Preparación de muestras: Simplificando la Extracción en Fase Sólida

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1 Preparación de muestras: Simplificando la Extracción en Fase Sólida Xavier Rodríguez Piró 2015 Waters Corporation 1

2 Cuestiones previas Es imprescindible activar el sonido en su ordenador Les recomendamos abrir la ventana del chat: Durante el webinario quizás les enviaremos algún mensaje por esta vía Si tienen preguntas las deben realizar por esta vía La presentación durará unos 45 minutos. Al final habrá tiempo para comentar alguna pregunta 2015 Waters Corporation 2

3 Agenda Introducción Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) Introducción a Simple Prep Comparativas utilizando la estrategia Simple Prep Conclusiones 2015 Waters Corporation 3

4 Retos actuales de la Industria Necesidades de los laboratorios hoy en día Retos empresariales Aumentar los beneficios Disminuir los costes Maximizar el uso de los recursos vs. Retos científicos Hacer más con menos Muestras/analitos diversos Dar resultados más rápidamente Cómo afrontar estas necesidades? 2015 Waters Corporation 4

5 Comparativa de distintas Técnicas de Preparación de Muestra Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS) Más rápida Preparación de Muestra Más limpia Menor Sensibilidad Mayor 2015 Waters Corporation 5

6 Técnicas de Preparación de Muestra: Motivos para su elección Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Solida (EFS) Opción simple Económica Rápida Reduce la complejidad de la muestra Suficiente 2015 Waters Corporation 6

7 Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS) La Precipitación de Proteínas es Simple La percepción de LLE & SLE es que son técnicas Simples La percepción de la EFS es que es una técnica Compleja 2015 Waters Corporation 7

8 Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS) La Precipitación de Proteínas es Simple La percepción de LLE & SLE es que son técnicas Simples La percepción de la EFS es que es una técnica Compleja 2015 Waters Corporation 8

9 Técnicas de Preparación de Muestra: Un nuevo enfoque Precipitación de proteínas Extracción Líquido / Líquido Extracción Líquida en soporte sólido (SLE) Extracción en Fase Sólida (EFS) La EFS es percibida como una técnica Compleja : Demasiadas etapas Múltiples sorbentes disponibles Necesidad de desarrollar el método Podemos simplificar el proceso? 2015 Waters Corporation 9

10 Historia Simplificando la EFS Desde 1996, Waters ha intentado simplificar el proceso de preparación de muestra mediante EFS con sorbentes y protocolos genéricos Oasis HLB: introducido en el mercado en 1996 como el primer sorbente de EFS polimérico y humectable Sorbente de referencia en preparación de muestra durante los últimos 18 años Técnica de preparación de muestra de elección para análisis por LC-MS por la limpieza de sus extractos y su carácter genérico. Tecnología de EFS conocida Protocolo genérico con 5 etapas 2015 Waters Corporation 10

11 Sorbentes Oasis: HLB Hydrophilic-Lipophilic Balanced Copolymer N O Monomero Hidrofílico Monomero Lipofílico Retención de Polares Retención por Fase Inversa Humectable Retención de polares Estable a todos los ph s (1-14) Sin interacciones con silanoles Area superficial específica elevada (810 m2/g) Recuperaciones elevadas para ácidos, bases y neutros 2015 Waters Corporation 11

12 Oasis HLB: Importancia de la humectabilidad 100 C18 (1cc/100mg) 100 HLB (1cc/30mg) % SPE Recovery Acetaminophen (Polar) Procainamide Ranitidine Acetaminophen (polar) Propranolol Doxepin Drying Time (minutes) Drying Time (minutes) Sorbente acondicionado con MeOH Equilibrado con agua Secado durante tiempos distintos Carga de la muestra Elución En sorbentes no humectables el secado de los poros tiene como resultado la no retención de los analitos en el paso de carga recuperaciones bajas e irreproducibles Con Oasis el secado del sorbente no impacta las recuperaciones 2015 Waters Corporation 12

