PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MÉTODO CONVENCIONAL

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO Detectar la presencia de Salmonella en los alimentos mediante método cualitativo recomendados por organismos internacionales 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos que de acuerdo a las normativas vigentes en el país requieran este análisis. 3. FUNDAMENTO De acuerdo con las normas internacionales y al reglamento sanitario de los alimentos la sola presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo. La técnica permite realizar compósitos de muestras y según el número de unidades que componen el compósito agregar el caldo de preenriquecimiento manteniendo la proporción 1:9 a no ser que no esté indicado. Para muestras no analizadas sobre una base de peso exacto, referirse a instrucciones para el método específico. El fundamento del método para la detección en alimentos se basa en que la presencia de Salmonella está en menor número que el de la flora acompañante especialmente en alimentos sin tratamiento previo o bien que los microorganismos se encuentran estresados por los procesos tecnológicos a que son sometidos (calor, radiación, congelación etc.) En el laboratorio los métodos convencionales para su recuperación consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de preenriquecimiento y enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realización de pruebas bioquímicas y Serotipificación.

2 PRT Página 2 de 26 La etapa de preenriquecimiento recomendada en alimentos para el aislamiento de Salmonella difiere del método empleado en muestras clínicas debido a varios factores entre los cuales estarían: a) El Nº de células es usualmente más bajo que en muestras clínicas. b) Los procesos tecnológicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria. c) La constitución propia del alimento: nutrientes, ph, aw, etc. influye en la sobrevivencia o en su multiplicación. La presencia de substancias tóxicas para las bacterias presentes en el alimento 4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre A.P.H.A. Asociación Americana de Salud Pública Formules antigeniques des serovars de Salmonella. WHO colaborating centre for reference and research on Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux Paris cedex 15, France Tablas T.L.M. Instituto de Salud Pública de Chile M.E.Valenzuela y J. Astorga. 4.4 AOAC International Official methods of analysis, 18th ed., Methods , , , , , , , , and A.O.A.C, md. International, Gaithersburg. 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Baño termoregulado a 42 y 43 ± 0,2 C Incubadora a 35ºC +/- 2ºC Vortex mixer 6.2 MATERIAL DE LABORATORIO

3 PRT Página 3 de Placas Petri de 15x100mm Pipetas estériles de 5m con 0.1vol, 1mL con 0.01 vol L Asa de nicrón (aprox. de 3mm de diámetro) Tubos estériles de 16x160 mm Mondadientes de madera o asa de vidrio Mecheros Bunsen Frascos de capacidad ± 300 ml. 6.3 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS Caldo Rappaport Vassiliadis (RV) Caldo base Tetrationato (T.T) Agar Xilosa Lisina-Desoxicolato (XLD agar) Agar Bismuto Sulfito(B.S.) Agar Hektoen (HK) Agar Triple azúcar (TSI) Lisina Iron Agar (LIA) Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) Agar citrato Simmon's Caldo Urea Caldo malonato Caldo con indicador para carbohidratos (Glucosado,Lactosado Sacarosado) Solución de verde brillante al 1% Solución de yodo yodurada Etanol 70% Novobiocina al 1% esterilizada por filtración Reactivo Kovac's Control positivo: Cepa Salmonella enteritidis ATCC Control atípico: Cepa Salmonella typhimurium H 2 S negativa Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H 2 S positiva.

4 PRT Página 4 de Cepa Control negativo: S. aureus 6.4 DISTRIBUCIÓN DEL ENVASADO DE LOS MEDIOS CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Caldo Base Tetrationato (T.T) que se prepara a partir del medio base comercial en tubos tapa rosca (10ml) al que se le agrega por tubo al momento de ser usado 0,2 ml de solución de yodo yodurado y 0,1 ml de solución de verde brillante al 1% Caldo Rappaport Vassiliadis Modificado (CRV.) Se prepara a partir del medio comercial en tubos tapa rosca (10 ml) MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS SÓLIDOS Agar Hektoen Agar Xilosa Lisina Dexocicolato (X.L.D) (1,2 ml de novobiocina al 1% x litro) Agar Bismuto Sulfito comercial y distribuido en 20 ml en placas Petri MEDIOS DIFERENCIALES SÓLIDOS Triple Sugar Agar (TSI) distribuir 4 ml en tubos tapa rosca Lisina Iron Agar (LIA) distribuir 4,5 ml en tubos tapa rosca Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) distribuir 3 a 4 ml en tubos tapa rosca Agar Citrato Simmon's distribuir 3 ml en tubos semitendido MEDIOS DIFERENCIALES LÍQUIDOS Caldo malonato de Na, distribuir 2,5 ml en tubo tapa rosca Caldos base para carbohidratos: distribuir 5 ml en tubos y agregar el carbohidrato mantenido en soluciones al 10 %: glucosa, lactosa, sacarosa, y eventualmente otros azúcares como sorbitol Caldo Urea, distribuir 1,5 a 3,0 ml en tubos tapa rosca de 13 x 10 mm SUEROS Suero Polivalente Somático para Salmonella Poly A-I (DIFCO) Suero polivalente flagelar.

