ES A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA. 11 Número de publicación: Número de solicitud:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl. 7 : G01N 33/68 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Solicitante/s: Universidad de Barcelona Centro de Patentes. Baldiri Reixac, Barcelona, ES 43 Fecha de publicación de la solicitud: Inventor/es: López Tejero, María Dolores y Través Polo, María Carmen 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: Agente: Segura Cámara, Pascual 54 Título: Método de diagnóstico de la evolución de la masa intestinal absortiva en un individuo. 57 Resumen: Método de diagnóstico de la evolución de la masa intestinal absortiva en un individuo Conlleva el someter muestras de suero y/o plasma provenientes de la sangre del paciente a un inmunoensayo para determinar la cantidad de apolipoproteína humana apoa- IV, usando un anticuerpo específico obtenido a partir de apoa-iv intestinal, humana y purificada, de apoa-iv humana recombinante, o de un fragmento activo de apoa- IV humana. Se pueden usar ensayos de inmunodifusión por electroforesis, ELISA o Western blot. Comparado con los métodos clínicos habituales (endoscopia y biopsia en ayuno), es ventajoso porque no es invasivo para el paciente y porque puede ser fácilmente industrializado. Es útil para la diagnosis de desórdenes funcionales del intestino causados por un nivel anormal de masa intestinal funcionalmente efectiva, tales como la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia. ES A1 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Método de diagnóstico de la evolución de la masa intestinal absortiva en un individuo Esta invención trata sobre nuevos métodos de diagnóstico y kits en el área de la gastroenterología clínica, los cuales se basan en la determinación de una proteína natural de origen intestinal en el plasma y/o suero obtenido de un paciente. Estado de la técnica anterior Ciertas alteraciones funcionales del intestino que están causadas total o parcialmente por la ausencia (debido p.ej. a una pérdida o a falta de madurez) de masa absortiva intestinal funcionalmente efectiva son la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia, siendo la malabsorción una de las más frecuentes. La malabsorción (o sea, el empeoramiento de la absorción intestinal de nutrientes, principalmente azúcares y lípidos) es una patología intestinal que está asociada a determinadas condiciones fisiológicas como la malnutrición, la aerofagia, las alteraciones gastrointestinales y el malestar general. Una de las principales causas de la malabsorción es la atrofia intestinal o disminución de la superficie de la mucosa intestinal (es decir, la disminución de la masa total absortiva de las vellosidades intestinales). En relación con la terapia de las diferentes alteraciones funcionales del intestino, es interesante diagnosticar el estatus de la masa total absortiva funcionalmente efectiva de un individuo dado, tanto en diferentes etapas de su desarrollo individual (o sea, a diferentes edades), como a lo largo del tratamiento terapéutico del daño intestinal. Sin embargo, en la actualidad la mayoría de los métodos de diagnóstico usados con dicha finalidad son agresivos y están basados o en la endoscopia o en el análisis de muestras de biopsia yeyuna. La mayoría de clínicos diagnostican los síndromes de malabsorción mediante endoscopia y biopsia intestinal, pero dichas prácticas presentan ciertos inconvenientes y limitaciones. Así, en algunas ocasiones la biopsia intestinal no es representativa del estado de todo el intestino y se pueden observar áreas con mucosa mosaico, alternando áreas de vellosidades atrofiadas y normales (cf. S.C. Tawil et al., Scalloping of the valvulae conniventes and mosaic mucosa in tropical sprue; Gastrointest. Endosc. 1991, vol. 37, pp ). Además, la orientación de la biopsia puede ocasionalmente enmascarar el diagnóstico, no pudiendo ser detectada una atrofia intestinal parcial (cf. M. Cassaro et al., The dark sida of the gastric biopsy, Hum. Pathol. 1999, vol. 30, pp ). Alrededor de la mitad de los casos de enfermedad celíaca (intolerancia al gluten de la dieta) no pueden ser diagnosticados como tales ya que no presentan los síntomas característicos de malabsorción; y lo mismo ocurre con el esprúe tropical (estomatitis tropical). Estudios de cromoendoscopia, que permiten la magnificación de la mucosa intestinal durante la endoscopia, revelan que un número importante de atrofias parciales no se habrían detectado mediante la endoscopia clásica (cf. L.M. Siegel et al., Evaluation of latino expatriates for evident of tropical sprue (abstract) ; Gastroenterology 1995, vol. 108, p. A324). Por lo tanto, sería útil encontrar marcadores en suero y/o plasma que indiquen el estatus clínico de la mucosa intestinal, particularmente la atrofia intestinal, y obviar así el uso general de métodos invasivos como la biopsia yeyuna y la endoscopia. En la clínica, con la finalidad de diagnosticar la malabsorción intestinal, se han sugerido algunos métodos de determinación en el suero y/o plasma que difieren da la biopsia y la endoscopia clásicas. De acuerdo con uno de ellos, en pacientes con pancreatitis crónica la malabsorción lipídica se diagnostica por un test indirecto que mide la apolipoproteina B-48 (apob-48) en plasma después de una ingesta rica en lípidos (cf. B. Saviana et al., Diagnosis of lipid malabsorption in patients with chronic pancreatitis: a new indirect test using postprandial plasma apolipoprotein B-48, Am. J. Gastroenterol. 