON Esta técnica permite analizar qué genes están siendo expresados en una célula en un momento determinado. Se basa en que cuando se extrae el núcleo intacto, la trascripción del DNA que se esté llevando a cabo queda paralizada al eliminarse los ribonucleótidos. Dicha transcripción puede reiniciarse in vitro añadiendo nuevamente ribonucleótidos para detectar el mrna de los genes que estaban siendo transcritos en el momento del lisado. APLICACIÓN: Con esta técnica podrás averiguar qué genes se están expresando en la célula en un momento determinado. Laboratorio: Regulación de la Expresión Génica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Células Madre Responsable: Susana González 5. SHORT INTERFERING RNA/SMALL INTERFERING RNA (SIRNA) La interferencia por RNA es un mecanismo de control de la expresión génica que permite el bloqueo selectivo de la expresión de genes específicos. Es necesario disponer de fragmentos de RNA de entre 19 y 22 nucleótidos y con una secuencia homóloga a la del gen cuya expresión se desea silenciar. Estos fragmentos de RNA, denominados RNA interferentes pequeños (sirna), pueden emparejar por complementariedad con el mrna del gen que se quiere silenciar y al hacerlo, las moléculas de doble 12

13 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA cadena resultantes entre el mrna y los fragmentos de sirna son degradados por nucleasas celulares, de forma que el trascrito del gen es eliminado y su expresión paralizada. APLICACIÓN: Con esta técnica podrás inhibir la expresión de un gen cuya secuencia conozcas, al menos parcialmente. Laboratorio: Regulación de la Expresión Génica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Laboratorio: Señalización Celular Responsable: Kenneth McCreath Laboratorio: Comunicación Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Sánchez-Madrid 6. MICROINYECCIÓN DE MORFOLINOS Los morfolinos son oligonucleótidos antisentido en cuya estructura molecular el anillo de azúcar se ha sustituido por un anillo de morfolina, para conferirles más estabilidad. Su secuencia es complementaria a la de un mrna al que se puede unir bloqueando su traducción o splicing. Por lo tanto, el uso de morfolinos permite bloquear la expresión de un gen particular a nivel del bloqueo de la traducción de su mrna o a nivel del bloqueo de su splicing correcto. APLICACIÓN: Estudiar la expresión de un gen concreto mediante el bloqueo de la síntesis de la proteína para la cual codifica a nivel de la traducción del RNAm. En concreto, se utiliza la microinyección de morfolinos en pez cebra para el análisis y búsqueda de nuevos genes con efectos en angiogésesis. Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Biología del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader 13

14 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA 7. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP Y CHIP ON CHIP) La Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, Chromatine Inmunoprecipitation) consiste en el aislamiento, mediante anticuerpos específicos contra un factor nuclear, de las secuencias genómicas asociadas al mismo, tras la estabilización covalente de los contactos proteína-dna y la fragmentación de la cromatina. El DNA co-precipitado con el factor nuclear es analizado para identificar la secuencia a la que estaba unido dicho factor. El método de análisis más corriente es la amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos del DNA inmunoprecipitado. Esta aproximación requiere un conocimiento previo de la secuencia de DNA de forma que su utilidad es limitada para el estudio de las secuencias desconocidas a las que se une proteína determinada. Esta limitación ha sido resuelta mediante aproximaciones genómicas gracias la hibridación del DNA precipitado sobre microarrays genómicos. Es lo que se denomina tecnología ChIP on-chip. APLICACIÓN: La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite determinar si un factor de transcripción está unido a su diana en el genoma en una situación concreta. Además, utilizando la técnica de ChIp on Chip se pueden identificar secuencias de unión desconocidas para un factor de transcripción. Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 8. NORTHERN-BLOT Consiste en separar una muestra de RNA (normalmente RNA mensajero) mediante electroforesis en gel, para posteriormente transferir los fragmentos separados a una membrana de nitrocelulosa donde serán inmovilizados. Esa membrana se pone en contacto con una sonda de DNA o RNA que reconozca una secuencia de interés, de forma que se fijará allí donde ésta se sitúe. APLICACIÓN: Podrás detectar la presencia de un RNA de interés en una muestra siempre que dispongas de una sonda adecuada. La aplicación más habitual es averiguar si un gen determinado está siendo expresado en un momento concreto o en un tipo celular particular mediante la detección de su RNA mensajero. 14