5 PRT Página 5 de DESARROLLO 7.1 En el laboratorio Enterobacteriaceae se reciben las muestras homogeneizadas desde el laboratorio Recepción de muestras Anotar en cuaderno de Inscripción del laboratorio de Enterobacteriaceae la clave y número de las muestras Someter a incubación la muestra en caldo de preenriquecimiento a 35 C por horas para continuar con el proceso. * Nota: En el caso de las muestras que deben traspasarse a caldo de enriquecimiento previo a un día feriado, el caldo de preenriquecimiento incubado se guarda en refrigeración hasta por 72 horas Después de la incubación por 18 horas a 35 C sembrar el caldo de preenrequecimiento en los medios líquidos de enriquecimiento distribuidos en cantidades de 10 ml en tubos de 16x160mm con tapa rosca e identificados con el número y la clave correspondiente antes de ser inoculados Sellar la bolsa con calor. Eliminar para su incineración en bolsas rojas Inocular 1 ml en caldo Tetrationato reconstituido al momento de usarse agregando 0,2 por 10 ml de solución de yodo y 0,1 por 10 ml de verde brillante al 1% Inocular 0,1 ml en caldo Rappaport Vassiliadis (C.R.V.) 7.2 INCUBACIÓN DE LOS MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO Alimentos con una carga microbiana alta. Incubar el caldo RV 24 ± 2 horas a 42 ± 0,2 C en baño de agua con agitación. Incubar el caldo TT 24 ± 2 horas a 43 ± 0,2 C, en baño de agua con agitación Alimentos con una carga microbiana baja. Incubar el medio RV 24 ± 2 horas a 42 ± 0,2 C en baño de agua con agitación. Incubar el caldo TT 24 ± 2 horas a 35 ± 2 C. 7.3 SIEMBRA EN AGARES SELECTIVOS Con lápiz azul, marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Tetrationato y con lápiz negro marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Rappaport.

6 PRT Página 6 de Sembrar cada uno de los caldos con los cultivos en: una placa de Agar X.L.D/N (xilosa-lisina-dexocicolato/novobiocina); una placa de Agar Bismuto Sulfito (plaqueado el día antes y guardadas en oscuro a la temperatura ambiente) y una placa de Agar Hektoen Cada tubo de caldo de enriquecimiento se debe vortear y con asa de 3 mm (inóculo10 µl) extraer una asada e inocular las placas identificadas con negro y azul según caldo a sembrar Inocular el Agar Hecktoen en forma de estrías y sin flamear el asa, agotar el inóculo en el agar X.L.D./N; extraer otro inóculo con el asa y sembrar el Agar Bismuto sulfito Incubar las placas invertidas con la parte inferior hacia arriba a 35ºC ±.0,5 por 24 horas y realizar la lectura Si las placas de agar Bismuto sulfito no presentan desarrollo o este es escaso incubar por 24 horas más Ordenar según clave y número consecutivo para su lectura Anotar resultados en registro RG INTERPRETACIÓN DE LA LECTURA DE AGARES SELECTIVOS Agar Hektoen (HK.) Colonias azul-verdes a colonias azules con o sin centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras Algunos cultivos atípicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros negros.

7 PRT Página 7 de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato/novobiocina (XLD). Colonias rosadas con o sin centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras. Excepciones: serotipos S. paratyphi A y S. choleraesuis, pueden dar colonias transparentes sin centro negro; algunos cultivos atípicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros negros Agar Bismuto Sulfito (B.S) Colonias marrón, color gris, o colonias negras; a veces tienen un brillo metálico y el medio circundante es por lo general marrón al principio, pero puede virar a negro con el tiempo que la incubación aumenta, produciendo el efecto de halo supuesto. Atípicamente algunas veces se producen colonias verdes con oscurecimiento pequeño o ninguno del medio circundante. Si las colonias típicas o sospechosas no se detectan sobre el agar B.S después de 24 ± 2 horas, entonces, no escoja ninguna colonia y reincubar de nuevo por 24 ± 2 horas. Si hay colonias típicas presentes sobre el agar después de 24 ± 2 horas de incubación, entonces escoger 2 o más colonias y reincubar de nuevo el agar por 24 ± 2 horas. repicar 2 colonias o más típicas del agar B.S, solamente si las colonias escogidas incubadas por 24 ± 2 horas dan reacciones atípicas en hierro triple de azúcar agar (TSI) y agar lisina (LIA) y que ocasione que el cultivo halla sido desechado como Salmonella CONTROLES: Salmonella enterica subespecie enterica y control negativo (S aureus). En BAM on line 2007 se recomienda incorporar cepas control de Salmonella atípicas como: Salmonella diarizonae ATCC 12325, lactosa positiva y H 2 S positiva, Salmonella abortus equi ATCC 9842, lactosa negativa y H 2 S negativa, Salmonella diarizonae ATCC lactosa positiva y H 2 S negativa. La Sección de Microbiología del ISP, dispone de Salmonella typhimurium H 2 S negativa, Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H 2 S positiva, para ser usadas como control atípico. 7.5 IDENTIFICACION BIOQUÍMICA Traspasar 2 a 3 colonias por placa, con un máximo de 5 colonias a cada uno de los tres medios de cultivo: Agar TSI, semi-inclinados (fondo de unos 3 cm y superficie de 2 cm.),