1999, vol. 94, pp ). La apob-48 se sintetiza en el intestino junto con los quilomicrones (lipoproteínas); además la obtención de anticuerpos a partir de esta lipoproteína es dificultosa dada la similitud molecular con otra apolipoproteína hepática, la apob-100. Este método requiere el aislamiento previo de las lipoproteínas, lo que es una fuente de limitaciones en el ámbito clínico (gran volumen de muestra sanguínea, equipos técnicos especiales y caros, pérdida de dicha apolipoproteína durante el aislamiento de los quilomicrones, etc.). Otro método está basado en la medida de la citrulina circulante mediante HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) como marcador de la malabsorción en los casos de síndrome de intestino corto (cf. P. Crenn et al., Postabsorptive plasma citrulline concentration is a marker of absorptive enterocyte mass and intestinal failure in humans; Gastroenterology 2000, vol. 119, pp ). Una gran limitación de este método es que se puede usar sólo en adultos, pues el inicio de la síntesis de citrulina en el enterocito tiene lugar después del destete del mamífero (cf. G. Wu et al., Synthesis of citrulline from glutamine in pig enterocytes; Biochemical J. 1994, vol. 299, pp ). También se ha propuesto, para estudiar la malabsorción en adultos y niños, la medida en orina y suero por HPLC de azúcares (Iactulosa, manitol, lactosa, D-xilosa...) después de una sobrecarga oral de los mismos (cf. S. Travis et al.; Intestinal permeability: functional assessment and significante ; Clin. Sci. 1992, vol. 82, pp J.A. Kynaston et al., Simultaneous quantification of mannitol, 3-0-methyl glucose, and lactulose in urine by HPLC with pulsed electrochemical detection, for use in studies of intestinal permeability ; Clin. Chem. 1993, vol. 39, pp ). Pero resulta frecuentemente molesto para el paciente, y depende además de otros factores tales como el vaciado gástrico y la velocidad de recolección de la orina. En pacientes pediátricos, otros métodos más indirectos, que también resultan molestos y además dan falsos positivos, son por ejemplo los test del aliento que implican la medición del hidrógeno expirado producido por la fermentación bacteriana de los azúcares no absorbidos, o la medición del 14 CO 2 radiactivo expirado producido por el metabolismo de la 14 C-trioleína ingerida, que está relacionado con la malabsorción de lípidos 2

3 (cf. F. Fernández-Bañares et al., Procedimientos diagnósticos en gastroenterología y hepatología, in P. Humbert & M.A. Gassull (eds.), Capítulo 8, pp ; Mosby-Dioma Libros S.A.; Madrid 1995). 5 Así pues, resulta de interés clínico encontrar nuevos métodos de diagnóstico que, en un determinado paciente, indiquen el estatus de toda la masa intestinal absortiva funcionalmente activa, particularmente en relación con determinadas disfunciones intestinales. Explicación de la invención Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de diagnóstico de una disfunción intestinal en un paciente causada por un nivel anormal de masa total absortiva funcionalmente efectiva que comprende someter una muestra de suero y/o plasma de la sangre del paciente a un inmunoensayo para evaluar la cantidad de apolipoproteína apoa-iv humana. El inmunoensayo implica un anticuerpo específico contra la apoa-iv humana obtenido a partir de dicha proteína intestinal ya purificada, o a partir de apoa-iv humana recombinante, o a partir de un fragmento activo de la apoa-iv humana. La apoliproteína A-IV (apoa-iv) es una proteína de aproximadamente 45 KDa sintetizada por los enterocitos (las células más abundantes del epitelio intestinal), que se libera a la linfa unida a quilomicrones (lipoproteínas sintetizadas después de una ingesta rica en lípidos), y que desde allí se libera a la sangre, donde se presenta principalmente en forma libre. La apoa-iv se expresa en los humanos desde la semana 20 de la gestación, lo que significa que puede ser cuantificada en el nacimiento y durante edades prenatales. En la actualidad se conocen cuatro isoformas (variantes genéticamente determinadas) de la apoa-iv humana. Dependiendo de la población examinada, la frecuencia alélica de la isoforma primaria es alrededor del 94%; la abundancia de la segunda isoforma es del 6% aproximadamente. Las otras dos isoformas identificadas tienen frecuencias muy bajas. Por ápoa-iv se entiende aquí cualquiera de las isoformas o sus mezclas. El método de la presente invención usa ensayos conocidos para la detección y cuantificación de la apoa-iv humana en el suero y/o en el plasma. Los ensayos de inmunodifusión mediante electroforesis, tal y como se describen en EP B1 para otras apolipoproteínas, también pueden usarse en el método de la presente invención. No obstante, se prefieren las técnicas de ELISA (ensayos inmunosorbentes unidos a enzimas, en inglés enzyme-linked immunosorbent assays ) y los ensayos Western blot. La masa absortiva intestinal funcionalmente efectiva en el paciente se refiere a la parte de su mucosa intestinal que está formada principalmente por enterocitos (células absorbentes). Un nivel anormal de masa intestinal absortiva, funcionalmente efectiva, puede ser el resultado de una pérdida de enterocitos (p.ej. por la ingesta de etanol), o puede ser causada por la falta de madurez de dichas células (p.ej. en neonatos prematuros). Por anticuerpo específico contra apoa-iv humana se entiende cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal que interactúe únicamente con la apoa-iv intestinal humana. Este anticuerpo puede obtenerse por cualquiera de los métodos estándar, conocidos por los expertos en la materia, usando como inmunógeno o bien la apoa-iv humana purificada (en cualquiera de sus isoformas o mezclas de las mismas), o bien una apoa-iv humana recombinante, o bien un fragmento activo de la apoa-iv humana. En una realización preferida, el inmunoensayo usado en el método de la presente invención es del tipo ELISA sandwich. En una realización más preferida, el inmunoensayo ELISA sandwich implica el pretratamiento de la muestra con un tampón específico (tampón clarificante, en inglés clearing buffer ) que contiene una colesterol-esterasa pancreática para disminuir la interferencia de los lípidos circulantes de la muestra, en la cuantificación de la apoa-iv. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un Western blot (especialmente preferido con un control interno). Y en otra realización preferida, el inmunoensayo es de inmunodifusión. Entre los desórdenes de la función intestinal causados por un nivel anormal masa intestinal absortiva funcionalmente efectiva que pueden ser diagnosticados por el método de la presente invención, están la malabsorción, la enfermedad celíaca (o sea, la intolerancia al gluten de la dieta), la atrofia intestinal vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia. Entre las diferentes causas de dichos desórdenes intestinales están: la predisposición genética, la malnutrición, el ayuno, la nutrición parenteral, la cirugía intestinal, la quimioterapia, la prematuridad al nacer, la infección bacteriana intestinal, etc. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit in vitro para el diagnóstico de un desorden de la función intestinal causado por un nivel anormal de masa intestinal absortiva funcionalmente efectiva (incluyendo cualquiera de las condiciones mencionadas anteriormente) en un paciente dado. El kit tiene un anticuerpo específico contra la apoa-iv humana, obtenido a partir de una apoa-iv humana intestinal purificada, a partir de una apoa- IV humana recombinante, o a partir de un fragmento activo de la apoa-iv humana, junto con otros materiales y/o componentes para evaluar por inmunoensayo la cantidad de apoa-iv humana. En realizaciones preferidas, el kit tiene materiales y/o componentes para un inmunoensayo de tipo ELISA, o para un ensayo Western blot, o para un ensayo de inmunodifusión. Para un experto en la materia será fácil seleccionar los materiles y/o los componentes para preparar los kits in vitro apropiados para el inmunoensayo seleccionado: p. ej., una microplaca con pocillos para el ELISA, o un film cubierto con gel para el Wester blot o para el ensayo de inmudifusión. 3

4 La determinación de la cantidad de apolipoproteína A-IV humana puede ser más o menos cuantitativa dependiendo del tipo de inmunoensayo empleado y de la disponibilidad de la proteína pura apoa-iv humana como estándar, tal y como se ilustra en los ejemplos adjuntos Es de destacar que algunos factores tales como la dieta grasa, la malabsorción lipídica por causas pancreáticas, la inflamación aguda y la disfunción hormonal pueden alterar las concentraciones plasmáticas de apoa-iv en los humanos. Así, hay unas pocas patologías asociadas con el metabolismo lipídico en las que esas concentraciones plasmáticas están alteradas. En pacientes con esas patologías, el experto en la materia debe usar el método de la presente invención con cierta precaución, tomando la muestra de sangre después de un ayuno de la noche anterior, como mínimo. Aunque los niveles absolutos de apoa-iv en pacientes con esas patologías pueden diferir significativamente respecto a los valores medios de la población control, la evolución de los niveles de apoa-iv para un mismo paciente seguirá siendo significativa. Entre esas patologías se encuentran las siguientes: la enfermedad coronaria, la obesidad, la diabetes mellitus, la insuficiencia renal, la pancreatitis crónica y la malnutrición severa. Hasta ahora la apoa-iv humana ha recibido muy poca atención en el ámbito de la diagnosis y la terapia clínica, siendo una excepción la 5 sugerencia de administrar apoa-iv humana a pacientes, mediante una formulación inyectable, con el propósito de controlar el apetito y de reducir la ingesta y el peso corporal (cf. WO 94/27629 Al ). En comparación con los métodos clínicos habitualmente empleados en la técnica (endoscopia y biopsia yeyuna), la invención es ventajosa en el sentido de que proporciona un método de diagnóstico que no es invasivo para el paciente y que puede ser fácilmente industrializado con muestras de plasma y/o suero separadas del paciente. En comparación con la posible determinación de otras proteínas intestinales, otra ventaja de esta invención deriva del hecho de que la apoa-iv puede ser determinada a cualquier edad del individuo, incluyendo edades prenatales. El hecho de que la vida media de la apoa-iv humana sea baja y su concentración en plasma se correlacione significativamente con su velocidad de liberación desde el enterocito, y no con su velocidad de degradación, hace que la determinación de la apoa-iv humana sea muy indicativa del estatus funcional y morfológico de la mucosa. Una ventaja adicional, en comparación con la determinación de otras lipoproteínas, deriva del hecho de que la apoa-iv humana se libera a la sangre principalmente en forma libre (o sea, no asociada a proteínas), lo que tiene como resultado que el método de la presente invención sufre menos de interferencias de los lípidos circulantes. A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones, la palabra comprende y sus variaciones no pretenden excluir otros aditivos, componentes, elementos o fases. La descripción en el resumen se incorpora aquí como referencia. La siguiente descripción detallada y los dibujos se presentan a título de ilustración, y no se pretende que limiten a la presente invención. Breve descripción de los dibujos 40 La Fig. 1 ilustra la detección de la apoa-iv humana en plasma y en biopsia intestinal mediante el ensayo Western blot. La Fig. 2 muestra una inmunolocalización histológica de la apoa-iv en una biopsia intestinal humana de duodenoyeyuno proximal. 