Bandejas de tipificación HLA Modo de empleo Para uso diagnóstico in vitro

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1 1 Introducción: Bandejas de tipificación HLA Modo de empleo Para uso diagnóstico in vitro Las bandejas de tipificación HLA Invitrogen son fabricadas para la identificación y definición de antígenos de histocompatibilidad y se emplean en la tipificación del HLA. El análisis de microlinfocitotoxicidad emplea linfocitos como objetivo. Las células viables son extraídas con facilidad de sangre periférica, nódulos linfáticos, bazo, etc. Este análisis serológico mide la muerte celular a través de la activación de complemento (conejo) en presencia de combinaciones específicas de antígeno-anticuerpo. La reacción anticuerpo-antígeno-complemento se mide mediante la visualización de la prueba a través del microscopio a un aumento 150 x con iluminación de contraste de fase y una coloración vital como eosina Y o yoduro de propidio. Las células muertas (que poseen el antígeno detectado por el antisuero específico) absorberán la tinción y mostrarán un cambio de color correspondiente. Las células negativas (aquéllas en las que no se encuentra el antígeno detectado por el antisuero específico) permanecen viables y excluyen la tintura. Las bandejas de tipificación HLA Invitrogen están concebidas para usarse en el análisis de microlinfocitotoxicidad para la definición de antígenos de HLA. Se incluyen antisueros operacionalmente mono y multiespecíficos para los antígenos de HLA. En el envase de la bandeja se incluyen los controles positivo y negativo. PRECAUCIÓN: MANIPÚLELO COMO SI PUEDIESE TRANSMITIR UNA ENFERMEDAD INFECCIOSA El plasma y/o suero del que deriva este producto ha sido evaluado y comprobado como negativo en pruebas de HBsAg, VIH-1 y VHC por un método de análisis aprobado por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.). Sin embargo, ningún método de prueba ofrece la garantía completa de la ausencia de VIH, virus de la hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por tanto se las debe manipular como muestras de sangre humana con el potencial de causar infecciones. 2 Componentes del kit: 2.1 Bandejas de 72 pocillos con 1 μl/pocillo de antisuero con azida sódica al 0,1% como conservante y rojo fenol como indicador de ph, superpuesto con 4 a 5 μl de aceite mineral. Guarde a -55 C o menos en un FRIGORÍFICO SIN ESCARCHA 2.2 Complemento de conejo, 3 ml vial(s). Guarde a -55 C o menos en un FRIGORÍFICO SIN ESCARCHA 2.3 Hoja de trabajo/certificado de análisis 3 Materiales, reactivos y equipo no suministrado: 3.1 Centrifugadora con tapa 3.2 Microscopio óptico 3.3 Microscopio invertido de contraste de fase o microscopio invertido fluorescente 3.4 Pipetas Pasteur de 15,2 y 22,9 cm 3.5 Jeringuillas de microvaloración 50 μl, 100 μl, 250 μl 3.6 Tubos de ensayo 12 x 75 mm y 17 x 100 mm 3.7 Hemacitómetro 3.8 Cubre de vidrio para portaobjetos de 5,1 cm x 7,6 cm 3.9 Resina magnética, Invitrogen Dynabeads Preparado celular HLA I (código de producto USA, 21002D-Todos otros) y Invitrogen Dynabeads Preparado celular HLA II (código de producto USA, Todos otros) 3.10 Dextrano al 5% 3.11 Solución de Ficoll-Hypaque 3.12 Medio RPMI-1640 con tampón HEPES y Pen/Strep añadido 3.13 Solución salina de Hanks equilibrada (HBSS) 3.14 Azul de triptano 3.15 Solución de eosina Y o CFDA 3.16 Formalina neutralizada al 12-37% ph 7,0±0,2 o yoduro de propidio en solución para detener la reacción Suero humano combinado (PHS), Invitrogen código de producto Requisitos de la muestra: 4.1 La suspensión de linfocitos se prepara a partir de 10 ml de sangre entera recolectada en un tubo heparinizado, ACD o vacutainer de citrato sódico. La concentración celular se ajusta a 2-3 x 10 6 células/ml. Para una óptima viabilidad, la suspensión de linfocitos debe prepararse dentro de las 48 horas siguientes a la recolección de la sangre entera. La suspensión se guarda a temperatura ambiente hasta su utilización.

