Caspasas (cysteine-dependent asparagine/aspartate-specific proteases)

Transcripción

1 Caspasas (cysteine-dependent asparagine/aspartate-specific proteases) 2013

2 Caspase-like proteolytic activity Material usado por Paula AcVEID-AMC Caspasa 6 AcYVAD-AMC, Caspasa 1 AcLEHD-AMC substrates Caspasa 9

3 Caspasas Las caspasas son un grupo de proteínas perteneciente al grupo de las cisteín-proteasas, caracterizadas por presentar un residuo de cisteína que media la ruptura de otras proteínas. En el caso de las caspasas el corte se produce en el nivel de un residuo de aspartato de lo que deriva su nombre (cisteinil-aspartato proteasas). Las caspasas son mediadores esenciales de los procesos de apoptosis, la muerte celular programada, de especial relevancia en los procesos morfogenéticos del desarrollo embrionario.

4 Caspasas Las caspasas contienen tres dominios: (1) un prodominio N-terminal, (2) una subunidad grande (p20) que contiene el centro activo con cisteína dentro de un motivo conservado QACXG (Gln-Ala-Cys-X-Gly (3) una subunidad pequeña (p10) en el C-terminal. Las caspasas son unas de las proteasas más específicas con un requerimiento inusual y absoluto de cortar después de un residuo de ácido aspártico (Asp). El prodominio y la subunidad grande están separados por un lugar de corte con Asp, y la subunidad grande está separada de la pequeña por uno o dos motivos de este tipo. La presencia de Asp en los motivos de corte para la maduración es consistente con la capacidad de las caspasas de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de amplificación. Are metacaspases caspases? Vercammen D., et al. (2007) JCB (Minireview):

5 (A) Dominios de caspasas (C), metacaspasas (MC), y paracaspasas (PC). Los dominios catalíticos consisten de una subunidad grande p20 (roja) y una subunidad pequeña p10 (verde). Las posiciones de los residuos catalíticos de His y Cys están indicados por barras amarillas. Los prodominios de iniciadores inflamatorio y proapoptótico de caspasa y metacaspasa tipo I están en gris. El dominio N-terminal de las parascaspasas contienen un dominio de muerte (negro) y uno o dos dominios Ig (celeste). La region C-terminal de paracaspasas, involucrada en ubiquitinación, es mostrada en rosa. (B) Diagrama topológico de la estructura de la caspasa8 humana y la metacaspasa de Arabidopsis thaliana. Los residuos catalíticos His y Cys están labelados en rosa, residuos (putative) que forman paquetes S1, en celeste y sitios de maduración en verde

6 En Plantas No han sido encontrado homólogos de caspasas Sí se han encontrado tres cysteino-proteasas (con la díada cystidina, histidina) con especificidad a Arg, Lys (No Asp)

7 Trío de proteasas que son indispensables para la MC, con diferente especificidad de sustrato y diferente localizacion subcelular (hay otras) VPEs (divide el sustrato YVAD: Tyr-Val-Ala-Asp) (Caspasa 1) VEIDasa (divide el sustrato Val-Glu-Ile-Asp) (Caspasa 6) Metacaspasa tipo II (conservan el residuo catalítico caspasa-específico, pero no dividen péptidos después de un aspartato, sino que tienen preferencia por residuos arginina o lisina en posiciones específicas en el sustrato

8 Bozhkov P, Jansson C Autophagy and Cell-Death Proteases in Plants. Two Wheels of a Funeral Cart. Autophagy 3:2,

9 Bozhkov P, Jansson C Autophagy and Cell-Death Proteases in Plants. Two Wheels of a Funeral Cart. Autophagy 3:2, Trío de proteasas que son indispensables para la MC, con diferente especificidad de sustrato y diferente localizacion subcelular VPEs (sustrato YVAD: Tyr-Val-Ala- Asp) Metacaspasa tipo II (conservan el residuo catalítico caspasa-específico, pero no dividen péptidos después de un aspartato, sino que tienen preferencia por residuos arginina o lisina en posiciones específicas en el sustrato VEIDasa (sustrato Val-Glu-Ile-Asp)

10 (A) Modelo de distribución subcelular de un trío de proteasas de MC (formas activas). (1) La VEIDasa se localiza en citosol y autofagosomas, y es activada por la metacaspasa tipo-ii (flecha). Los autofagosomas son derivados del Golgi, proplástidos o retículo endoplásmico (ER) y son los sellos distintivos de la fase responsable de la PCD. (2) La VPE produce el crecimiento de las vacuolas líticas (3) La metacaspasa produce el desarmado del núcleo y es necesaria en la fase de ejecución.