45 La Fig. 3 incluye dos gráficas de un ELISA sandwich para detectar apoa-iv humana en plasma. La Fig. 4 corresponde a dos ensayos de Western blot de apoa-iv purificada y plasma humano, a lo largo del desarrollo pre y postnatal La Fig. 5 muestra los niveles de apoa-iv mediante el ensayo de ELISA sandwich, en el suero de cordón umbilical de humanos recién nacidos, procedentes de madres alcohólicas y de controles, según la distribución del peso corporal. La Fig. 6 corresponde a un ensayo Western blot para detectar la apoa-iv del suero del cordón umbilical de humanos recién nacidos, procedentes de madres alcohólicas y de madres control. La Fig. 7 muestra la detección y la cuantificación por Western blot de apoa-iv en plasma, en niños celíacos en diferentes fases de su enfermedad. La Fig. 8 muestra la detección y la cuantificación por Western blot de apoa-iv en plasma, en pacientes con nutrición parenteral después de una cirugía abdominal. La Fig. 9 muestra la detección y la cuantificación por Western blot de apoa-iv en plasma, en pacientes bajo alimentación parenteral y sucesiva alimentación enteral después de cirugía gástrica. 65 Descripción detallada de realizaciones particulares El método de la presente invención se ilustra a continuación mediante el empleo de ensayos tipo ELISA sandwich y Western blot, en dos patologías pediátricas representativas de desórdenes intestinales (los efectos del alcohol en el 4

5 5 10 feto y la enfermedad celíaca) y en dos modelos de atrofia intestinal en adultos (alimentación parenteral y alimentación parenteral). En un modelo en rata, los inventores han mostrado previamente que el consumo de etanol durante la gestación por parte de la madre causa alteraciones intestinales en el feto y el recién nacido (cf. L. Camps et al., Effects of prenatal exposure to ethanol on intestinal development of rat fetuses; Journal Pediatric Gastroenterol. Nutr. 1997, vol. 24, pp , y sus referencias), y también se han publicado algunos casos clínicos en humanos (cf. S. Tourtet et al., Small intestine atresia and abnormal insertion of the umbilicus in a child with fetal alcohol syndrome; Archives de Pediatrie 1997, vol. 4, pp , y sus referencias). La enfermedad celíaca (intolerancia al gluten de la dieta) es una patología bien establecida de atrofia severa o moderada de la vellosidad intestinal, donde el diagnóstico definitivo se hace hasta ahora mediante biopsia intestinal. Se sabe bien que cualquier alimentación parenteral y un estado ayunado en general desarrollan la alteración de la mucosa, con cierta atrofia de la vellosidad intestinal. Grupos de población de los cuatro modelos Niños recién nacidos de madres que habían consumido alcohol durante la gestación fueron distinguidos de niños recién nacidos procedentes de madres control: Una mujer era catalogada como alcohólica si había tomado alcohol durante la gestación y antes del parto, y tenía la alcoholuria positiva (etanol en orina) en el momento del alumbramiento. Los niños diagnosticados como celíacos tenían en el suero los anticuerpos antiendomisio y tomaban una dieta que incluía el gluten. Los niños celíacos a los que se les realizó una biopsia yeyuna (casi el 80%) tenían atrofia intestinal en todos los casos. La edad del estudio fue entre 1-6 años. La nutrición parenteral fue realizada en pacientes adultos y ancianos (entre años de edad) sometidos a cirugía abdominal (resección del colon). Todos los pacientes fueron seleccionados en base a los siguientes criterios: que no presentaran enfermedades renales o hepáticas, ni carcinomastosis peritoneal o metástasis conocida, ni malnutrición, ni pérdida de peso, ni enfermedad metabólica o endocrina. Después de la intervención los pacientes recibieron soporte nutricional con alimentación parenteral, sin ningún tipo de ingesta oral hasta el día siete. Otros grupos de pacientes (sometidos a resección gástrica) y seleccionados con el mismo criterio estuvieron bajo nutrición parenteral (tres o cinco días después de la operación) y sucesivamente bajo nutrición enteral (con dieta líquida y blanda durante cuatro días después). Muestras clínicas Los plasmas y/o los sueros de los pacientes fueron tomados después del ayuno de la noche anterior, excepto para los neonatos. En el nacimiento las muestras de suero fueron recolectadas desde el cordón umbilical, en los Departamentos de Obstetricia y Ginecología correspondientes. Los plasmas fueron obtenidos con EDTA disódico y centrifugados y congelados a -30 C. Un pequeño fragmento de biopsia intestinal era colocada a 4 C en PBS (tampón fosfato salino, ph 7.5), y procesada lo más rápidamente posible para los estudios de Western blot y/o de inmunolocalización histológica. Las biopsias para los análisis de Western fueron procesados previamente a 4 C y a una dilución de 1/25 con PBS con Tritonx100 al 1% (v/v). Los estudios clínicos fueron realizados con consentimiento de los Comités Éticos de los diferentes Hospitales implicados: Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Sant Joan de Déu en Barcelona, y Hospital Vall d Hebron en Barcelona. Western blot para la detección de apoa-iv en plasma, suero y biopsia intestinal Los ensayos de Western blot para la detección de apoa-iv se realizaron a partir de las proteínas separadas en SDS- PAGE (dodecilsulfato sódico-electroforesis en gradiente de poliacrilamida) al 10% y transferidas sobre membranas de Inmovilon-P Millipore. Alícuotas de suero y/o plasma diluídos (1/100) fueron cargadas con tampón de muestra, resultando por pocillo 0.2 µl de suero y/o plasma. Se utilizó como anticuerpo primario IgG contra apoa-iv humana (desarrollado en el laboratorio de los inventores) y obtenido en conejo a la dilución 1/500; y como anticuerpo