LA INFECCION POR VIH Y EL LABORATORIO

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1 LA INFECCION POR VIH Y EL LABORATORIO Instituto Nacional de Salud - Peru Centro Nacional de Salud Publica Laboratorio de Referencia Nacional de ETS y VIH/SIDA Lic. T.M Ada Valverde Rojas

2 ANTECEDENTES Noviembre 1988: se inagura el laboratorio de Referencia Nacional en el Instituto Nacional de Salud-Peru : Transferencia Tecnológica de pruebas ELISA Y pruebas rapidas a 200 laboratorios en Lima y regiones del pais 1991 : Se implementa la prueba confirmatoria Western Blot 1994 : se conforma el sistema de la red de laboratorios que facilita el fortalecimiento de los laboratorios que realizan diagnostico de VIH y se implementan nuevos laboratorios en el pais 1996 : El laboratorio de VIH participa en las vigilancias centinelas en el pais. Vigilancia centinela en gestantes ( ) Vigilancia centinela en personas privadas de libertad (PPL) (1999) Vigilancia centinela de puerperas (2000) Vigilancia centinela de trabajadoras sexuales (T.S) (2002). Vigilancia centinela de clientes de las trabajadoras sexuales (2002). Prevalencia de la infeccion por VIH en pacientes con TB-BK (+) Lima y Callao(2003) Vigilancia centinela en gestantes y sus parejas (2005)

3 1988 : Implementacion de cultivo de linfocitos para la elaboracion de laminas de Inmunofluorescencia Indirecta para el diagnostico de VIH. IFI actualmente resuelve el 98 % de la confirmacion en el pais (costo-eficiencia) dolares W.Blot vs 5 dolares de IFI Descentralizacion de la prueba confirmatoria de IFI a los laboratorios del pais Implementación de prueba PCR AND cualitativo 2004 Implemetación del sistema descentralizado de monitoreo (C. viral y CD4) 2008 Implementacion de pruebas genotipas para evaluar resistencia a los ARV

4 RED NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PUBLICA Tumbes 09/02/99 Bagua 2000 Chachapoyas Cajamarca 13/11/96 Iquitos 18/12/94 Piura 17/06/94 Chiclayo 27/10/95 La Libertad Huaraz 2000 Lima Huancayo 04/09/98 Pucallpa 2000 Tarapoto 25/07/94 Cusco 16/02/97 Puerto Maldonado 2000 Abancay 26/05/99 1 LAB. DE REFERENCIA NACIONAL 24 LAB. DE REFERENCIA REGIONAL 04 Disas en Lima Huancavelica 2000 Ayacucho 23/07/94 Arequipa 06/11/96 Tacna 20/12/96 Puno 23/09/96

5 CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA VIH/SIDA/INS PERU MUESTRAS CONFIRMADAS AÑO MUESTRAS CONFIRMADAS TOTAL CONFIRMADOS *hasta Noviembre

6 CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE VIH-INS POSITIVOS

7 CULTIVO DE LINFOCITOS PARA LA PRODUCCION DE LAMINAS IFI PARA LA CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH OBJETIVO Realizar el cultivo de Linfocitos para la preparación de láminas IFI para el diagnóstico de VIH OBJETIVOS ESPECIFICOS Contar con una prueba confirmatoria para diagnostico VIH-1 de alta reproducibilidad, sensibilidad, especificidad y bajo costo frente al Western Blot. Transferencia tecnológica de IFI-VIH a los laboratorios de la Red. Preparación de Kit IFI-VIH-1 para la distribución a los laboratorios de la Red.