2 4.2 Una viabilidad mayor al 80% sin contaminación excesiva de células no linfocíticas es esencial para el rendimiento óptimo del suero de tipificación de leucocitos. 4.3 La contaminación con granulocitos o un fondo elevado de linfocitos no viables puede provocar una reacción falsamente positiva. 4.4 La contaminación con plaquetas puede resultar en la lisis incompleta de los linfocitos que provoque una reacción falsamente negativa. 4.5 Los linfocitos pueden ser preparados de acuerdo con el siguiente procedimiento o por métodos adicionales que se enumeran en el Manual de procedimientos de laboratorio ASHI. 5 Preparación de la suspensión de linfocitos: 5.1 Recolecte 10 ml de sangre entera en un tubo heparinizado, ACD o vacutainer de citrato sódico. (Se comprobó que EDTA es un anticoagulante inaceptable.) Guarde la muestra a temperatura ambiente hasta su utilización. 5.2 Centrifugue la sangre durante 10 minutos a x g para obtener una capa de leucocitos Esto también puede hacerse mediante la utilización de un agente agregante como dextrano al 5% de la siguiente manera: Mezcle 2 ml de dextrano al 5% con 10 ml de sangre entera y deje que los eritrocitos sedimenten a 37 C durante 15 minutos. 5.3 Mediante una pipeta Pasteur, retire con mucho cuidado la capa de leucocitos (aproximadamente 2 ml) y transfiérala a un tubo limpio de 17 x 100 mm con 5 ml de HBSS. Mezcle bien. 5.4 Introduzca 4 ml de solución gradiente Ficoll-Hypaque (FH) (22 C) en un tubo limpio de 17 x 100 mm. Con mucho cuidado, coloque la capa amortiguadora de leucocitos en suspensión sobre la solución gradiente FH. 5.5 Centrifugue durante 20 minutos a 700 x g. Una vez realizada la centrifugación, pueden encontrarse células mononucleares como una banda estrecha en la interfaz entre el plasma/diluyente y la solución gradiente. 5.6 Aspire toda la capa de células mononucleares y transfiérala a un tubo de 17 x 100 mm. Diluya con 4 ml de HBSS. 5.7 Centrifugue durante 10 minutos a 600 x g. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el conglomerado celular suavemente, añada 4 ml de HBSS y centrifugue durante 10 minutos a 600 x g. 5.8 Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el conglomerado celular en 1 ml de RPMI-1640 con PHS al 20%. 5.9 Examine la suspensión celular en un hemacitómetro. Evalúe la pureza y realice un recuento celular. Ajuste la concentración celular a 2-3 x 10 6 células/ml Realice una prueba de viabilidad de la siguiente manera: Agregue una gota de azul de tripano y una gota de la suspensión celular en un tubo limpio, y mezcle bien Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos Examine la viabilidad de las células en un hemacitómetro. Células viables tienen una membrana celular intacta y tienen una apariencia lisa; ellas son capaces de excluir el azúl de triptófano y por lo tanto serán incoloras. Las células no viables no tienen intacta la membrana celular y por ende no aparecen lisas.; ellas son incapaces de excluir el azúl de triptófano y por lo tanto se verán con color Las suspensiones linfocíticas están listas para ser utilisadas en las pruebas de Microlinfocitotoxicidad Clase I utilizando el método de exclusion de tinción. 6 Separación células B y T: 6.1 Procedimiento de la lana de nylon: Los linfocitos B y T se separan con facilidad mediante la técnica de la lana de nylon. Las células B y los macrófagos tienen la propiedad de adherirse a la lana de nylon, mientras que las células T no lo hacen. Consulte la 4 a Edición del Manual de laboratorio ASHI; Sección 1.A.6 Separación de los linfocitos T y B mediante lana de nylon para el procedimiento de separación de las células B y T. 6.2 Procedimiento de resina magnética: Se dispone de resina magnética de distintos fabricantes La Prep. celular HLA I y la Prep. celular HLA II (Invitrogen han sido evaluadas para usarse con todas las bandejas de las clases I y II. Consulte las instrucciones de uso de los fabricantes Las resinas de células B y células T purificadas suelen ser coloreadas previamente con CFDA (diacetato de carboxifluoresceína) o bromuro de etidio. 7 Prueba de microlinfocitotoxicidad: 7.1 Prepare una suspensión de linfocitos de por lo menos 80% de viabilidad sin contaminación excesiva de células no linfocíticas. 7.2 Retire las bandejas de tipificación HLA Invitrogen del frigorífico, descongele y permita que las bandejas alcancen la temperatura ambiente para la prueba inmediata. Vuelva a colocar las bandejas congeladas a -55 C o menos en un frigorífico sin escarcha.