secundario un anti IgG de conejo comercial obtenido en cerdo (marcado con peroxidasa de rábano, HRP) a la dilución 1/15,000 (Dako, Glostrup, Dinamarca). Otras diluciones especiales de los anticuerpos están descritas en las correspondientes figuras. El bloqueo de las uniones inespecíficas se realizó con BSA (albúmina sérica bovina) al 2%, w/v. Para el revelado del Western blot se utilizó el sistema comercial ECL (luminol de quimioluminiscencia aumentada, en inglés enhanced chemiluminiscence luminol ) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont Buckinghamshire, Inglaterra) or el sustrato quimioluminiscente con detección por HRP SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, Illinois, USA). ELISA sandwich para la cuantificación de apoa-iv en suero y/o plasma 65 La concentración plasmática de apoa-iv se determinó mediante un ELISA sandwich puesto a punto en el laboratorio de los inventores. En una placa de poliestireno de 96 pocillos se inmunoabsorbían 500 ng por pocillo del anticuerpo captador (IgG contra apoa-iv humana, desarrollado en el laboratorio de los inventores) obtenido en conejo, y diluído 5

6 en 100 µl de tampón carbonato-bicarbonato (Na 2 CO g/l, NaHCO g/l, ph 9.6). Después de incubar la placa toda la noche a 4 C en una cámara húmeda, se lavaba cinco veces con PBS-T (phosphate buffer salina ph:7.4 con Tween %, v/v) a temperatura ambiente. Para bloquear la unión inespecífica, cada pocillo se incubaba con 360 µl de la solución de bloqueo que contenía albúmina sérica bovina (PBS y bovina serum albumine 0.5%, w/v) durante 1 hora a 37 C en una cámara húmeda con agitación. Posteriormente, se realizaban cinco lavados con PBS-T, y se incubaban 100 µl de las muestras, la estándar y el control interno (para los controles inter- e intra-ensayo, ver párrafos inferiores) ya diluídos en PBS-T-BSA (PBS con BSA al 0.5% y Tween-20 al 0.05%) durante 1 hora a 37 C en una cámara húmeda. Posteriormente, se realizaron cinco lavados con PSB-T. Seguidamente se incubaba la placa durante 2 horas a temperatura ambiente en la cámara húmeda con el anticuerpo detector, es decir las mismas IgG contra apoa-iv humana obtenidas en conejo, pero unidas a biotina (0.5 mg/ml, 12,4 mol biotina/mol IgG), y diluídas 1/500 en 100 µl PBS-T-BSA. Una vez completada la incubación, se realizaron 5 lavados con PSB-T. Seguidamente se incubaba la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la cámara húmeda con una solución de avidina unida a peroxidasa 0.2 mg/i y diluída en PBS-T-BSA (100 µl por pocillo). Se realizaron cinco lavados con la solución de PBS-T. Seguidamente se pipeteaban 100 µl por pocillo de la solución OPD (O-fenilendiamina 0.4 g/l, ácido cítrico 7.3 g/l, Na 2 HPO g/l, y H 2 O µl/ml) preparada en el momento de su utilización. El revelado o aparición del color del producto se realizaba a temperatura ambiente. Transcurrido un tiempo máximo de 20 minutos se paraba la reacción añadiendo 50 µl por pocillo de HCI 2.5 M. La placa se agitaba unos segundos en un agitador orbital y se leía a 492 nm con el lector de ELISA Titertek Multiskan. Pretratamiento de los plasmas o sueros En los experimentos preliminares de la puesta apunto del ELISA no se obtuvieron resultados totalmente satisfactorios: el volumen de las muestras no presentaba linealidad; y la repetitividad inter- e intraensayo no era aceptable. Fue necesario realizar un pretratamiento de las muestras con colesterol esterasa pancreática para obtener resultados más satisfactorios, evitando la posible interferencia de los lípidos plasmáticos en la cuantificación de la apoa-iv. Las muestras de plasma y el control interno (para los controles inter- e intraensayo) se diluyeron 1/10 en PBS, seguidamente se incubaron a 37 C con un tampón aclarador usado para nefelometría que contenía: ácido aspártico 87.2 g/l, colato sódico 17.5 g/l, Tween %, colesterol-esterasa 0.4 g/l, y Tris 0.1 M, ph 7.7 en la proporción (1:1) (v:v). La reacción se paraba a los diez minutos con hielo, posteriormente se añadía PBS-T-BSA, hasta completar, la dilución final de la muestra (1/150 y 1/300). El tampón aclarador se procesaba sin suero y/o plasma como blanco. La estándar se realizaba a partir de una solución de apoa-iv purificada previamente en el laboratorio de los inventores. La concentración de proteínas se determinó mediante el kit comercial BCA Protein assay reagent (Pierce, Rockford, Illinois) utilizando BSA como estándar. La estándar de apoa-iv se diluía en PST-T-BSA y se utilizó un intervalo de concentraciones de 1 a 2,000 ng por pocillo. Se verificó que no había interferencia del tampón aclarador en la estándar, y por tanto ya no se utilizó con dicho tampón. El ajuste de la curva patrón se realizó mediante análisis de regresión polinómica. Se ensayaron dos diluciones de cada muestra (1/150 y 1/300), y la concentración de apoa-iv se calcularon realizando la media de las dos diluciones. Las diluciones de la muestra y de las diferentes concentraciones de la estándar se ensayaron por duplicado. El control interno fue el de un plasma de adulto ayunado toda la noche, con una concentración de apoa-iv de mg/100 ml, y fue ensayado por cuadruplicado. El control intra- e inter-ensayo fue respectivamente 4.2% y 9.1%. Detección de apoa-iv humana en plasma v biopsia intestinal mediante ensayo Western blot La especificidad de los anticuerpos (IgG de conejo) obtenidos por los inventores, para detectar la apolipoproteína A-IV en plasma y biopsia intestinal humanos, se ilustra en los resultados de las Figs. 1, 2 y 3. La Fig. 1 ilustra los resultados obtenidos por electroforesis SDS-PAGE y Western blot. En la Fig. A fueron cargadas en los pocillos 30 µg de proteína de plasma (de origen humano y de rata). Uno de los