8 CONCLUSIONES Se cuenta con una técnica IFI-VIH 1 estandarizada con alta sensibilidad, especificidad y bajo costo. Técnica simple y de menor tiempo de ejecución que Western Blot. Técnica estandarizada para la transferencia a los laboratorios de la Red Técnica IFI descentralizada a los laboratorios de Lima Ciudad, Lima Este, laboratorios regionales de Piura, Ayacucho, Cajamarca, Loreto, Tacna,Lambayeque, Tumbes, La Libertad Costo IFI 5 dolares vs dolares de Western Blot

9 IMPLEMENTACION DE UN SISTEMA DESCENTRALIZADO DE EVALUACION Y MONITOREO DE LABORATORIO PARA PERSONAS VIVIENDO CON VIH/SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL PERIODO OBJETIVO GENERAL Implementar un sistema descentralizado para evaluación y monitoreo por laboratorio de la terapia antiretroviral que utilice técnicas validadas y desarrolladas de acuerdo a los niveles de complejidad, equipamiento de los laboratorios y recursos disponibles, que favorezca el acceso nacional de las PVVIH a la terapia y se constituya en un eje importante de integración intersectorial.

10 Fases de la implementacion Evaluar validez de la prueba en el pais Capacitacion de profesionales del INS 1 2 Seleccion de los laboratorios regionales Coordinaciones y supervision de las DISAS 3 4 Capacitacion en servicio de profesionales de las DISAS 5 6 Organizacion del sistema en cada DISA y capacitacion de los equipos locales Monitoreo del sistema en la Red y control de calidad del laboratorio 7

11 SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL: MODELO MACROREGIONAL DEL PERU Laboratorios públicos procesadores de recuento de CD4: IQUITOS 5% Areas de mayor prevalencia de VIH: Loreto (Iquitos), Lima and Callao. -Lima Ciudad -Lima Norte -Lambayeque (sede norte) -Tacna (sede sur) Instituto Nacional de Salud dirige el sistema nacional de monitoreo para la terapia ARV : procesa CD4 para las regiones no descentralizadas y el 100% de las pruebas carga viral de todo el pais. LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 20% PERUVIAN NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 35% LIMA CIUDAD 30% TACNA Macro región Norte: Tumbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin. Macro region Sur: Tacna, Arequipa, Cusco, Moquegua y Puno. Regiones que dependen directamente del INS (incluye Loreto). 3%

12 FASES DE LA DESCENTRALIZACION I FASE ( ) Se implementaron 05 laboratorios procesadores de CD4 por citometría de flujo: Lab. de Referencia Nacional INS, Macro región Norte-sede lab. Referencial de Lambayeque, conformado por Tumbes, Piura, Cajamarca, Lambayeque, La Libertad y Amazonas, Macro región Sur-sede Lab. Ref. Tacna conformado por Puno, Moquegua, Arequipa, Tacna, Lab. Referencial Lima Ciudad y Laboratorio Referencial de Lima Norte. Un laboratorio procesador de carga viral en el lab. de Referencia Nacional de INS, que utiliza las metodologías de PCR en Tiempo Real método para la determinación de Carga Viral II FASE ( ) En el año 2007 se implementaron 05 laboratorios de Referencia regional (San Martín, Madre de Dios, Loreto, Ucayali y Ayacucho) con una prueba alternativa para el recuento de CD4 por Inmunofluorescencia de citometría de flujo, para esta fase se coordino actividades con Médico Sin Fronteras-Bélgica. En el año 2008 se implemento el laboratorio Macro Regional Centro para el procesamiento de pruebas para el recuento de Linfocitos CD4 por citometría de flujo con sede en el laboratorio Referencial de Junín conformado por Junín, Pasco, Huancavelica, Huanuco, Apurimac. III FASE (2009) Se implementan los laboratorios de Loreto e Ica, y se retomo las actividades en el laboratorio referencial de Lima Ciudad IV FASE (2010) Se implementaran los laboratorios de citometria de flujo en La Libertad, San Martin y Callao

13 SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL : I, II Y III FASE DE DESCENTRALIZACION *Laboratorio Macroregional Norte : Lambayeque, La Libertad, Tumbes, Piura Cajamarca, Amazonas (7 %) Iquitos *Laboratorio de L.C (34.1%) INS Lima Norte, Lima Este, Lima Sur,Callao,ONGs,Ancash S.Martin(46.4%) Lambayeque Lima Norte 1 Ucayali Junín Madre de Dios *Laboratorio macroregional ur: Arequipa,Cusco, Puno, Moquegua, Tacna(4.24%) INS *Laboratorio macroregional Centro Junin, Pasco, Huanuco, Huancavelica (2.1 %) Ica Ayacucho Tacna *Laboratorio de Loreto ( 3.38%)e Ica (1.20%) *Lab.CD4/IFI Ayacucho (0.22% Ucayali (0.72% Madre de Dios (0.064%

