Metodologías basadas en la identificación del ADN: PCR, hibridación, secuenciación y análisis de secuencias.

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1 Metodologías basadas en la identificación del ADN: PCR, hibridación, secuenciación y análisis de secuencias. Dra. Sonia Arduino Dep. de Clínica Estomatología Facultad de Postgrado en Ciencias de la Salud UCA Ácidos nucleicos ADN ARN PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaccion en cadena de la polimerasa Separación de ambas hebras de ADN. unión de pequeños fragmentos (primers) extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. ADN-polimerasa obtenida de una bacteria termófila resistente a altas temperaturas 1

2 MODELOS DE CICLADORES TERMICOS ADITIVOS UTILIZADOS EN LA PCR Formamida Sulfato de Amonio Betaína (Trimetilglicina) DMSO (dimetilsulfóxido) BSA (seroalbúmina bovina) TMAC (cloruro de tetrametilamonio) detergentes no iónicos (Tween 20, NP- 40) INHIBIDORES DE LA PCR Contaminantes orgánicos e inorgánicos incluidos en la muestra de ADN Atenuan o inhiben completamente la reacción de PCR 2

3 PCR Molde (ADN o ARN) Primer forward dntps (A;G;T;C) Mg 2+ Primer reverse ADN polimerasa termoestable Primers Moléculas simple cadena que se unen al ADN o ARN molde ADN polimerasa termoestable Diferentes enzimas según su funcionalidad: relación de error (ideal para clonar) robustez (ideal para fragmentos largos) costo (ideal para epidemiología o detección de fragmentos de ADN) Taq polimerasa Vent polimerasa Pfu polimerasa Pfx polimerasa > cantidad de errores Utilizadas para clonar mediante mutagénesis sitio dirigida Desnaturalización Apareamiento Primers complementarios Elongación 3

4 PCR Verificación del producto de PCR en gel de agarosa Detección Migración en geles de Agarosa Detección con Bromuro de Etidio Marcador de peso molecular Fragmentos de PCR Usos de la PCR Diagnóstico (agente etiológico-mutaciones ) Biología Molecular- Investigación Genética Forense Estudios Evolutivos de ADN ancestros Sistemática Moderna Estudios Ecológicos Proyectos Genoma Expresión de genes, producción de proteínas recombinantes en diferentes organismos. Hot Start Se agrega la polimerasa en el paso de desnaturalización a 95 C NO ANTES!!! ADN molde Mg 2+ Primer forward dntps Primer reverse ADN polimerasa termoestable 4

5 Hot Start Utilidad Ventajas Aumenta la cantidad del producto deseado Elimina productos inespecíficos Mayor cantidad del producto deseado Tipos de PCR Utilizadas para el Diagnóstico AFLP PCR Colony PCR In situ PCR Multiplex PCR Nested PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP QC-PCR RAPD Real-Time PCR Rep-PCR AFLP PCR Combina AFLP y PCR Digestión con enzimas de restricción Ligación de adaptadores PCR Genera diferentes patrones de bandas si hay mutaciones en los sitios de restricción utilizados Zabeau & Vos in

6 PCR de Colonia Sin extracción previa del ADN Utilidad: Screening para determinar el producto de clonación Detección rápida de un gen para diagnóstico Ventaja: Ahorro de tiempo!!!!!! Multiplex Se agrega más de un par de primers 1 o más ADNs como molde Primers forward Primers forward Primers forward Primers forward dntps Mg 2+ Primers reverse Primers reverse Primers reverse Primers reverse ADN polimerasa termoestable Multiplex Ventajas: Detección de varios fragmentos de ADN en una misma reacción Altamente recomendado para diagnóstico Desventajas: Difícil y larga optimización!!! No deben darse falsos positivos 6

7 Nested PCR Dos pares de primers Primer par de primers (externos) Segundo par de primers (internos) Un par de primers externos para los primeros ciclos. Un par interno para la amplificación del producto. Utilizado para incrementar la cantidad del producto de amplificación y la especificidad. Touchdown PCR Se 1 C la T annealing en cada ciclo hasta una temperatura determinada PCR clásica Favorece la amplificación específica desde el inicio Nucleic Acids Res Jul 25;19(14):4008. PCR inversa Fragmento amplificado Fragmento amplificado Secuenciación o Hibridación 7