3 7.2.1 Las bandejas de envases abiertos deben ser usadas de inmediato o guardadas hasta durante un mes a o por debajo de -55 C. 7.3 Mediante una jeringuilla de 50 µl, añada 1 µl de linfocitos en suspensión (aproximadamente linfocitos) a la parte superior de cada pocillo de prueba, teniendo precaución de no tocar el antisuero. Examine cada pocillo para garantizar que la suspensión de linfocitos y el antisuero se hayan mezclado. 7.4 Incube las bandejas a temperatura ambiente (22 C ± 3 C). Clase I (exclusión de colorante) Clase I (fluorescencia) Clase II (fluorescencia) 30 min 30 min 45 min 7.5 Con un jeringuilla de 250 µl, añada 5 µl de complemento de conejo que se suministra con el envase de las bandejas en los pocillos de prueba, teniendo precaución de no tocar la mezcla antisuero/linfocito con la punta de la jeringuilla. Nota: Las bandejas de tipificación han sido optimizadas con el lote de complemento suministrado con el equipo. El uso de complemento distinto puede producir reacciones débiles o falsos positivos. 7.6 Incube las bandejas a temperatura ambiente (22 C ± 3 C). Clase I (exclusión de colorante) Clase I (fluorescencia) Clase II (fluorescencia) 60 min 50 min 60 min 7.7 Con una jeringuilla de 100 µl o equivalente, añada 2 µl de eosina Y acuosa al 5% filtrada a cada pocillo de prueba e incube a temperatura ambiente (22 C ± 3 C) de 3 a 5 minutos. Tenga precaución de no tocar la mezcla de antisuero y linfocitos con la punta de la jeringuilla. Omita este paso si está utilizando un análisis basado en fluoresceína. 7.8 Con una jeringuilla de 250 µl, añada 5 µl de formalina neutralizada filtrada a cada pocillo de prueba, teniendo precaución de no tocar la mezcla antisuero/linfocito. Omita este paso en los análisis basados en fluoresceína Análisis basados en fluoresceína: Añada 5 µl de yoduro de propidio en solución para detener la reacción a cada pocillo de prueba, teniendo precaución de no tocar la mezcla antisuero/linfocito. 7.9 Coloque un cubre de vidrio sobre la bandeja y deje que las placas se mantengan a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que los linfocitos se asienten Las bandejas coloreadas con eosina Y pueden leerse después de una hora o al día siguiente Las bandejas coloreadas con fluoresceína pueden leerse después de 30 minutos o al día siguiente. Nota: La lectura de una bandeja coloreada con fluoresceína después de 36 horas puede producir una mayor cantidad de falsos positivos Observe la prueba microscópicamente a una amplificación de 150 x bajo iluminación de contraste de fase. 8 Resultados: 8.1 Las células muertas (aquéllas que poseen el antígeno) absorben el colorante, aparecen agrandadas y oscurecidas, y muestran un detalle nuclear típico. Las células viables (aquéllas en las que falta el antígeno), excluyen el colorante, aparecen levemente más claras y más pequeñas de tamaño en comparación con las células muertas. 8.2 Por otro lado, las células viables marcadas de manera fluorescente, son verdes y las no viables, rojas. 8.3 Tras la corrección por el porcentaje de células muertas en los pocillos de control negativo, la prueba se clasifica de la siguiente manera: % células Puntuación Interpretación muertas Negativo Negativo dudoso Positivo débil Positivo Positivo fuerte -- 0 Ilegible 9 Patrones de rendimiento: 9.1 Especificidad y sensibilidad Las bandejas de tipificación HLA Invitrogen han sido extensamente probadas por evaluación interna y externa contra un panel de linfocitos bien calificado con varios grupos étnicos. Las diluciones y especificidad de cada suero de tipificación HLA Invitrogen en el envase de la bandeja fueron determinadas por valoración (mediante diluciones seriadas) contra linfocitos en suspensión con tipos conocidos de HLA. Cada suero se emplea a su dilución óptima a fin de lograr el valor de reacción más elevado, manteniendo la especificidad. La mayoría de los sueros tienen valores R de 0,8 o más. La información contenida en el Certificado de análisis, suministrado en cada lote de bandejas, le ayudará a explicar las reacciones inesperadas.