15 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 9. SOUTHERN-BLOT Consiste en separar una muestra de DNA (por ejemplo, procedente de una digestión con una enzima concreta) mediante electroforesis en gel para posteriormente transferir los fragmentos de DNA separados y desnaturalizados (es decir, en forma de una sola cadena y no de doble hélice) a una membrana de nitrocelulosa donde serán inmovilizados. Esa membrana se pone en contacto con una sonda de DNA o RNA que reconozca una secuencia de interés de forma que se fijará allí donde ésta se sitúe. APLICACIÓN: Podrás detectar la presencia de un gen o secuencia de DNA de interés en una muestra siempre que dispongas de una sonda adecuada. Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 10. PRIMER EXTENSION Consiste en generar una molécula de cdna utilizando como molde una molécula de RNAm mediante una transcriptasa reversa de tal forma que la transcripción se realice sobre la molécula de RNAm a partir de un pequeño oligonucleótido (Primer) complementario. El transcrito generado será el equivalente al gen original a partir del cual se generó el RNAm y su secuenciación permitirá determinar exactamente cual el inicio de la transcripción del citado gen. Además, en función de las condiciones en la que se realice la retrotranscripción, la cantidad de cdna generada puede relacionarse directamente con los niveles de RNAm originales y por lo tanto indicar los niveles de expresión del gen a partir del cual se generó. APLICACIÓN: Con esta técnica podrás determinar en qué punto comienza la transcripción de un gen concreto, lo cual además te facilitará la identificación de la zona promotora. También podrás medir la cantidad de un transcrito particular. 15

16 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 11. LIBRERÍAS DE MICRORNA Los micrornas (mirna) son moléculas de RNA de doble cadena de 22 nucleótidos, que regulan la expresión génica a nivel post-transcripcional. Los micrornas son transcritos de DNA pero no traducidos a proteína, es decir, son moléculas de RNA no codificante, que se encuentran en regiones no codificantes del genoma. Estas moléculas son parcialmente complementarias a uno o más mrnas reprimiendo así su traducción. Los micrornas juegan un papel importante en varios procesos biológicos como apoptosis, proliferación, diferenciación o desarrollo celular. La función de estos micrornas puede estudiarse in vitro y, mediante técnicas de biología molecular, construirse una librería o colección de estas moléculas de donde poder aislarlas posteriormente para su uso. APLICACIÓN: Estas librerías de mirna pueden ser utilizadas para estudiar si la expresión de un gen de interés está regulada en la célula a nivel de mirna. Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Células Madre Responsable: Susana González 16

17 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE INTERACC IÓN PROTEÍNA-DNA O PROTEÍNA RNA ANÁLISIS DE INTERACCIÓN PROTEÍNA-DNA O PROTEÍNA-RNA 1. ENSAYOS DE CAMBIO DE MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA (ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY-EMSA/ BAND SHIFT) Es una técnica que permite analizar las interacciones proteína-ácido nucleico (DNA o RNA). La técnica se basa en el hecho de que la capacidad de migración de una molécula de ácido nucleico en un gel de electroforesis se ve modificada cuando esta molécula está unida a una o varias proteínas. De esta forma, cuando a un fragmento de ADN se migra en un gel de electroforesis en compañía de una proteína que es capaz de unirse a él, lo hace a una velocidad menor a la que lo haría en ausencia de dicha proteína. APLICACIÓN: Con esta técnica podrás determinar si una proteína concreta es capaz de unirse por sí sola o con otras proteínas a una secuencia de DNA o RNA particular. También podrás saber si en una mezcla de proteínas hay alguna capaz de unirse a una secuencia de DNA o RNA particular. Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelación de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Laboratorio: Regulación de la Expresión Génica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo 2. HUELLA GENÉTICA O FOOTPRINTING Esta técnica consiste en determinar la secuencia de DNA exacta a la que es capaz de unirse una proteína concreta. La determinación se basa en el hecho de que una proteína, cuando está unida a una secuencia del DNA, protege a dicha secuencia de ser cortada por un enzima capaz de cortar moléculas de DNA como por ejemplo la DNAsa I. Tras un tratamiento DNAsa I de un DNA al cual se encuentra unido una proteína y la separación por electroforesis en gel de los fragmentos de la digestión, se observará que hay una serie de fragmentos de digestión que no se han producido como resultado de la unión de la proteína. Comparando estos fragmentos de digestión con los de la digestión del mismo DNA en ausencia 17

18 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE INTERACC IÓN PROTEÍNA-DNA O PROTEÍNA RNA de unión a la proteína, puede determinarse la secuencia a la que corresponden los fragmentos de digestión ausentes y por lo tanto la secuencia del DNA donde se encontraba unida la proteína. APLICACIÓN: Con esta técnica se puede saber a qué secuencia exacta del DNA se une una proteína de tu interés. Laboratorio: Regulación de Transcripcional de los Sistemas de Protección Frente al Estrés Oxidativo Responsable: María Monsalve 18