14 CD4 Y CARGA VIRAL POR AÑOS PRUEBAS *2010 TOTAL C. VIRAL CD4/CD TOTAL *Noviembre 2010

15 nº muestras Frecuencia de pruebas de CD4 y Carga Viral realizados por el Laboratorio de VIH Sida por años CNSP INS, Perú C. Viral CD4 / CD Años Del año 2004 al 2005 se incrementa la demanda de pruebas en un % (etapa en la cual se inicia el acceso universal a TARGA), del 2005 al 2006 la demanda se incrementa en 7.14%, del 2006 al 2007 el incremento es de 39.70%, 2007 al 2008 se incrementa en 5 % y del 2008 al 2009 la demanda de pruebas de monitoreo se incrementa en un 13%

16 NUMERO DE MUESTRAS PARA CARGA VIRAL Y RECUENTO DE A NIVEL NACIONAL CNSP INS, PERÚ * Carga Viral Recuento CD4 / CD8 Total Departamentos General Total Total CD4-CV Amazonas Ancash Apurímac Arequipa Ayacucho Cajamarca Cusco Huancavelica Huanuco Ica Junín La Libertad Lambayeque Lima * Loreto Madre de Dios Moquegua Pasco Piura Puno San Martín Tacna Tumbes Ucayali Total *Lima representa el 78.5 % de la totalidad de pruebas realizadas, seguida de Loreto con el 3.38 % Arequipa con el 2.81 %, La Libertad con el 2.24 %, Piura 1.86% Junín 1.25% e Ica con el 1.20.%, representando la mayor demanda a nivel nacional Seguidas de Lambayeque, Ancahs, Tumbes, San Martin, Huanuco, Madre de Dios, ciudades de mediana demanda (1.19% a 0.64%) Las ciudades de Cusco, Tacna, Moquegua, Ayacucho, Cajamarca, Amazonas, Pasco, Huancavelica, Apurimac y Puno representan menor demanda de pruebas de monitoreo (0.46 A %)

17 CARGA VIRAL CD Carga viral CD4 AMAZONAS ANCASH APURIMAC AREQUIPA AYACUCHO CAJAMARCA CUSCO HUANCAVELICA HUANUCO ICA JUNIN LA LIBERTAD LAMBAYEQUE LIMA LORETO MADRE DE DIOS MOQUEGUA PASCO PIURA PUNO SAN MARTIN TACNA TUMBES UCAYALI Total

18 Número de casos nuevos por año de Carga Viral y CD4 / CD8 CNSP INS, Perú AÑO Casos Nuevos Total de pacientes nº % Total

19 Porcentaje casos nuevos de pacientes con monitoreo de CD4 y Carga Viral realizados por el Laboratorio de VIH Sida por años* CNSP INS, Perú % % 60% 40% 100.0% 92.8% 74.3% 20% 46.8% 40.3% 36.2% 35.8% 0% Casos Nuevos Total de casos

20 PVVIH ATENDIDAS CON PRUEBAS DE MONITOREO PVVIH EN TARGA : 65 % PVVIH EN PRE TARGA : 35 % SEXO FEMENINO : 33 % SEXO MASCULINO : 67 %

21 ATENCION DE RED DE MONITOREO DESCENTRALIZADA La red descentralización actualmente incluye a : 47 hospitales de MINSA 4 ONG, 2 hospitales de instituciones militares y 4 instituciones penitenciarias. A Noviembre 2010 se han realizado pruebas de monitoreo, determinaciones para recuento de CD4 y pruebas para la determinaciones de carga viral VIH