8 PRT Página 8 de Agar LIA semi inclinados (fondo de 4 cm de alto debido a que la descarboxilación de la lisina es estrictamente anaerobio) y Agar MIO Marcar los tubos identificando la procedencia del caldo de aislamiento (lápiz azul caldo Tetrationato y lápiz negro caldo Rappaport) Toque ligeramente el centro de la colonia escogida con la aguja estéril de inocular e inocule el TSI rayando la inclinación y picando el fondo; sin quemar, inocule el LIA por picado del fondo dos veces y luego rayando la inclinación. Incubar los tubos con las tapas sin apretar para mantener condiciones aeróbicas en la incubación y así prevenir la producción excesiva de H 2 S. En el caso del TSI, incubar un poco inclinado para evitar la producción excesiva de gas Sembrar en picadura con asa aguja los tubos de agar Movilidad Indol Ornitina (M.I.O) cuidando no mover la aguja del asa para no romper el agar y poder leer bien la movilidad Guardar las placas de agar selectivo a 5-8 C Incubar TSI, LIA y MIO a 35 C +/- 1ºC por 24 +/- 2 horas Alternativamente se pueden utilizar kit bioquímicos comerciales aprobados por AOAC como API 20 E, Enterotubo II, Enterobacteriaceae, Micro-ID o Vitek GNI, para identificación presuntiva. Los kit comerciales no deben ser utilizados como sustituto de los test serológicos. 7.6 LECTURA. Y BASE DE LAS REACCIONES BIOQUIMICAS Salmonella típica en agar TSI produce la inclinación alcalina (roja) y el fondo ácido (amarillo), con o sin la producción de H 2 S (ennegrecimiento de agar) En LIA, produce la reacción alcalina (púrpura) en el fondo del tubo. Considere el amarillo en el fondo de tubo como la reacción ácida (negativa) No eliminar cultivos en los que se produce la decoloración en el fondo del tubo únicamente. La mayor parte de los cultivos de Salmonella producen H 2 S en LIA Algunos cultivos que no son Salmonella producen una reacción roja ladrillo en inclinaciones de LIA (Deaminación de la lisina) Todos los cultivos que dan el fondo alcalino (azul) en LIA, independientemente de la reacción de TSI, deberían ser considerados como potencial Salmonella Aislar y someter a bioquímica y pruebas de serológicas.

9 PRT Página 9 de Las cultivos que dan el fondo ácido en LIA (Amarillo) y una inclinación alcalina (azul) y el fondo ácido en TSI, también deberían ser consideradas como potencial Salmonella y debería ser subcultivada Pruebas de cultivos positivos en TSI proseguir para determinar si ellos son de la especie de Salmonella, incluyendo S. Arizonae Si los cultivos de TSI no logran dar reacciones típicas para la Salmonella (inclinación alcalina y fondo ácido) escoger colonias adicionales sospechosas de placas de medio de cultivos selectivo de supuestas-positivas e inocular TSI y LIA Aplicar pruebas de identificación bioquímicas y serológicas Examinar un mínimo de 6 cultivos de TSI por cada 25 g de la unidad analítica o cada 375 g del compuesto, provenientes de ambos caldos de enriquecimiento Si los cultivos en TSI son mixtos, se recomienda reaislar en agar XLD, Hecktoen o Mac Conkey, en este último las colonias típicas se observan, transparentes incoloras, con o sin centro negro y pueden presentar un halo de precipitación biliar causado por otros microorganismos. 7.7 INTERPRETACION DE ACUERDO A LOS CAMBIOS DE LOS TRES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS AGAR TSI La lectura empleada universalmente es la siguiente: K= Cambio debido a alcalinización (rojo) A= Cambio debido a la producción de ácido Lectura: Fermentación de la Glucosa: fondo amarillo y tendido rojo. Informar K/A Fermentación de la Lactosa y/o Sacarosa: Tendido Amarillo. informar A/A ó K Producción de Gas: Ruptura del agar. Informar la producción de gas de 1 a 3 cruces (+). Producción de H 2 S: Ennegrecimiento del medio que puede ser de intensidad variable. Informar la presencia de 1 a 3 cruces (+)