19 SI TRABAJAS CON GENE S TRANSGÉNESIS TRANSGÉNESIS La transgénesis es el conjunto de técnicas por las que se obtienen organismos genéticamente modificados. Éstos se consiguen introduciendo moléculas de ADN exógeno (transgén) en el genoma del organismo multicelular a modificar. Así se obtienen bien líneas estables, si el transgén se mantiene estable de forma hereditaria y afecta a todas las células del organismo, bien transgénesis transitorias, en los casos en los que el transgén no se integra de forma estable o en la línea germinal. Existen múltiples herramientas para integrar transgenes en células. Para más información puedes visitar la sección de Si trabajas con embriones de este catálogo. Ahí encontraras en detalle diferentes métodos y aplicaciones de la transgénesis. APLICACIÓN: Con esta técnica pueden integrarse fragmentos de DNA en el genoma de una célula u organismo para generar, por ejemplo, animales transgénicos, que expresen o carezcan de la expresión de un determinado gen. Unidad de Transgénesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodríguez Departamento: Biología del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genómica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazón Responsable: Miguel Manzanares 19

20 SI TRABAJAS CON GENE S GENÓMICA COMPARADA GENÓMICA COMPARADA La genómica comparada es el estudio de las relaciones entre los genomas de diferentes especies, de manera que una vez secuenciados se comparan sus estructuras utilizando como herramienta la bioinformática. La genómica comparada presupone que los elementos del genoma responsables de similitudes entre diferentes especies se conservarán a lo largo del tiempo, así como los elementos que son importantes para el éxito evolutivo de los organismos. APLICACIÓN: Utilizando esta técnica pueden localizarse regiones conservadas del genoma que no codifican para ninguna proteína y que, por tanto, deben tener alguna función importante, seguramente como reguladores funcionales. Departamento: Biología del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genómica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazón Responsable: Miguel Manzanares 20

21 SI TRABAJAS CON GENE S ANÁLISIS DE POLIMORF ISMOS Y HAPLOTIPOS ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS El polimorfismo genético se refiere a la existencia de variaciones en la secuencia de una región determinada del ADN entre diferentes individuos en una población. Por ejemplo, en el caso de un gen particular, los diferentes alelos del locus que codifica para ese gen constituyen diferentes polimorfismos del mismo. Por su parte, el haplotipo se define como la combinación particular de alelos presentes en una región del genoma y que se transmiten juntos. APLICACIÓN: Con esta técnica podrás identificar diferentes variantes de un gen concreto o relacionar dos muestras por la presencia de haplotipos similares. Otra aplicación de esta técnica es la de relacionar determinados polimorfismos o haplotipos con una patología concreta de forma que éstos puedan ser utilizados como marcadores de la presencia de dicha patología. Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad 21

22 SI TRABAJAS CON GENE S HIBRIDACIÓN IN SITU HIBRIDACIÓN IN SITU La técnica de hibridación in situ se basa en la capacidad que tienen los fragmentos de ácido nucleico de cadena sencilla de unirse a otros fragmentos de ácido nucleico de cadena sencilla cuya secuencia sea complementaria. Este proceso de hibridación puede hacerse de diferentes formas como en cortes de tejidos o en embriones, denominándose en este caso, hibridación in situ en whole mount. Este proceso consiste en utilizar un fragmento de ácido nucleico (sonda de ARN) para identificar la presencia en las células o tejidos de la correspondiente secuencia complementaria. En función del método de marcaje del fragmento utilizado para la hibridación, el resultado puede visualizarse por diferentes métodos, siendo el más habitual en biología del desarrollo la obtención de un precipitado coloreado. APLICACIÓN: Con esta técnica se analizar la expresión de un gen concreto si lo que utilizas es un fragmento de ácido nucleico capaz de hibridar con la cadena de RNA mensajero correspondiente. Departamento: Biología del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan José Sanz-Ezquerro 22

23 SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGIC OS MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS IN VITRO SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS MODELOS DE PROCESOS BIOLÓGICOS IN VITRO 1. MODELO DE ADHESIÓN LEUCOCITARIA EN MONOCAPAS ENDOTELIALES Este modelo permite estudiar la adhesión de los leucocitos a la superficie de las células endoteliales. Para ello se marcan células linfoides con sonda fluorescente y se incuban con una monocapa de células endoteliales estimuladas y tratadas según el diseño del experimento. Laboratorio: Regulación de la Expresión y Estabilidad Genética en Células Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad 2. MODELO DE MIGRACIÓN O EXTRAVASACIÓN LEUCOCITARIA A TRAVÉS DE MONOCAPAS ENDOTELIALES Este modelo consiste en tapizar un transwell con células endoteliales de tal forma que éstas formen una monocapa que imite la del endotelio. Cuando la monocapa está confluente se añaden leucocitos en el compartimento superior del transwell. Añadiendo los estímulos a estudiar puede analizarse cómo esos leucocitos son capaces de migrar y atravesar la capa de células endoteliales, imitando el proceso de migración que tiene lugar desde el torrente sanguíneo a los tejidos afectados durante un proceso inflamatorio. Este modelo puede realizarse utilizando un sistema de flujo laminar conectado al transwell y que imite la presión sanguínea habitual para mimetizar aún más las condiciones fisiológicas. La migración de los leucocitos puede analizarse por citometría de flujo o incluso pueden adquirirse imágenes o vídeos a tiempo real mediante microscopia de contraste de fase. 23

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