13 Oasis HLB Protocolo Genérico Oasis HLB Protocolo EFS Preparar la muestra Acondicionar/Equilibrar 1 ml metanol, 1 ml agua Carga de la muestra Lavar 1 ml 5% metanol/agua Eluir 1 ml metanol Evaporar, Reconstituir Condiciones para cartuchos de 1 cc 30 mg 2015 Waters Corporation 13

14 Cómo se comportan otros sorbentes poliméricos de EFS? 2015 Waters Corporation 14

15 Recuperaciones (4 réplicas) Comparativa Oasis HLB Competitor S Competitor S-X Competitor P 2015 Waters Corporation 15

16 Historia Simplificando la EFS Introducción de los sorbentes de modo mixto: Fase inversa e intercambio iónico Simplificar los métodos de preparación de muestra complejos con protocolos genéricos 2 Protocolos para 4 sorbentes: estrategia de 2x4 Introducción de Ostro: preparación de muestras en modo passthrough 2015 Waters Corporation 16

17 Simplificando la EFS: preparación de muestra en modo pass-through Cargar la muestra Retención de Proteínas Sorbente Ostro Retención de fosfolípidos Analitos de interés Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas y los fosfolípidos 2015 Waters Corporation 17

18 Qué es Ostro? Ostro es una producto para la preparación de muestra diseñado para eliminar las proteínas y los fosfolípidos presentes en la muestra gracias a una combinación de filtración e interaccción con el sorbente Beneficios: Muestras más limpias en menos tiempo Protocolo sencillo y genérico que elimina la necesidad de desarrollo de métodos Ostro proporciona métodos consistentes, robustos y rápidos utilizando un protocolo simple y fácil de implementar Matrices y campos típicos de aplicación: Suero, plasma, sangre total, leche, tejidos y otras matrices que contengan proteínas y lípidos Toxicología, Clínica, Bioanálisis, Alimentación, Medio Ambiente etc Waters Corporation 18

19 Ostro: Campos de aplicación y pretratamiento según matrices Clínica / Toxicología sangre total Bioanálisis / Clínica Plasma/Suero Alimentación Leche/Tejido Sangre total: lísis con Sulfato de Zinc No necesario Extracción con acetonitrilo 2015 Waters Corporation 19

20 Ostro: Cómo funciona? Clinica / Toxicología sangre total/plasma Bioanálisis Plasma/Suero Alimentación Leche/Tejido Sangre total: lísis con Sulfato de Zinc No necesario Cargar la muestra Añadir solvente Mezclar Analitos pasan Colectar & Inyectar Extracción con acetonitrilo Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas, los fosfolípidos y el material particulado 2015 Waters Corporation 20

21 Ostro en Toxicología: Análisis de opiáceos en sangre total Los laboratorios de toxicología-forense requieren a menudo analizar drogas en sangre total Muchas estrategias de preparación de muesta se han usado para el análisis de sangre total Ostro representa una alternativa simple que permite realizar todo el proceso en los pocillos de la placa 2015 Waters Corporation 21

22 Ostro en Toxicología: Protocolo de preparación de muestra Añadir 150 μl de solución 0.1 M ZnSO4 /0.1 M NH4CH3COOH Añadir 50 µl of sangre total Mezclar (para lisar las células) Añadir 600 µl de ACN Vortex Pass through (vacío o presión positiva) Evaporar (N 2 ) Reconstituir con 50 µl de 0.1% ácido fórmico en 2% acetonitrilo Analizar 2015 Waters Corporation 22

23 Ostro en Toxicología: Recuperaciones de opiáceos en sangre total Recuperaciones medias en sangre total (n=4) Ostro proporciona recuperaciones reproducibles 2015 Waters Corporation 24

24 Ostro en Alimentación: análisis de drogas veterinarias en leche Removal of phospholipids from whole milk using Ostro 2015 Waters Corporation 26

25 Agenda Introducción Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) Introducción a Simple Prep Comparativas utilizando la estrategia Simple Prep Conclusiones 2015 Waters Corporation 27

26 Introducción a SIMPLE PREP Convierta la preparación de muestra en algo rápido y sencillo! Sigamos con algo más de información básica 2015 Waters Corporation 28