22 Porcentaje de pacientes con carga viral y CD4/CD8 SEGÚN SEXO PORCENTAJE DE PACIENTES CON CARGA VIRAL Y CD4/CD8 SEGÚN SEXO CNSP - INS, Perú % 33% Femenino Masculino

23 PCR convencional y PCR en Tiempo Real: Evolución del proceso PCR Convencional 7 horas a 2 días Extracción del ADN Amplificación Detección PCR en Tiempo Real Extracción del ADN 1 hora a 1.5 horas Amplificación y Detección

24 Evaluación de la correlación de Carga viral para VIH-1 mediante las técnicas de PCR Amplicor HIV-1 Monitor V. 1.5 y carga viral por Tiempo Real COBAS TaqMan HIV-1 en el Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA del Instituto Nacional de Salud-Perú Ada Valverde R1.,Fany Cárdenas B1.,Soledad Romero R1.,John Calderón E1.,Gabriela Salinas C1., Flor Urcia A1. 1Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA-Instituto Nacional de Salud (Perú) RESUMEN Antecedentes: Determinar el nivel de correlación de la carga viral para VIH-1 mediante las técnicas Amplicor HIV-1 Monitor Versión Estándar y carga viral Tiempo Real COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 Método: Se seleccionaron 152 muestras de plasma de personas viviendo con VIH/SIDA pertenecientes al Sistema de Monitoreo TARGA del Instituto Nacional de Salud, con C.V en el rango de 400 a 750,000 copias/ml., las muestras fueron procesadas por el Método Amplicor HIV- 1, la técnica utilizada es RT-PCR, que realiza la extracción de ARN manual, la amplificación se realizó en un termociclador modelo 9700, detección colorimétrica a longitud de onda de 450 nm., los resultados obtenidos con este método se tomaron como valores referenciales comparándolos con los resultados del Método COBAS Ampliprep/TaqMan HIV-1, tecnología automatizada, utiliza PCR en Tiempo Real. Los resultados obtenidos fueron comparados por correlación Pearson, regresión lineal para dos variables cuantitativas. Resultados: Las 152 muestras procesadas por las técnicas Amplicor y Tiempo Real muestran medias de log 4.31 y log 4.22, una media valor máximo para Amplicor de 6.03 C.V(2.67) y Tiempo Real con log. 6.7 C.V(2.22), regresión lineal R=0.89 con una confianza del 95%, coeficiente de correlación Pearson = 0.87 con valor significativo del 95% y los valores del coeficiente de correlación interclase (CCI) calificada como bueno. Conclusiones: Las dos técnicas para cuantificación de carga viral muestran un alto nivel de correlación, la determinación de la C.V por Tiempo Real permite contar con una tecnología automatizada para procesar mayor numero de muestra en menor tiempo que la plataforma manual. Palabras clave: Carga viral VIH; Tiempo Real PCR; correlación; TARGA

25 CITOMETRIA DE FLUJO

26 RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 CON MUESTRA COMERCIAL L AMB AY E QUE res idual TAC NA res idual L IMA NOR TE res idual L IMA C IUDAD res idual J UNIN res idual INS res idual Dic- 07 E ne- 08 F eb- 08 Mar- 08 Abr- 08 May- 08 J un- 08 J ul- 08 Ago- 08 S ep- 08

27 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y NORMALIZACIÓN INMULOGICA DE MEDIDAS NECESARIAS PARA VIH / SIDA ( QASI) J ul-07 S ep-07 Nov-07 E ne-08 Mar-08 May-08 J ul-08 S ep-08 Nov-08 E ne-09 C D4 C Q:26,28,30,32,34,3 6 C D4 C Q:27,29,31,33,35, J ul-07 S ep-07 Nov-07 E ne-08 Mar-08 May-08 J ul-08 S ep-08 J ul-07 S ep-07 Nov-07 E ne-08 Mar-08 May-08 J ul-08 S ep-08 Nov-08 E ne-09 Nov-08 E ne-09 C D8 C Q:26,28,30,32,34,3 6 C D8 C Q:27,29,31,33,35,3 7 C D8 C Q:26,28,30,32,34,3 6 C D8 C Q:27,29,31,33,35,3 7