10 PRT Página 10 de 26 Ejemplo registro de informe de laboratorio: K/A +,+++ N del tubo TSI Fermentación de glucosa Fermentación Lactosa/o sacarosa Producción de H 2 S Ejemplos típicos Tubo A Pseudomonas Morganella Providencia Shigella Citrobacter Salmonella Edwarsiella Proteus Abundante gas evidenciado por ruptura de agar E.coli Enterobacter Klebsiella E. coli H 2 S + Salmonella lactosa positiva AGAR LISINA IRON AGAR (L.I.A) Interpretación de los cambios decarboxilación de la lisina: Positivo: Fondo color morado (Descarboxilación) el tubo azul. Informar K / K. Se forma amino cadaverina la cual causa que el indicador de ph púrpura de bromocresol cambie a

11 PRT Página 11 de 26 color violeta. Como la decarboxilación solamente ocurre en medio ácido (bajo ph 6) el cultivo es acidificado por la fermentación de la glucosa. Negativo: el fondo amarillo. Informar K/ A Desaminación de la lisina: positivo: el tendido rojo. Informa R/A. La deaminación de la lisina produce α-ácido ketocarboxílico compuesto que reacciona con la sal de yodo presente en el medio, bajo la influencia del oxígeno y forma compuestos café rojizo. Correspondencia por numero * Desaminación de la lisina(rojo oscuro en tendido) Decarboxilación de Lisina Fermentación de glucosa Ejemplos típicos Citrobacter Proteus Providencia Morganella E.coli. Enterobacter Salmonella Edwarsiella *H2S positivo usualmente positivas en Salmonella y Edwarsiella se muestra en el tubo 4. El LIA no es un indicador de la producción de H2S como TSI o Kligler AGAR MIO Se usa para identificación de Enterobacterias sobre la base de: MOVILIDAD, actividad de ORNITINA DESCARBOXILASA y la producción de INDOL.

12 PRT Página 12 de 26 Movilidad: se demuestra por un enturbamiento del medio o por un crecimiento en que el cultivo difunde desde la línea de inoculación. Los cultivos no móviles crecen solo a lo largo de la línea de inoculación. Ornitina: Los cultivos negativos a Ornitina se mantienen amarillos y a veces en la parte superior pueden ser púrpura. Producción de Indol a partir del triptofano se detecta con el aldehído presente en el reactivo de Kovacs, que se añade después de la lectura de Ornitina y Movilidad. Numero Correspondiente en Pares Deaminación de la ornitina (alcalino en aerobiosis) Movilidad Decarboxilación de ornitina Producción de indol Fermentación de la glucosa Ejemplos típicos Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes Escherichia coli

13 PRT Página 13 de Tabla TLM INTERPRETACIÓN DEL GÉNERO SALMONELLA BASADO EN TRES MEDIOS DE CULTIVOS: AGA TSI, LIA y MIO. (M.E. Valenzuela, J. Astorga, ISP T.S.I GAS H2S L.I.A GAS H2S Mov Indol- Ornitina. Microorganismo K/A + K/K Salmonella subespecie I Otras Salmonella K/A + - K/K Salmonella choleraesuis. Otras Salmonella K/A - - K/K + Salmonella thyphi. K/A + K/K + + Salmonella.typhi K/A + - K/A Salmonella sp. Salmonella.Paratyphi A K/A - - K/A Salmonella.Paratyphi A K/A + K/A + Salmonella.typhi (excepción) A/A, +, + K/K, Salmonella subg.3 (Arizona) K/A + + K/ K Salmonella sub-especie I y Salmonella.sub especie III (Arizona) K/A + + K/A Salmonella. sp. y Citrobacter freundíi

14 PRT Página 14 de PRUEBAS BIOQUÍMICAS COMPLEMENTARIAS En casos de duda se puede ampliar la batería con las pruebas señaladas en el Anexo N Si la combinación de los tres medios corresponde al Género Salmonella, inocular 2 tubos de agar base sangre triptosa sin sangre, tendido en estría e incubar 18 hrs. para realizar estudio serológico. 7.8 SEROLOGÍA Confirmar con suero polivalente somático y suero polivalente flagelar (Anexo Nº 5) Enviar para confirmación serológica al "Centro de Referencia de Enterobacterias del I.S.P. 7.9 INFORME DE RESULTADOS En caso de no detectar Salmonella se informa Negativo en 25 o 50 g En caso de detección de Salmonella, informar el Género y grupo somático o Serotipo y/o por el biotipo, sí la cepa autoaglutina. 8. REGISTROS Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición RG Archivador Registro Libre Papel Almacenar por 5 Registro de resultados de lectura e informe acceso años y luego análisis de Coliformes, de resultados. personal de eliminar en la E. coli y Salmonella en Laboratorio 348 Microbiolog basura picado en muestras de alimentos ía de trozos Alimentos RG Archivador registro Libre Papel Almacenar por 5 Registro control de cepas control acceso años y luego ambiente Laboratorio incubadoras personal de eliminar en la Enterobacterias laboratorio 348 Microbiolog basura picado en ía de trozos Alimentos