27 Formatos de Oasis: Cartuchos Placa convencional Placa µelution Carga típica: 0, ml de muestra Volumen de elución mínimo: alrededor de 0,5 ml Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar Carga típica: µl de muestra no diluida Volumen de elución mínimo: alrededor de 200 µl Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar Carga típica: μl de muestra no diluida (= µl de muestra diluida) Volumen de elución mínimo: 25 μl Evaporación y reconstitución no necesarias para concentrar 2015 Waters Corporation 30

28 Placa Oasis µelution Diseñada para la limpieza y la concentración en fluidos biológicos Contiene 2 mg/pocillo de sorbente Oasis para la extraccíón de una amplia gama de compuestos ácidos, básicos y neutros Ideal para aquellos usuarios con volumenes de muestra reducidos (< 200 µl) Permite la elución con <50 µl, pudiendo concentrar hasta 15 veces los analitos sin evaporación ni reconstitución Compatible con la mayoría de sistemas robóticos de manejo de líquidos de alto rendimiento, tanto por vacío como por presión positiva Uniendo el diseño específico de la placa con las excelentes propiedades del sorbente Oasis HLB podemos llevar la EFS a un nuevo nivel de simplicidad, no posible en la inmensa mayoría de otros sorbentes/formatos: Protocolo con 3 únicos pasos: Carga-Lavado-Elución Sin necesidad de Acondicionar y Equilibrar ni de Evaporar y Reconstituir Diseño Patentado Compatible con el diseño estándard ANSI 2015 Waters Corporation 31

29 Protocolo EFS estándard con µelution Acondicionar 200 µl Metanol (MeOH) Equilibrar Carga 200 µl H 2 O 200 µl plasma diluido y dopado (100 µl plasma + 100µL 4% H 3 PO 4 ) 100 µl Plasma 5 µg/ml Lavado Elución 200 µl 5% MeOH en H 2 O 25 µl*2 MeOH Eluato 10 µg/ml A menudo para la elución en µelution se utiliza la mezcla ACN:MeOH (6:4) 2015 Waters Corporation 32

30 Protocolo EFS estándard con µelution Acondicionar Equilibrar Carga 200 µl Metanol (MeOH) 200 µl H 2 O 200 µl plasma diluido y dopado (100 µl plasma + 100µL 4% H 3 PO 4 ) Eliminacion de estos pasos Lavado 200 µl 5% MeOH en H 2 O Elución 25 µl*2 MeOH 2015 Waters Corporation 34

31 Comparativa de protocolos Oasis µelution: Estándard vs. Simplificado Estándard Simplificado 200 µl Metanol (MeOH) Acondicionar 200 µl H 2 O 200 µl plasma diluido y dopado (100 µl plasma + 100µL 4% H 3 PO 4 ) Equilibrar Carga 200 µl plasma diluido y dopado (100 µl plasma + 100µL 4% H 3 PO 4 ) 200 µl 5% MeOH en H 2 O Lavado 200 µl 5% MeOH en H 2 O 25 µl*2 MeOH Elución 25 µl*2 MeOH Inyección directa del eluato Evaluación de recuperaciones, variabilidad, efecto matriz y limpieza del extracto 2015 Waters Corporation 35

32 Agenda Introducción Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) Introducción a Simple Prep Comparativas utilizando la estrategia Simple Prep Conclusiones 2015 Waters Corporation 36

33 Evaluación del Protocolo Simplificado Comparar los protocolos estándard y simplificado Recuperaciones, Efecto Matriz y limpieza del extracto Validación del protocolo simplificado Reproducibilidad lote a lote (años ) Capacidad de carga de plasma Comparitivas: Otras matrices: orina Otros formatos: placas de 10mg y cartuchos de 30mg Otros sorbentes: Oasis HLB vs. sorbentes C18 de base sílice y poliméricos Resumen 2015 Waters Corporation 37