8 RT-PCR Amplificación de ADN a partir de ARN Comprobación de la transcripción de un gen (posible cuantificación con marcadores fluorométricos) Evaluación de la actividad de splicing de un intrón Evitar contaminación con ADN ARN ultrapuro!!! Real time PCR monitoreo de la reacción de PCR en la fase exponencial - Detección y cuantificación de un reporter fluorescente - Cuantificación de la emisión en cada ciclo - A mayor cantidad de ADN, mayor señal - Permite diferenciar alelos por la Tm de sus productos Ventajas: Ahorro de tiempo Adaptable a RT-PCR y Multiplex Higuchi et al. in 1993 SECUENCIACION Manual Automática 8

9 SECUENCIACION: METODOS Frederick Sanger (1970): secuencia completa de la molécula de insulina y demostró que las proteínas tienen una estructura específica, desarrolló un método de secuenciación en 1975 (Premio Nobel en 1980). El método didesoxi de Sanger emplea nucleótidos modificados (didesoxinucleótidos), que no poseen el hidroxilo (OH) en el extremo 3. El ADN se sintetiza in vitro utilizando un molde de la cadena que se desee secuenciar, un exceso de sustratos nucleótidos desoxi, una pequeña cantidad de didesoxi específico (A, T, C o G), un cebador o primer ypolimerasa. desoxinucleótidos primer molde ADN polimerasa didesoxinulétido Secuenciación manual cadenas de distinta longitud. La incorporación de un nucleótido didesoxi termina el proceso de síntesis (la polimerasa necesita un grupo hidroxilo en la posición 3 para poder agregar el siguiente nucleótido). Se realiza una corrida en gel sembrando las productos de las reacciones correspondientes al agregado de cada uno de los nucleótidos didesoxi. Se ven distintas bandas correspondientes a tamaños diferentes. MÉTODO DE SANGER (secuenciación manual) Molde Sustratos Enzima ADN dntps (G;T;A;C) ddntp (uno por tubo) γ 32 PdNTP T7 DNA polimerasa ddntps carecen del grupo 5 fosfato detienen la polimerización 9

10 MÉTODO DE SANGER (secuenciación manual) SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA Ventajas Mayor resolución Secuenciación de 96 muestras por corrida SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 10

11 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA Archivos.abi o.spf (cromatograma) acompañado de archivo.txt (secuencia) Cromatogramas permite verificar la calidad de secuencias y la corrección de nucleótidos Importante: ADN limpio!!!! SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA HIBRIDACION FISH Microarrays Dot Blot Southern Blot Northern Blot Hibridación de colonia 11

12 Marcado de sondas Radiactivo No Radiactivo Marcado del oligo con 32 P datp Marcación con compuestos químicos o colorimétricos (digoxigenina, biotina) Extremo 5 con T4 PNK y gp32 datp. Amplificación por PCR con ap32 dctp Utiliza enzima Terminal Transferesa y ddutp FISH (Hibridación in situ fluorescente) Detecta cromosomas o porciones de ellos, con moléculas fluorescentes Esta técnica es útil para identificar anomalías cromosómicas y elaborar mapas génicos y genéticos MICROARRAYS Utilizado para ADN y ARN Determinación de presencia de genes. Permite comparaciones inter e intraespecies Usos: Descubrir nuevos genes Diagnóstico de enfermedades Farmacogenómica (asociación entre perfil genético y respuesta terapéuticas a drogas) Toxicogenómica (evaluar cambios frente a sustancias tóxicas) Determinación de sistemas de regulación, stress bacteriano, respuesta celular mediante la expresión de los genes 12