15 PRT Página 15 de TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación Modificada 5 1 Cambio formato actual 5 3 Se agrega d) 5 3 Se elimina la palabra REFERENCIA por estar repetida 5 3 Se actualiza referencia AOAC 5 3 Se incluye baños termoregulados a 42 y 43 ºC. 5 4 Se cambia agar base Urea por Caldo Urea 5 5 Se elimina letra y entre y Se agrega recomendación 5 5 Se elimina Se agrega Se corrige indicaciones de incubación de agares selectivos. 5 7 Se corrige Nº de registro. 5 7 Se escribe Salmonella en cursiva 5 8 Se incluye recomendación de uso de cepas atípicas. 5 8 Se cambia redacción en 7.5.1, 7.5.2, 7.5.3, y 7.5.5, quedando como 7.5.1, alterándose la numeración siguiente 5 8 Se corrige condiciones de tendido de agar TSI 5 8 Se cambia H2S por H 2 S 5 9 En se agrega recomendación 5 9 Se corrige tiempo de incubación. 5 9 Se cambia H2S por H 2 S 5 9 Se escribe Salmonella en cursiva 5 9 En , se agrega frase. 5 9 Se agrega Se cambia H2S por H 2 S 5 14 Se elimina item 9.0

16 PRT Página 16 de 26 Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación Modificada 5 14 Em se agrega Ver anexo Se cambia indicación del medio a usar Corrige tiempo de incubación en el esquema Se cambia agar por caldo Se agrega temperatura de incubación Se agrega una observación 5 17 Se agrega una opción para el test de urea Se cambia redacción 5 17 Se escribe Salmonella en cursiva 5 17, 18 y 19 Se corrige anexo 2 dando a las pruebas el orden establecido por el BAM. En el punto b) Rojo fenol, c) pruebas derivadas de caldo triptona en VP, rojo metilo y citrato se hacen algunas correcciones de contenido y de redacción y 19 Se escribe Salmonella en cursiva 5 25 Se hacen correcciones en los puntos 2, 3 y 5 de la letra a) 5 26 Se escribe Salmonella en cursiva 5 21 Se eliminan tabla 1, esta repetida la información en la tabla 1 del BAM On line 5 22 Se agrega referencia a la tabla 5 23 Se agrega referencia a la tabla 5 25 Se realiza corrección en punto 2 y cambio de redacción en puntos 3 y Se agrega una instrucción después del primer párrafo.

17 PRT Página 17 de ANEXOS Anexo Nº 1 Esquema de trabajo Anexo Nº 2 Pruebas complementarias para la identificación de Salmonella Anexo Nº 3 Tabla 1 BAM On line Diciembre 2007 reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella y Tabla 2 BAM On line Criterios parta descartar las cepas que no sean Salmonella. Anexo N 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies. Anexo N 5 Serología de Salmonella (BAM online 2007)

18 PRT Página 18 de 26 ANEXO Nº 1 Pesar y agregar caldo prenriquecimiento (25 g +225 ml (o 50g ml ) Homogeneizar ±2 minutos. Dejar reposar 60 ± 5 min. Tomar PH y ajustar. Incubar la bolsa a 35 C por horas. Inocular 1 ml 0,1 ml Caldo Tetrationato Verde brillante Incubar18-20 hrs a 42ºC± 1ºC (Marcar Las Placas Con Azul) Caldo Rappaport modificado Incubar hrs. a 42-± 1C ( Marcar Las Placas Con Negro.) Incubar 24 a 48 horas a 35 ºC. Incubar por 24 horas a 35 ºC Lectura de placas Inocular colonias sospechosas en agar T.S.I., L.I.A y M.I.O Incubar 24 h a 35ºC Lectura tubos Pruebas diferenciales Confirmación serológica Informe de resultado