pocillos se cargó con 20 ng de apoa-iv humana purificada. El anticuerpo primario fue diluído 1/200, y el anticuerpo secundario (contra IgG de conejo unido a HRP, peroxidasa de rábano) a 1/2000. La detección se realizó con DAB (diaminobenzidina). Se demostraba que el anticuerpo primario no marcaba la apoa-iv procedente de la rata. En la Fig. B fueron cargadas 22 ng de apoa-iv humana purificada y 5 µg de proteína de plasma humano. Cantidades diferentes de proteínas de biopsia intestinal (18 µg and 9 µg) fueron cargadas en diferentes pocillos. Los anticuerpos primario y secundario fueron procesados idénticamente a los resultados de la Fig. A. La detección se realizó con ECL. Con el ECL se mostró una mayor marca que con la detección por DAB. Los símbolos de la Fig. 1A son los siguientes. Pr: plasma de rata. Ph: plasma humano. La ApoA-IV es una proteína purificada en el laboratorio de los inventores. Los símbolos de la Fig. 1B son los siguientes: lh significa biopsia intestinal humana (procedente de duodeno-yeyuno proximal). Inmunolocalización de la apolipoproteína A-IV en una biopsia intestinal humana del duodeno-yeyuno proximal La Fig. 2 muestra la inmunolocalización de la apoa-iv en intestino humano mediante microscopía cofocal (Laica TCS 4D, Serveis Científico-Técnics, Parc Científic de Barcelona, UB). El anticuerpo primario (IgG de conejo) fue diluído a 1/40 en PBS-FCS (suero fetal de ternero al 10%, v/v); como anticuerpo secundario se usó anti IgG de conejo obtenido de cabra y unido a rojo de Texas que fue diluído a 1/200 en PBS-FCS. Las imágenes mostraban que la proteína estaba localizada a lo largo del epitelio de la mucosa intestinal (ver a 50 y 25 µm), y específicamente en los enterocitos, no mostrando ninguna marca en otros tipos celulares. La apoa-iv estaba localiza principalmente 6

7 en el área supranuclear del enterocito (ver a 10 y 5 µm). Se demostró la localización celular y la especificidad del anticuerpo de los inventores (IgG de conejo) para detectar la apoa-iv humana, la cual estaba sintetizada básicamente por el enterocito. Estos datos se complementan con los resultados previos obtenidos con el ensayo Western blot en la Fig. 1 B. ELISA sandwich para detectar la apolipoproteína A-IV en plasma humano La Fig. 3 muestra diferentes resultados del método de ELISA sandwich. La Fig. 3A ilustra la especificidad del anticuerpo de los inventores para detectar concentraciones crecientes de apoa-iv humana. La apoa-i comercial (también sintetizada por la mucosa intestinal) y la albúmina humana no fueron detectadas usando el mismo ELISA sandwich. En la Fig. 3B volúmenes crecientes de la muestra (ensayo de dilución) se correlacionaban con cantidades variadas de apoa-iv de diferentes plasmas humanos: niveles bajos para neonatos, altos para un niño de 5-6 años, y niveles adultos para un adulto de 20 años de edad. El valor obtenido de recuperación de la apoa-iv purificada en diferentes muestras fue entre 90.5 y 106.2%. En la Fig. 3A los símbolos son los siguientes: cuadrados para la apoa-iv humana, triángulos para la apoa-i humana y círculos para la albúmina humana. En la Fig. 3B los símbolos son los siguientes: triángulos para el plasma de un niño de 5-6 años, círculos para el plasma de un adulto de 20 años y rombos para un plasma de un recién nacido a término. Ensayo de Western blot para apoa-iv purificada y para detectar apoa-iv en plasma humano a lo largo del desarrollo pre- y postnatal La Fig. 4 muestra diferentes marcas de plama humano con diferentes cantidades de apoa-iv de acuerdo con la etapa de desarrollo (desde nacimiento hasta la edad adulta). El ensayo Western blot puede ser usado como método alternativo a la cuantificación por ELISA. El límite de detección del Western blot en las condiciones experimentales que se detallan es alrededor de 5-2 ng de proteína y 0.2 µl de muestra de suero y/o plasma. El índice de correlación de 59 muestras medidas paralelamente mediante ambos análisis fue de Aunque el ensayo Western blot es una técnica semicuantitativa comparada con el ELISA, su principal ventaja es falta de la interferencia de los lípidos plasmáticos. Los símbolos de la Fig 4 A son los siguientes. N: suero de cordón umbilical de neonatos (de 30 y 31 semanas de gestación); A: plasma de un adulto (de 20 años). La Fig. 4B se refiere a plasmas de diferentes momentos de la gestación en humanos (25 semanas, 36 semanas y 38 semanas); niños lactantes de diferentes periodos de lactancia (2 y 8 meses de edad) y niños de diferentes edades (1.5 y 10 años) Niveles de apoa-iv en suero de cordón umbilical de neonatos humanos de madres alcohólicas y controles en relación con la distribución de su peso corporal La Tabla 1 presenta el peso corporal y los niveles de apoa-iv, de triacilglicéridos y de colesterol, en el suero del cordón umbilical de neonatos de 36 a 42 semanas de gestación. La apoa-iv de dichas muestras fue cuantificada mediante ELISA sandwich (Fig. 3). Para la determinación de triacilglicéridos y colesterol en suero se utilizaron kits comerciales (Medical Analysis Systems and Boehringer Mannheim GmbH respectivamente). El etanol in utero redujo significativamente en el nacimiento la apoa-iv en suero de cordón umbilical, independientemente del peso corporal de neonato. Este resultado podría estar relacionado con las alteraciones morfológicas y funcionales encontradas por los inventores en el intestino de fetos experimentales (de rata) afectados por la ingesta de alcohol por parte de la madre, probablemente relacionadas con la presencia de etanol en el líquido amniótico y en el lumen intestinal del feto durante la gestación. Los datos vienen expresados como la media ± SEM de n individuos. Se aplicó el test de Mann-Whitney U. Neonatos C = neonatos de madres control. Neonatos A = neonatos de madre alcóholica. NS = no significativo. TABLA 1 Peso corporal, apoa-iv, triacilglicéridos y colesterol en suero de cordón umbilical de neonatos de 36 a 42 semanas de gestación. Neonatos C Neonatos A p-values n = 139 n = 78 Peso corporal (g) 3140 ± ± 32 NS ApoA-IV (mg/100ml) 1.66 ± ± 0.11 < triacilglicéridos (mg/100ml) ± ± 2.17 NS Colesterol (mm) 1.75 ± ± 0.05 NS La Fig. 5 presenta los datos de apoa-iv en suero (Tabla 1) en relación a la distribución de pesos de los neonatos. Los neonatos de las madres alcohólicas siempre tienen menos apoa-iv en comparación con los neonatos control (especialmente en neonatos que pesan entre 2.5 y 3.5 Kg). Los datos se expresan como la media ± SEM de n individuos. Barras oscuras = neonatos de madres control. Barras claras = neonatos de madres alcohólicas. 7