28 IMPLEMENTACION PCR DNA CUALITATIVO PARA DIAGNOSTICO TEMPRANO DE NINOS CON VIH Esta prueba es de utilidad para diagnostico temprano de recien nacidos de madres seropositivas al VIH antes de los 18 meses de vida. Favorecera el acceso al TARGA de estos niños, de ser este necesario. PCR VIH T0TAL POSITIVO TOTAL POSITIVO TOTAL POSITIVO TOTAL POSITIVO TOTAL positivos PCR PRIMERA PRUEBA PCR SEGUNDA PRUEBA PCR TERCERA PRUEBA TOTAL

29 VIH PCR POSITIVO TOTAL

30 DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE RESISTENCIA A LOS ANTIRRETROVIRALES MEDIANTE GENOTIPIFICACION DE VIH

31 ESQUEMA DE TRATAMIENTO PARA LA SOLICITUD DE LA PRUEBA Pacientes adultos: Ingresaron los que presentaron fracaso al segundo esquema (CV > 1000 copias) Pacientes menores de 18 años: La solicitud se hizo al primer fracaso según los Criterios para solicitar la prueba de Genotipificación del INS. Sin embargo también se ha incluido a un grupo que presenta más de un fracaso

32 Porcentaje (%) PACIENTES ( ) (n = 34) (n = 120) (n = 26) NIÑOS ADULTOS Año

33 ANÁLISIS DE GENOTIPIFICACIÓN Resultado Genotipificación Indeterminado Rechazado Niños Adultos Total

34 MUTACIONES DE RESISTENCIA Mutaciones principales a IP ( n = 19) Mutaciones a INTR (n = 34) Mutaciones a INNTR ( n = 16) V82A 15.52% M184V 25.86% K103N 32.69% M46I 13.79% D67N 6.90% Y181C 11.54% I54V 13.79% V118I 6.03% Y188L 7.69% L90M 8.62% T215F 6.03% V90I 7.69% I50V 5.17% K219E 6.03% G190A 7.69% L76V 5.17% K70R 5.17% K103R 5.77% V82F 5.17% M41L 4.31% V179D 5.77% I84V 5.17% T69N 3.45% K101E 3.85% D30N 3.45% L74V 3.45% K101Q 3.85% I47V 3.45% T69D 2.59% G48V 3.45% T215I 2.59% I54L 3.45% T215Y 2.59% Otras mutaciones < 2% N88D 3.45% T215Y 2.59% Otras mutaciones < 2% Otras mutaciones < 2% V82A + M46I + I54V: alta resistencia a NFV.

35 Nº muestras enviadas CEMENA HAMA Hosp.Loayza Hosp. 2 de Mayo Hosp. Carrión Hosp.San Jose - Callao INSN Hosp. Unanue Hosp. Cayetano Heredia San Bartolome Hosp. Reg. Honorio Delgado - Hops. Regional de Loreto Impacta Particular San Jose - Villa el Salvador Via Libre Yarinacocha - Pucallpa Nº muestras enviadas Nº muestras enviadas ESTABLECIMIENTOS ATENDIDOS 2 0 CEMENA 2008 HAMA Hosp.Loayza Hosp. 2 de Mayo Hosp. Carrión Hosp.San Jose - Callao Establecimientos Hosp. Santa Rosa INEN INSN Serie1 Establecimientos HAMA INSN HNDAC ONG. IMPACTA ONG. VIA LIBRE Hosp. San José del C... INEN Hosp. Arzobispo L... Hosp. 2 de Mayo Serie1 Establecimientos 2010