19 PRT Página 19 de 26 ANEXO N 2 PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONELLA (CULTIVOS PUROS) PRUEBA DE UREASA (CONVENCIONAL). Con la aguja estéril, inocule el crecimiento de cada cultivo de la inclinación de TSI positiva en los tubos de caldo urea. Si los tubos inoculados de agar urea viran a púrpuras (la prueba es positiva); incluir tubos no inoculados de este agar como control, a veces este medio vira a púrpura sin ser inoculado. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Opcionalmente se puede realizar el test de Caldo Urea Rápido, se siembra 2 asadas de cultivo, con asa de 3 mm y se incuba 2 horas en baño de agua a 37ºC +/- 0,4 ºC. Deseche todos los cultivos que dan la prueba positiva. Conserve para el estudio posterior todos los cultivos que dan la prueba negativa (ningún cambio en color en el medio). Los cultivos puros que resulten urea negativos pueden ser sometidos a las siguientes pruebas: a) Caldo lisina descarboxilasa: Si los resultados en LIA fueron satisfactorios no necesita ser repetido, si por el contrario los resultados en LIA han sido dudosos, inocular el caldo Lisina con cultivo proveniente de TSI e incube por 48 +/- 2 horas a 35ºC, pero examinar a las 24 horas. La especie de Salmonella causa la reacción alcalina indicada por el color púrpura en todas partes del medio. La prueba negativa es indicada por el color amarillo en todas partes del medio. Si el medio no aparece decolorado (ni púrpura ni amarillo) añadir unas gotas de púrpura bromocresol 0.2 % y releer las reacciones del tubo. b) Caldo rojo fenol dulcitol al 0.5 %. Inocular el caldo con cultivo de TSI. Incubar 48 ± 2 h en 35 C, examinar después de 24 h. La mayor parte de especies de Salmonella da la prueba positiva, indicada por la formación de gas en el interior del tubo de fermentación y ph ácido (amarillo) del medio. La producción de ácido puede interpretarse como reacción positiva. El test negativo esta indicado por ninguna formación de gas en el interior del tubo de fermentación, y no hay variación en el color rojo (con el fenol rojo como indicador) o púrpura (con bromocresol púrpura como el indicador).

20 PRT Página 20 de 26 c) Caldo Triptona (o triptofano). Inocule el caldo con inoculo proveniente del agar TSI. Incube 24 ± 2 h en 35 C. Prueba de Indol: Transfiera 5 ml de cultivo a un tubo de ensayo limpio y estéril. Añada ml el reactivo de Kovacs. Los cultivos de Salmonella dan la prueba negativa (la carencia de color profundo rojo en la superficie de caldo). Registre los tonos intermedios de naranja y rosado como +/-. Caldo Malonato. Transfiera una asada de 3 mm del cultivo proveniente de caldo triptona a caldo malonato. Incluir un tubo no inoculado como control debido a que ocasionalmente los tubos no inoculados de caldo malonato viran azules (prueba positiva). Incube 48 ± 2 h en 35 C, examinar a las 24 h. La mayor parte de los cultivos de especie de Salmonella dan la prueba negativa (verde o inalterado). Caldo Cianuro de Potasio (KCN). Transfiera una asada de 3 mm del cultivo proveniente de caldo triptona a caldo KCN. Incube 48 ± 2 h en 35 C, examinar a las 24 h. Interprete el crecimiento (indicado por la turbiedad) como positivo. La mayor parte especie de Salmonella no crece en este medio, indicado por la carencia de turbiedad. Si hasta ahora no se ha realizado las pruebas serológicas, estas deben ser realizadas en este punto. (Ver anexo 5) Pruebas complementarias en caso de reacciones no típicas de Salmonella. Realice las siguientes pruebas adicionales sobre cultivos que no dan reacciones típicas de Salmonella para pruebas descritas en la Tabla 1 (ver anexo 3) y que por consiguiente no clasifica como Salmonella. a) Caldo de Lactosa Rojo Fenol o Caldo de lactosa púrpura bromo cresol: Del TSI, inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo. Incubar 48 ± 2 h en 35 C, examinar después de 24 h. Positivo - producción ácida (amarillo) y producción de gas en tubo de fermentación interior. Considerar la sola producción de ácido como reacción positiva. La mayor parte de cultivos de Salmonella dan resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formación de gas en el interior del tubo de fermentación y rojo (cuando el rojo fenol es el indicador) o púrpura (con púrpura bromocresol como indicador) en todas partes del medio. b) Caldo Rojo Fenol o púrpura bromo cresol sacarosa: Descartar como no Salmonella, los cultivos que dan pruebas de sacarosa positivas, excepto aquellos que dan ácido en la inclinación del TSI y reacciones positivas en el LIA