11 Se induce condensación de cromatina y fragmentación del DNA en células humanas por factores que inducen MCP en plantas Factores vs. Mecanismos comunes A. Células humanas HCT116, tratadas con extractos nucleates OJO solo de los núcleos de células de la nucela del óvulo de trigo, que sufren MCP. A la derecha, control. Tinción: ioduro de propidium B. C, control untreated cells; +N, ejemplar tratado con extracto de trigo en presencia o en ausencia del inhibidor de CAD (ICAD), Zn 2+ or EDTA. CAD (ca); EDTA: agente quelante Caspase-activated DNase)

12 Enzimas nucleasas Zn 2+ - y Ca 2+ /Mg 2+ -dependientes Las nucleasas son usualmente clasificadas de acuerdo a los cofactores (metal-ion) y al ph óptimo requerido para su activación De acuerdo a esto, las nucleasas pertenecen a las clases Zn 2+- o Ca 2+ -dependientes. Entre las Ca 2+ -dependientes, algunas pueden también ser activadas por Mg 2+, Mn 2+, o Co 2+

13 En células animales, CAD (caspase-activated DNase) es la primera nucleasa responsable para la degradación del DNA CAD es mantenida inactiva por un inhibidor, formando un complejo El clivaje del inhibidor libera la CAD activa Experimento: En células vegetales No se han identificado genes que codifiquen caspasas putativas ni sus inhibidores en estas células vegetales. Factores de MCP extraídos de núcleos de cells sufriendo MCP no resultaron inhibidos por inhibidores de la célula humana Endonucleasas dependientes de Zn 2+, EDTA, Ca 2+ y/o Mg 2+ ], inhibieron la inducción de apoptosis en la célula humana Esto sugiere que: Nucleasas de tipo CAD no están presentes en estas células vegetales Tampoco la bioinformática basada en similaridad de secuencias ha dado resultados positivos.

14 Distribución filogenética de caspasas, metacaspasas, paracaspasas, y proteínas bacteriales similares a para/metacaspasa. C, caspasa; MC, metacaspasa; PC, paracaspasa; protopc/mc, bacterial para-/metacaspasa-like proteins. Clasificación de la vida celular en un procariote y y cinco reinos eukariotes (Fungi, Protozoa, Chromista, Animalia, and Plantae) y uno procariote (Bacteria, including Archaebacteria) como descripto en Cavalier Smith (2004). Eventos HGT están Vercammen D et al. J Cell Biol 2007;179: indicados en líneas de puntos 2007 Rockefeller University Press

15 Las plantas codifican sólo homólogos distantes de las caspasas, las metacaspasas, que pueden estar implicadas en la MCP, pero no poseen actividad proteolítica específica de caspasa. Dos tipos de metacaspasas se pueden distinguir: las Tipo I tienen prodominios con motivos repetitivos ricos en prolina, y las, que carecen de prodominios pero presentan una inserción de alrededor de 200 aminoácidos en el extremo C- terminal. En protozoos y hongos sólo se encuentran metacaspasas tipo I, mientras que en los genomas de las plantas se codifican ambos tipos. El rol que cumplen no está del todo determinado y existe una creciente evidencia de su participación en el control de la MCP en diversos sistemas. En un principio las primeras observaciones utilizando extractos celulares sugirieron que las metacaspasas podrían corresponder a las actividades proteolíticas tipo caspasa detectados en plantas, levaduras, y hongos. Sin embargo, una batería de estudios bioquímicos utilizando metacaspasas recombinantes o extractos de proteínas con mutantes de pérdida o ganancia de función han demostrado claramente que las metacaspasas son altamente específicas para Arg o Lys en la posición P1

16 Sanmartín M, Jaroszewski L, [...], Rojo E. Plant Physiol. Caspases. Regulating Death Since the Origin of Life 1 SERIN-PROTEASA SER CON ESPECIFICIDAD AL ASPARTATO: SASPASAS