34 Condiciones LC de las pruebas Instrumento ACQUITY UPLC I class - Xevo TQ-S Columna UPLC Temperatura Columna 40 C Temperatura Muestra 10 C Tiempo de cromatograma (Caudal) Fase Móvil A: Fase Móvil B: Solventes de limpieza (Strong y Weak) Seal wash Detección Condiciones MS 1.7 µm CSH C18, 2.1 x 100mm 7 minutes (0.5 ml/min) Agua con 0.1% ácido fórmico ACN con 0.1% ácido fórmico 70/30 ACN/agua con 2% ácido fórmico 10% MeOH MS: Xevo TQ-S ESI+ MRM CSH: Charged Surface Hybrid UPLC : Ultra Performance Liquid chromatography 2015 Waters Corporation 38

35 Analitos Name pk a Log P Comments 1B Azidothymidine (AZT) Antiretroviral drug for HIV/AIDS 2B 7-Hydroxycoumarin Gradient in sunscreen, absorb UV 3A Phenacetin Pain, fever reducer 4N Betamethasone Anti-inflammatory and immunosuppressive 5B Protriptyline Antidepressant 6A Alprazolam Panic and anxiety disorders 7B Amitriptyline Antidepressant 8A Naproxen Pain, fever reducer 9B Propranolol Hypertension Drogas para distintas campos de aplicación Amplio rango de pk a s y Log Ps (indicación de la hidrofobicidad) 2015 Waters Corporation 39

36 Recuperaciones con muestras plasmáticas: protocolo estándard vs. Simplificado Protocolo estándard Recuperaciones Protocolo simplificado AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox AVG Protocolo de 5 pasos vs. protocolo de 3 pasos: Recuperaciones y desviaciones estándard comparables Recuperaciones medias >90% y RSDs <5% Respuesta de muestra extraída Recuperaci ón = 100 ( ) Respuesta de muestra post - dopada 2015 Waters Corporation 40

37 Factor de matriz (MF): Protocolo estándard vs. simplificado 1.40 Protocolo estándard Matrix factor Protocolo simplificado Procain N acety AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox 0.60 Factores de Matriz equivalentes con ambos protocolos (MF de 1.00±0.15 obtenidos con el protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) ) Factor de Matriz: 1.0 = no hay efecto matriz >1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression * Bioanalytical Method Validation Guide de la European Medicines Agency, 2012 en matriz MF * = Respuesta Respuesta en blanco 2015 Waters Corporation 41

38 Limpieza del extracto: Comparativa Referencia: MeOH Extractos con el protocolo simplificado ESI+ MS scan Extractos con el protocolo estándard No se observan diferencias en el test de limpieza por MS entre el protocolo de 5 pasos y el de 3 pasos (Carga-Lavado-Elución) Cromatogramas LC/MS obtenidos usando un Xevo TQ-S 2015 Waters Corporation 42

39 Protocolo Simplificado: Capacidad de carga de muestra Diferentes volumenes de plasma cargados 25µL 50µL 100µL 250µL 375µL La capacidad de carga se mantiene constante en los distintos volumenes La capacidad de carga evaluada fue entre 25 y 375 µl de plasma Recuperacciones entre % con RSDs inferiores al 5% para todos los analitos 2015 Waters Corporation 43

40 Protocolo Simplificado: Reproducibilidad lote a lote Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 4 Recuperaciones muy consistentes entre todos los lotes Cuatro lotes diferentes de Oasis HLB seleccionados entre Recuperaciones medias entre todos los lotes: 90±6% 2015 Waters Corporation 44

41 Veamos ahora cómo se comportan las muestras de orina 2015 Waters Corporation 45

42 Protocolo Simplificado vs. Estándard: Evaluación de fármacos en orina Recuperaciones Protocolo estándard Protocolo simplificado Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox Matrix factor Protocol estándard Protocolo simplificado Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox Matrix factors of 1±0.2 is considered comparable Muestras de orina diluidas 1:1 con 100 mm acetato sódico ph 5.0 Recuperaciones y Factores Matriz comparables 2015 Waters Corporation 46

43 Podemos aplicar esto a otros sorbentes? Y a otros formatos (cartuchos o placas convencionales)? 2015 Waters Corporation 47

44 Protocolo Simplificado: Comparativas Comparativas realizadas: Placas µelution, placas de 10mg y cartuchos Oasis HLB vs. sorbente C18 de base sílice Oasis HLB vs. otros sorbentes poliméricos En las distintas comparativas nos centramos en 2 parámetros Recuperaciones Efecto matriz 2015 Waters Corporation 48