21 PRT Página 21 de 26 c) Caldo MR-VP. Inocular el medio con la pequeña cantidad de crecimiento de cada inclinación de TSI clasificada sospechosa de Salmonella. Incube 48 ± 2 h en 35 C. Vogues-Proskauer (VP) Realizar a temperatura ambiente de la siguiente manera: Transfiera 1 ml de 48 h de cultivo un tubo de ensayo limpio e incube el resto del caldo un tiempo adicional de 48 h en 35 C. Agregar 0,6 ml alfa-naftol y agitar bien. Agregue 0,2 ml de solución KOH al 40 % y agitar bien. Para intensificar y apresurar la reacción, agregue unos cristales de creatina. Resultados leídos después de 4 h; el desarrollo de color rosado- rojo en todas partes del medio es la prueba positiva. La mayor parte cultivos de Salmonella son VP Negativas, indicadas por la ausencia de desarrollo de color rosado-rojo en todas partes del caldo. Rojo metilo: A 5 ml de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6 gotas del indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da la prueba positiva, indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color distinto, como el amarillo es la prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan positivo: d) Agar Citrato Simmon's: Inocular este agar usando aguja de inoculación con cultivo proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la inclinación y picando el extremo. Incubar 96 ± 2 h en 35 C. Lectura: Positivo - presencia de crecimiento, por lo general acompañado por cambio en color de verde a azul. La mayor parte cultivos de Salmonella son citrato - positivas. Negativo - ningún crecimiento o muy poco crecimiento y ningún cambio en color. Descartar por no pertenecer a Salmonella, los cultivos que dan pruebas de lactosa positivas, excepto los cultivos que presentan inclinaciones ácidas TSI y reacciones positivas en LIA, o los cultivos que dan reacciones positivas al caldo malonato. Realice posteriormente más pruebas sobre estos cultivos para determinar si ellos son S. arizonae. Clasificar como Salmonella a los cultivos que tienen el modelo de reacción de la Tabla1 (ver anexo 3). Descartar, como no perteneciente a Salmonella, los cultivos que den cualquiera de los resultados presentados en la Tabla 2 (ver anexo 3). Cultivos que no han sido claramente clasificados, pueden ser sometidos a pruebas adicionales de clasificación de enterobacterias de Edwards y de Ewing.

22 PRT Página 22 de 26 ANEXO Nº 3 Tabla 1. Reacciones bioquímicas y serológicas Salmonella BAM on line Diciembre 2007 Test o substrato Resultado Salmonella Positivo Negativo especies reacción (a) 1. Glucosa (TSI) Fondo amarillo Fondo rojo + 2. Lisina decarboxilasa Fondo púrpura Fondo amarillo + (LIA) 3. H 2 S (TSI y LIA) ennegrecimiento Sin ennegrecimiento + 4. Ureasa Color rojo púrpura Sin cambio de color - 5. Caldo Lisina Color púrpura Color amarillo + decarboxilasa 6. Caldo Rojo fenol Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio + (b) dulcitol gas de color 7. KCN caldo desarrollo Sin desarrollo - 8 Caldo. Malonato Color azul Sin cambio de color - (c) 9. Indol test Color rojo en Color amarillo en - superficie superficie 10. test Polivalente aglutinación Sin aglutinación + flagelar 11 test. Polivalente aglutinación Sin aglutinación + somático 12. Caldo lactosa rojo Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio - (c) fenol gas de color 13. Caldo sacarosa rojo fenol Color amarillo y/o gas Sin gas; sin cambio de color Test Voges- Proskauer Color Rosado a rojo Sin cambio de color Rojo metilo test Color rojo difuso Color amarillo difuso Citrato Simmons Crecimiento ; Color azul No crece ; no cambia de color v a +, 90% mas positivo en 1 o 2 días; -, 90% o mas negativo en 1 o 2 días; v, variable. b Mayoría de cultivos de S. arizonae son negativos c Mayoría de cultivos de S. arizonae son positivos.

23 PRT Página 23 de 26 Table 2. Criterios para descartar las cepas que no son Salmonella BAM online Diciembre 2007 Test o substrato Resultados 1. Ureasa positivo (color púrpura ) 2. Test Indol positivo (color rojo en superficie) y Polyvalente flagelar (H) test; negativo (no aglutina) O Test Indol positivo (rojo en superficie) y Spicer-Edwards flagelar test negativo (no aglutina) 3. Lisina decarboxilasa y caldo KCN negativo (amarillo) positivo (crecimiento) (a), (b) 4. Caldo lactosa Rojo fenol positivo(amarillo y/o gas) 5. Caldo sacarosa Rojo fenol positivo(amarillo y/o gas) (b) 6. Caldo KCN test Voges-Proskauer, y test Rojo metilo positivo (crecimiento)) positivo (rosado a rojo) negativo (color amarillo difuso) Caldo de cultivo malonato positivo es necesario determinar si no es S. arizonae. b No descartar los caldos de cultivo positivos, si los cultivos correspondientes a LIA y que dan reacciones típicas de Salmonella; realizar test adicionales para determinar si hay Salmonella especies.