36 PARTICIPACION DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD ACTIVIDADES 1.-Diagnostico Confirmatorio de VIH en adultos, niños a) 100% de las pruebas de diagnostico Confirmatorio (IF/LIA) de las muestras ELISA reactivas. b) 100% de las pruebas de PCR en neonatos y menores de 18 meses hijos de madres VIH positivas. c) 100% Control de calidad de laboratorios de Salud Publica a nivel nacional. d) Responsable de verificar la concordancia de los ELISAs reactivos e IFIs positivos a nivel nacional. e) Transferencia tecnológica a nivel local, regional y macroregional (técnicas de laboratorio) f) Control de calidad de kits diagnósticos que se comercializan el país 2.-1Apoyo al Diagnostico de las Infecciones transmisión sexual de las ITS/VIH en poblaciones vulnerables y en población general. a) 100% de las pruebas de Control de calidad de laboratorios de Salud Publica a nivel nacional en relación a las pruebas de ITS. b) Responsable de verificar la concordancia de los test de RPR y VDRL para sífilis a nivel nacional. c) Responsable de las pruebas de resistencia antibiótica del Gonococo en poblaciones vulnerables y sus contactos. d) Transferencia tecnológica a nivel local regional (técnicas de laboratorio) e) Asistencia técnica y capacitación a los laboratorios regionales y de hospitales. 3.-Apoyo a la reducción de la transmisión sanguínea de las ITS/VIH. a) Control de calidad de Bancos de Sangre.

37 4. Apoyo a la disminución de la transmisión vertical de las ITS/VIH. a) 100% de Control de calidad del Tamizaje para VIH y sífilis en gestantes durante el CPN y en el parto b) 100 % de las pruebas de diagnostico Confirmatorio (IFI, LIA) de las ELISA reactivas de las gestantes. c) 100% de las pruebas de Carga Viral y CD4 para las gestantes VIH positivas. 5.- Apoyo al monitoreo de la persona con infección por el VIH en TARGA Y No TARGA a) Responsable del 100% de las Pruebas de C. Viral y CD4 cada 6 meses a personas viviendo con VIH- SIDA en TARGA. c) Responsable del 100% de las pruebas de C. Viral y CD4 cada 6 meses a personas viviendo con VIH- SIDA No TARGA. e) Responsable del 100% de las pruebas de Genotificación y Resistencia a los antirretrovirales en las PVVIH en TARGA f) Responsable del sistema Descentralizado de monitoreo por laboratorio CD4 e IFI. Asistencia Técnica, capacitación y transferencia tecnológica a los laboratorios Macro- Regionales de Salud Publica, regionales en el pais. 6.Investigacion y creación de evidencias a) Responsable de la Vigilancia Basada en el Laboratorio de la Resistencia a los Antirretrovirales para el VIH. b) Responsable de la Vigilancia Basada en el Laboratorio de la Transmisión Vertical del VIH y Sífilis. c) Responsable de la Vigilancia Basada en el Laboratorio de la Resistencia antibiótica del Gonococo. d) Responsable de las Investigaciónes Sistemáticas de Generación de Evidencias que apoyen las actividades y acciones de la ESNPCITS VIH-SIDA. e) Búsqueda activa de evidencias como apoyo para la formulación de la normatividad. 7.Asistencia Tecnica a la Estrategia Sanitaria Nacional para el control de las ITS-VIH/SIDA para su fortalecimiento a) Miembro integrante del Comité Técnico de la ESN. b) Miembro del Sub-comité de Vigilancia de la Resistencia a Antirretrovirales y Genotificacion. c) Sistema de Informacion diseminada a través de la Web Net Lab, donde se colocan los resultados actuales históricos de las pruebas diagnosticas y de laboratorio, tanto para el medico tratante y el usuario.

38 GRACIAS

FORTALECIMIENTO DE CAPACIDADES DE RECURSOS HUMANOS 2006 2007-2008

FORTALECIMIENTO DE CAPACIDADES DE RECURSOS HUMANOS 2006 2007-2008 FORTALECIMIENTO DE CAPACIDADES DE RECURSOS HUMANOS 26 27-28 N DE PERSONAS QUE RECIBIERON CAPACITACION AÑOS: 26-27 - 28 9 8 7 6 8575 5 4 3 2 1 8 17 26 27 28 (ENERO - NOVIEMBRE) N DE EVENTOS DE DIFUSIÓN,

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