45 Protocolo Simplificado: Cartuchos Oasis HLB 1cc/30 mg Comparable (high) recoveries and (low) matrix effects with plasma when comparing 5-step protocol versus simplified 3- step (Load-Wash-Elute) protocol Recuperaciones (elevadas) y efectos matriz (bajos) comparables entre el protocolo de 5 etapas y el de 3 (Carga-Lavado-Elución) 2015 Waters Corporation 49

46 Protocolo Simplificado vs. Estándard: Cartuchos Oasis HLB 1 cc/30 mg Recuperaciones comparables entre los dos protocolos trabajando con cartuchos HLB y orina como matriz 2015 Waters Corporation 50

47 Oasis HLB µelution vs. C 18 de base sílice µelution; Protocolo Simplificado Plasma Orina Oasis HLB Silica-based C 18 Oasis HLB Silica-based C Únicamente HLB da buenos resultados trabajando con el protocolo simplificado de 3 etapas, tanto para plasma como para orina Con el sorbente C 18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas 2015 Waters Corporation 51

48 Oasis HLB vs Sorbentes poliméricos similares; plasma - 4 réplicas 120 Oasis AVG Recovery: 100% Oasis AVG RSD: 1% 100 AZT Hydroxycoumarin Phenacetin 60 Betamethasone Protriptyline 40 Alprazolam Methoxyverapamil 20 Terfenadine 0 Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP 2015 Waters Corporation 54

49 Comparativa de Efectos Matriz Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP AZT 7 - Hydroxycoumarin Phenacetin Betamethasone Protriptyline Alprazolam Methoxyverapamil Terfenadine 0.60 MF = Response in matrix Response in blank Con Oasis HLB se obtienen los efectos matriz más bajos (mejores resultados) Factor Matriz: 1.0 = efecto matriz inexistente >1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression 2015 Waters Corporation 55

50 Conclusiones de las comparativas con otros sorbentes El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) únicamente funciona con Oasis HLB (un sorbente 100% humectable) Con un sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas Con sorbentes poliméricos similares se obtienen recuperaciones inferiores Waters Corporation 56

51 Próximos pasos: Protocolos simplificados para modos mixtos 2015 Waters Corporation 57

52 Protocolo Simplificado para Oasis MCX: Screening toxicológico en orina 2015 Waters Corporation 58

53 Screening Toxicológico en orina Resultados Sistema LC: Acquity I-Class Columna: BEH Ph 2,1x100mm 1,7µm Detector: Xevo TQD 2015 Waters Corporation 59

54 Agenda Introducción Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) Introducción a Simple Prep Comparativas utilizando la estrategia Simple Prep Conclusiones 2015 Waters Corporation 60

55 Conclusiones El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) para Oasis HLB permite: Mejorar el flujo de trabajo reduciendo los pasos del método de extracción en fase sólida de 5 a 3 Reducir alrededor de un 40% el tiempo de procesado, así como ahorrar una media del 70% en solventes Obtener recuperaciones elevadas, baja variabilidad y efectos matriz bajos Compatible con muestras plasmáticas y de orina El protocolo funciona tanto para placas como para cartuchos Oasis Los resultados de aplicar el protocolo simplificado a otros sorbentes (C18 base sílice y poliméricos) son claramente peores Trabajando con la placa µelution se puede cargar entre 25 y 375 µl de muestra y concentrar los analitos hasta 15x 2015 Waters Corporation 61

56 Gracias A continuación de este webinario: Recepción o Presentación en PDF o Application Notes relacionadas EN EN EN EN o Oferta del 30% en los productos Oasis, Ostro y Sep-Pak Para cualquier pregunta: o Soporte Técnico Waters: o spain@waters.com o Su Responsable de Ventas local 2015 Waters Corporation 62

57 Agradecimientos Frank Marszalkowski Doug McCabe Chris Poz Mary Lame Pamela Iraneta Xin Zhang Euan Ross Erin Chambers Kenneth Fountain Gregory Lawless 2015 Waters Corporation 63

58 2015 Waters Corporation 64

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