24 PRT Página 24 de 26 ANEXO N 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies* SALMONELLA ENTÉRICA S. BONGORI SUBESPECIE entérica salamae arizonae diarizonae houtenae indica Dulcitol d + ONPG(2h) d + Malonato Gelatinasa Sorbitol Cultivo en KCN L(+)-tartrato (a) Galaturonate Y- + (*) glutamyltrans ferasa B- d d d - glucoronidasa Mucato (70%) Salicina Lactosa (75%) + (75%) - d - Lisis por fago O d Habitat usual Animales de sangre caliente Animales de sangre fría y ambientales (a) d-tartrato (*) Typhimurium d, Dublin % o más reacciones positivas - 90% o más negativas d Diferentes reacciones dadas por distintas serovariedades *Formules antigeniques des serovars de salmonella 1997 Michel Popoff et L.LeMinor pag 12

25 PRT Página 25 de 26 ANEXO Nº 5 SEROLOGIA DE Salmonella (BAM online 2007) Antígeno Somático. (O) a) Prueba (O) polivalente somática. 1) Usar lápiz de cera, separar 2 secciones aproximadamente de 1 x 2 cm cada una sobre el interior lamina o placa Petri (15 x 100 milímetro). Hay diapositivas en el comercio que pueden ser usadas. 2) Emulsionar 3 milímetros de cultivo de h de la inclinación de TSI, o preferentemente, de agar base triptosa sangre sin sangre diluida en 2 ml de solución salina al 0.85 %. 3) Colocar 1 gota de suspensión del cultivo en la parte superior de cada sección rectangular marcada con barra de lápiz y una gota de solución salina en la parte inferior de una sección, 1 gota de antisuero Salmonella polivalente somático (O) en otra sección aislada. 4) Con mondadientes o asa limpia y estéril, mezclar la suspensión de cultivo con la solución salina en una sección y repetir para la otra sección que contiene el antisuero. 5) Mezclar en vaivén de atrás y adelante durante 1 minuto y observar contra el fondo oscuro con buena iluminación. Considerar cualquier grado de aglutinación una reacción positiva. 6) Clasificar resultados de la prueba con polivalentes somáticos: Positivo: aglutinación en mezcla de prueba; ninguna aglutinación en control de salina. Negativo: ninguna aglutinación en mezcla de prueba; ninguna aglutinación en control de salina. No específico: aglutinación en prueba y en mezclas de control. b) Pruebas de grupo somáticas (O). Ensayar usando grupos individuales de antisueros somáticos(o) con inclusión de antígeno Vi, si esta disponible, en lugar de Salmonella antisuero polivalente somático (O). Para el tratamiento especial de cultivos que dan la reacción de aglutinación positiva Vi, refiérase al seg B en los Métodos Oficiales de Análisis (FDA). Los cultivos que dan la aglutinación positiva con el antisuero individual somático (O) se registra como positivo para aquel grupo. Las cultivos que no reaccionan con el antisuero individual somático (O) se registran negativo para aquel grupo.

26 PRT Página 26 de 26 Los cultivos que contienen antígenos de Salmonella demostrables como el test flagelar (H) positivo, pero que no tienen las características bioquímicas de Salmonella deberían ser purificadas y probadas de nuevo. Antígeno flagelar polivalente (H). Inocule el crecimiento de cada TSI ureasa negativo en Caldo BHI e incubar 4-6 h en 35 C antes de que el crecimiento visible ocurra (para probar el mismo día); o en Caldo tripticasa e incubar 24 ± 2 h a 35 C. Agregar 2,5 ml de de solución salina fisiológica formalizada a cada uno de los caldos incubados. a. Seleccionar 2 cultivos de caldo formalizado y realizar prueba con antisuero Salmonella flagelar polivalente (H). Si la aglutinación se va ha realizar al día siguiente, se puede guardar el cultivo formalizado en refrigeración. b. Colocar 0.5 ml de la Salmonella diluida en forma apropiada con antisuero flagelar polivalente (H) en tubos de ensayo serológicos de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm. c. Agregar 0.5 ml del antígeno para ser probado. d. Control: Preparar con solución salina mezclando 0.5 ml solución de salina fisiológica formalinizada con 0.5 ml antígeno formalinizado. Incubar las mezclas en el baño de agua termorregulado a C. Observe en intervalos de 15 minutos y lea el final. Lectura: Positivo - aglutinación en mezcla de prueba y ninguna aglutinación en control. Negativo - ninguna aglutinación en mezcla de prueba y ninguna aglutinación en control. No específico - aglutinación en mezcla de prueba y en control. Ensayar los cultivos que dan a tales resultados con antisueros Spicer-Edwards. 1. Prueba serológica de Spicer-Edwards Use esta prueba como una alternativa a la prueba de flagelar polivalente (H). Esto también puede ser usado con cultivos que presentan la aglutinación no específica flagelar polivalente (H). Realice la prueba de Spicer Edwards de la misma forma que con antisuero flagelar (H). 2. Realice pruebas bioquímicas adicionales sobre cultivos que dan resultados de prueba de flagelar positivos. Si ambos cultivos formalinizados de caldo son negativos, realizar pruebas serológicas sobre los 4 cultivos de caldo adicionales.