4 9.1.2 Cada bandeja contiene suero de control positivo HLA Invitrogen (suero de linfocitos antihumanos de conejo) Cada bandeja contiene suero humano combinado Invitrogen (PHS) a emplear como suero para control negativo. Este suero ha sido evaluado y se comprobó que es negativo para anticuerpos contra células T y B linfocitotóxicos, de acuerdo con el patrón de análisis microlinfocitotóxico. 10 Resolución de problemas: 10.1 Un fondo elevado o los falsos positivos pueden deberse a: La muestra tiene baja viabilidad celular o células dañadas. Retire las células muertas antes de añadir a las bandejas o preparar otra suspensión celular La muestra está contaminada con granulocitos u otras células no linfocíticas. Retire las células no linfocíticas antes de añadir a las bandejas o preparar otra suspensión celular Los reactivos con sustancias tóxicas o que tienen un ph que se encuentra fuera del intervalo fisiológico normal pueden provocar daño celular. Asegúrese de que los reactivos usados hayan sido correctamente probados El complemento es demasiado fuerte o tiene un nivel de toxicidad elevado. Utilice el lote de complemento suminstrado con el equipo El tiempo de incubación es demasiado largo. Asegúrese de seguir estas instrucciones de uso exactamente con respecto al tiempo de incubación, en función de las técnicas de aislamiento celular Restos celulares o séricos pueden provocar una reacción incompleta o falsos positivos Las reacciones débiles o falsos negativos pueden ser atribuidos a: La muestra está demasiado concentrada. Asegúrese de que la concentración celular se ajuste a 2-3 x 10 6 células/ml La muestra está contaminada con plaquetas El suero o los reactivos tienen cambiado el ph debido a la exposición a CO 2 o a la contaminación bacteriana. Utilice reactivos frescos y controle el ph antes de usar El complemento es demasiado débil o se ha inactivado antes de ser añadido a las bandejas. Utilice el lote de complemento suminstrado con el equipo La temperatura de incubación no es la correcta. Las bajas temperaturas causan una reacción más lenta, mientras que las altas temperaturas causan la degradación de los componentes termolábiles. Asegúrese de que la temperatura de incubación sea 22 C ± 3 C El tiempo de incubación es demasiado corto. Asegúrese de seguir estas instrucciones de Modo de empleo exactamente con respecto al tiempo de incubación, en función de las técnicas de aislamiento celular. 11 Limitaciones y precauciones: 11.1 El complemento de conejo es un reactivo crítico en el procedimiento de prueba de linfocitotoxicidad y puede variar de lote en lote. Un complemento insatisfactorio producirá reacciones débiles o falsos positivos, o fondo elevado en el control negativo. Se puede determinar la actividad del complemento de conejo probándolo con los controles positivos y negativos adecuados así como con linfocitos y antisueros conocidos Invitrogen Corporation recomienda el uso del complemento suminstrado con el equipo El HLA-ABC y complemento DR Invitrogen han sido probados individualmente para cumplir las valoraciones mínimas y la toxicidad de fondo (consulte el catálogo y/o el prospecto del envase del complemento). Sin embargo, se aconseja que las muestras de cada lote de complemento nuevo sean probadas en paralelo con un lote existente o conocido. Un complemento de conejo adecuado debe mostrar una lectura de concentración de 8 con el control positivo y la mayoría de las reacciones positivas. Debe mostrar una lectura de concentración de 1 con el control negativo y la mayoría de los pocillos negativos La exposición a CO 2 debe evitarse por posibles cambios en el ph que pueden ser contrarios al complemento Se conoce la existencia de reactividad cruzada en el sistema HLA y puede producir algunas reacciones falsas negativas. Algunos de los antisueros en el envase de la bandeja para tipificación HLA muestran una amplia especificidad (supertípica) Estos antisueros se definen en la hoja de trabajo La prueba de HLA con las bandejas para tipificación de HLA Invitrogen debe ser realizada en presencia de un director, supervisor técnico y/o supervisor general cualificado de acuerdo con las normas de laboratorio aceptadas. Debemos recalcar que estos productos son exclusivamente para uso profesional Las muestras deben ser guardadas a temperatura ambiente hasta su utilización y no debe emplearse EDTA como anticoagulante para la recolección de las muestras Todos los resultados de tipificación deberían confirmarse utilizando otro método de tipificación. PR006 Revisión 05 Impreso en 8/08

5 European Representative: Invitrogen Ltd. 11 Bassendale Road Croft Business Park Bromborough, Wirral CH62 3QL, U.K. Tel: Invitrogen Corporation 9099 North Deerbrook Trail Brown Deer, Wisconsin USA Tel: (800) Fax: (800) Productos Auto-Declarados (CE aprovado) HLA C Locus Bandejas de Tipificación