8 Ensayo de Western blot para detectar apoa-iv en suero de cordón umbilical de neonatos humanos de madres alcohólicas y madres control La Fig. 6 muestra un Western blot de apoa-iv analizado en suero de algunos recién nacidos de madres control y alcohólicas con diferentes edades gestacionales. Se observa que la intensidad de la marca es menos detectable en el suero de la descendencia del grupo alcohólico comparada con la de los sueros de los neonatos controles de la misma edad gestacional. Estos resultados se complementan con los datos de la Tabla 1 y de la Fig. 5. Suero de cordón en neonatos de 35, 36, 40 y 41 semanas de gestación. C = neonatos de madres control. A = neonatos de madres alcohólicas. Niveles de apoa-iv en plasma de niños celíacos La Tabla 2 muestra la concentración plasmática de apoa-iv, trialcilglicéridos y colesterol en niños celíacos activos (con ingesta de gluten) de edades entre 1-6 años, y controles de la misma edad. La apoa-iv de dichas muestras fueron cuantificadas mediante ELISA sandwich (Fig. 3). Para determinar los triacilglicéridos y el colesterol en plasma se usaron kits comerciales (Medical Analysis Systems and Boehringer Mannheim GmbH respectively). Los valores de triacilglicéridos fueron significativamente más altos en los niños celíacos que en los controles. Los valores de colesterol fueron significativamente más bajos en niños celíacos que en los controles. Los valores de apoa-iv en niños celíacos estaban por debajo de los controles, aunque no se encontraron diferencias significativas entre grupos. Los datos se expresan como la media ± SEM de n individuos. Se aplicó el test Mann-Whitney U. NS = no significativo. TABLA 2 ApoA-IV, triacilglicéridos y colesterol en plasma de niños celíacos activos (entre 1-6 años) y controles de la misma edad Celíacos Controles p-values n = 40 n = 173 ApoA-IV (mg/100ml) 7.87 ± ± 0.70 NS Triacilglicéridos (mg/100ml) ± ± 2.54 < 0.01 Colesterol (mm) 3.23 ± ± 0.26 < 0.01 Ensayo Western blot para detectar apoa-iv en plasma de niños celíacos en diferentes momentos de su enfermedad El ensayo de Western blot de la apoa-iv plasmática en niños celíacos en diferentes momentos de su enfermedad se presenta en la Fig. 7. En la Fig. 7A se cargaron muestras de plasma de un niño celíaco y otro control, y 80 ng de apoa- IV purificada. El niño celíaco en fase activa de su enfermedad [con marcadores positivos en suero (+): anticuerpos IgA-AGA y IgA-AEA] tenía una marca de apoa-iv menos intensa comparada con la del mismo niño alimentado con una dieta sin gluten ( ), y significativamente más baja que las marcas de los controles de su misma edad (Fig. 7B) (unidades arbitrarias de seis individuos). Los símbolos de la Fig. 7 son los siguientes: C = niño control; Ce = niño celíaco; [ + o = niños celíacos en fase activa con marcadores positivos en suero (anticuerpos IgA-AGA y IgA- AEA ); [ ] = los mismos niños celíacos pero alimentados con una dieta sin gluten (celíacos tratados). En la Fig. 7B las unidades arbitrarias se expresan como la media ± SEM para n = 6 individuos (C and Ce). Se aplicó el test de Mann- Whitney U (p < 0.01 * *, y p < 0.1 * son significativamente diferentes frente a C). Los bajos niveles de apoa-iv en plasma encontrados mediante Western blot en niños celíacos revela una alteración del metabolismo de dicha proteína, probablemente relacionada con la atrofia de la mucosa intestinal y la malnutrición en esos niños. Los niños celíacos de edades comprendidas entre 1 y 6 años presentan alterado el metabolismo lipídico caracterizado por una bajada de la concentración plasmática de colesterol y apoa-iv y un aumento de los triacilglicéridos en plasma. Estas alteraciones pueden estar directamente relacionadas con la malabsorción y la malnutrición asociadas a la enfermedad celíaca. Ensayo de Western blot para detectar apoa-iv en plasma de pacientes quirúrqicos baio nutrición parenteral El Western blot de apoa-iv plasmática en pacientes (diferente sexo y edad) nutridos parenteralmente después de cirugía abdominal (resección del colon) se presenta en la Fig. 8. Las muestras de plasma en cada paciente fueron cargadas según la Fig. 8A. Los días de estudio fueron: tres días antes de la cirugía (ayuno de noche anterior); durante la intervención (con h de ayuno); y 2, 4 y 7 días después de la cirugía (recibiendo un aporte nutricional por vía parenteral). La Fig. 8B muestra las unidades arbitrarias cuantificadas como porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno (plasma de un adulto sano ayunado de la noche anterior) que se cargaba en el mismo gel. Estos resultados mostraban claramente los sucesivos y profundos cambios significativos en la marca de la apoa-iv plasmática a lo largo de los días de alimentación parenteral a la que estaban sometidos los individuos. Los símbolos de la Fig. 8A son los siguientes: -3 = tres días antes de la cirugía; 0 = el mismo momento de la intervención; + 2, + 4, + 7 = 2, 4 y 7 días después de la cirugía. En la Fig. 8B las unidades arbitrarias fueron cuantificadas como el porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno. Los datos se expresaron como la media ± SEM de n = 8