13 Microarrays Dot Blot Utiliza muestras con ácidos nuc. sin purificar (ej: sangre, heces o esputos) Determinación de ausencia o presencia del fragmento de interés Ventaja: no hace falta hacer migración ni transferencia de ADN Hibridación de Colonia Detecta un fragmento de ADN en una colonia bacteriana Ventaja: Permite determinar frecuencia de eventos, aislar clones o determinar positivos de clonación Ideal para screening de bibiotecas genómicas 13

14 Southern Blot Hibridación de ADN 1er Paso 2do Paso 3er Paso 4to Paso 5to Paso Digestión del ADN Migración en Agarosa Transferencia a una membrana (nitrocelulosa o nylon) Hibridación Detección Utilidad: Evaluación de la presencia de genes de interés Localización del contexto Southern Blot Southern blot para detectar presencia de un gen transformado en una población mezcla de células. Film de rayos X revela cuales celoulas contienen el target ADN (gen) Gel de agarosa con muestras digeridas con una enzima de restriccion (EcoRI). El ADN tranferido a nitrocelulosa y luego se realizo Southern blot con una sonda de DNA (fragmento del gen transformado) marcado con radioactividad. 14

15 Northern Blot Hibridación de ARN Igual principio que para Southern Blot Permite evaluar la transcripción de un ARNm Permite cuantificar la expresión del ARNm comparando con un gen constitutivo Northern Blot Gel agarosa/formaldehído Autorradiograma WESTERN BLOT ELISA mide anticuerpos contra un virus total, dando positivo o negativo. Western blotting es mas especifico. Permite visualizar Acs contra proteínas virales (test confirmatorio para un ELISA de HIV). En HIV Western blotting, se hace electroforesis de proteínas en un gel Las proteínas migran, y se separan en función de cargas y pesos moleculares Las mas pequeñas migran mas rápido. 15

16 Western Blot Detección de proteínas Igual principio que para Southern y Nothern Blot Se utilizan geles de poliacrilamida Se pueden separar en Fn del tamaño y carga, o sólo en Fn del tamaño (agregado de SDS) Detección con anticuerpos HERRAMIENTAS DE BIOINFORMATICA DIAGRAMA DE OLIGOS (Primers) Primers para PCR Sondas para hibridación con ADN Sondas para hibridación con ARN Sondas para hibridación con proteínas Primers para generar ADN copias 16

17 DIAGRAMA DE OLIGOS (manual) Criterios a tener en cuenta Tamaño: 18-25nt (según su uso) % G+C: 55% 1er y últimos nt : G o C Extremo 3 libre de interacciones (evitar 2-3nt G o C) Diferencia de Tm entre primers 0-3 C Tm: entre 55 y 65 C DIAGRAMA DE OLIGOS (Programas) Acceder a secuencia nucleotídica en GenBank u otra base de datos (GenBank: Introducir la secuencia en el programa Seleccionar primer forward y primer reverse con igual criterio que diseño manual Podemos evaluar mejor: Formación de duplexes (apareamiento entre primers) Formación de hairpins Buscar ΔG más positivo!!!!!!! DIAGRAMA DE OLIGOS Confirmar en BLAST la especificidad y tamaño de producto de los primers diseñados Si no son específicos comenzar de nuevo!!!!! 17

18 ANALISIS DE SECUENCIAS Producto de amplificación por PCR purificado y cuantificado Secuenciación automática (Sequencer ABI 373 o equivalente) Análisis con programas: Sequencher V4.2(demo) BLAST V2.0 (Basic Local Alignment Search Tool) -BioEditV7.0 BLAST 18

19 BLAST BLAST V2.0 Blastn comparación nucleótido-nucleótido Blastx secuencia traducida-secuencia peptídica Blastp secuencia peptídica-secuencia peptídica Tblastn secuencia peptídica-secuencia traducida Tblastx secuencia traducida-secuencia traducida Bl2seq alineción de dos secuencias BLAST V2.0 Blastn más utilizado Secuencia conocida o número de acceso del GenBank Seleccionar organismo (bacteria, virus, etc.) Analizar el score 19

20 BLAST Copiar Secuencia con formato.txt Seleccionar organismo BLAST Selección del tipo de búsqueda BLAST Contexto Secuencia 20

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