9 21 individuos. Se aplicó el test de Wilcoxon (p < * * * significa que hay diferencias significativas respecto los valores del preoperatorio del mismo paciente, -3) Ensayo Western blot para detectar apoa-iv en plasma de pacientes quirúrgicos balo sucesiva alimentación parenteral-enteral Los resultados de la alimentación parenteral-enteral en pacientes después de cirugía abdominal (resección gástrica) se corresponden con los datos de la Fig. 9. En la Fig. 9A se presentan los resultados del ensayo Western blot de apoa-iv plasmática en sucesiva alimentación parenteral-enteral de uno de dichos pacientes. Se utilizaron los mismos criterios clínicos de selección que para los pacientes del estudio de la Fig. 8. Los días de estudio fueron: justo antes de la intervención quirúrgica (mínimo 18 horas de ayuno); justo antes del inicio de la dieta oral (con tres días como mínimo bajo alimentación parenteral); y después de cuatro días recibiendo nutrición enteral (con exclusión de dieta grasa). En la Fig. 9B se muestran la unidades arbitrarias cuantificadas como porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno (plasma de un adulto sano ayunado de la noche anterior) que se cargaba en el mismo gel. Estos resultados mostraban claramente en este grupo de individuos que hay un incremento de la marca cuando la dieta cambia de parenteral a enteral en el mismo paciente. Los símbolos de la Fig. 9A son los siguientes: 0 = justo antes de la intervención quirúrgica; = justo antes del inicio de la dieta oral y con 3-4 días bajo alimentación parenteral; y 4 = cuatro días recibiendo sólo nutrición enteral. En Fig. 9B las unidades arbitrarias fueron cuantificadas como el porcentaje respecto a la marca obtenida de un control interno. Los datos se expresan como media ± SEM de n = 6 individuos

10 REIVINDICACIONES Método de diagnóstico de un desorden de la función intestinal causado por un nivel anormal de masa absortiva funcionalmente efectiva en un paciente dado, que comprende someter muestras de suero y/o plasma de la sangre del paciente a un inmunoensayo para determinar la cantidad de apolipoproteína humana apoa-iv, donde dicho inmunoensayo conlleva un anticuerpo específico contra la apoa-iv humana obtenido a partir de una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en apoa-iv humana intestinal purificada, una apoa-iv humana recombinante, y un fragmento activo de proteína apoa-iv humana. 2. Método según la reivindicación 1, donde el inmunoensayo es del tipo ELISA sandwich. 3. Método según la reivindicación 2, donde el inmunoensayo ELISA sandwich conlleva el pretratamiento de la muestra con un tampón clarificante que contiene colesterol-esterasa pancreática. 4. Método según la reivindicación 1, donde el inmunoensayo es un ensayo Western blot. 5. Método según la reivindicación 1, donde el inmunoensayo es un ensayo de inmunodifusión Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el desorden de la función intestinal se selecciona entre el grupo que consiste en la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia. 7. Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es la malabsorción. 8. Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es la enfermedad celíaca. 9. Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es la atrofia vellositaria Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es el síndrome del intestino corto. 11. Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es la diarrea crónica. 12. Método según la reivindicación 6, donde el desorden intestinal es la flatulencia. 13. Kit in vitro para el diagnóstico de un desorden de la función intestinal causado por un nivel anormal de masa absortiva funcionalmente efectiva en un paciente dado, que comprende: (i) un anticuerpo específico contra la apoa- IV humana obtenido a partir de una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en apoa-iv humana intestinal purificada, una apoa-iv humana recombinante, y un fragmento activo de proteína apoa-iv humana; y (ii) otros materiales y/o componentes para determinar la cantidad de apolipoproteína apoa-iv humana mediante inmunoensayo. 14. Kit según la reivindicación 13, donde el inmunoensayo es del tipo ELISA sandwich. 15. Kit según la reivindicación 13, donde el inmunoensayo es un ensayo Western blot. 16. Kit según la reivindicación 13, donde el inmunoensayo es un ensayo de inmunodifusión. 17. Kit según la reivindicación 13, donde el desorden de la función intestinal se selecciona entre el grupo que consiste en la malabsorción, la enfermedad celíaca, la atrofia vellositaria, el síndrome del intestino corto, la diarrea crónica y la flatulencia

11 11

12 12 ES A1

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20 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 51 Int. Cl. 7 : G01N 33/68 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas A A P ES A1 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) WO A1 (THE PROVOST, FELLOWS AND SCHOLARS OF THE COLLEGE OF THE HOLY AND UNDIVIDED TRINITY OF QUEEN ELIZABETH DUBLIN) WO A1 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) P WO A2 (THE NOTTHINGHAM TRENT UNIVERSITY) A IVAN STANKOVIC et al. Determination of antisecalin Antibodies in sera from Coeliac Patients by Elisa-bored assay. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS. 18 (1998), páginas Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página M. Ybarra Fernández 1/1

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