17 Serin-PROTEASA CON ESPECIFICIDAD AL ASPARTATO Del extracto del hongo necrotrófico Cochliobolus victoriae se obtiene la toxina victorina que activa una respuesta de MCP en cultivos susceptibles de centeno y que lleva a la progresión de la enfermedad La MCP inducida por victorina se asocia con dos enzimas tipo caspasa. Se detectan por sensibilidad a los inhibidores de caspasas. Una de ellas es translocada al apoplasto en respuesta al tratamiento con victorina: correlaciona con inducción de MCP por este estímulo, Esta enzima fue purificada y la secuencia parcial de la proteína mostró que era homóloga a las Ser-proteasas de tipo subtilisina denominadas saspasas (serin-aspartato-proteasas y no cisteinil-aspartato-proteasas). La caracterización bioquímica de la saspasa purificada mostró que su sustrato específico es estricto para Asp en la posición P1 y por lo tanto es diferente de todas las Ser proteasas conocidas, En la actualidad, el gen que codifica la saspasa no está clonado.

18 Se ha identificado y caracterizado una nueva proteasa tiposubtilisin de tabaco y arroz llamada phytaspasa la cual posee especificidad caspasa distinta de la de otras proteasas tipocaspasa conocidas. Por ejemplo, VEID (sustrato de caspasa-6) es un motivo preferido para la escisión por parte de la phytaspasa que lo diferencia de las saspasas, las cuales no se unen al sustrato VEID en absoluto Otra particularidad notable de la phytaspasa es su localización específica ya que en respuesta a una variedad de estímulos que inducen la muerte, phytaspasa se relocaliza desde el apoplasto hacia el interior de la célula. Las otras proteasas que poseen actividad tipo caspasa conocidas, operan ya sea en el apoplasto (saspasas) o en la vacuola (VPE), la phytaspasa puede funcionar tanto en apoplasto como en los compartimentos intracelulares.

19 Proteasa: VPEs (like Caspasa1); Sustrato YVAD: Tyr-Val-Ala-Asp) Hatsugaiikio N A Plant Vacuolar Protease, VPE, Mediates Virus-Induced Hypersensitive Cell Death. Science 305: HR fue inhibida por un inhibidor de caspasa 1 y por un inhibidor VPE. Plantas de Nicotiana que tienen el ge de resistencia N al tobacco mosaic virus (TMV) forman lesiones que muestran muerte por HR en las hojas infectadas despues del cambio de temperatura (ver met.)

20 Sustrato YVAD (Tyr-Val-Ala-Asp) (en vacuolas líticas) Proteasa: VPE/Caspasa1 Inhibidor: Inhibidor de VPE o de Caspasa 1 VPE (vacuolar) exhibe una actividad caspasa-1 involucrada en la HR ( A) TMV-indujo HR en hojas de tabaco. HR fue inhibida por un inhibidor de caspasa 1 y por un inhibidor VPE. La hoja fue infectada con los inhibidores de proteasas 1h antes del cambio de temperatura y analizada 24 h después ( B) Arriba: A TMV infectada con o sin biotin-xvad-fmk. Abajo: Un blot del inhibidor biotinylado. Control (lane 2). El asterisco, señales no específicas ( C) Un blot del inhibidor biotinilado de la hoja infectada preincubada con cada inhibidor de proteasas antes de la incubación con biotin-yvad-fmk (lanes 1 to 7) y un inmunoblot del extracto de la hoja con anticuerpo a VPE (lane 8). ( D) Un blot de inhibidor biotinlado del extracto de la hoja después de la inmuno depleción con anticuerpos a VPE (lane 1) o con suero preinmune (lane 2).Un asterisco indica señal no específica ( E) Efectos de varios inhibidores sobre la actividad VPE en hojas infectadas con TMV 3 h después de l cambio de temperaturaafter the temperature shift. DMSO, dimethylsulfoxide; Ac-YVAD-CHO, a caspase-1 inhibitor; Ac-ESEN-CHO, a VPE inhibitor; Ac- DEVDCHO, a caspase-3 inhibitor; Pepstatin A, an aspartic protease inhibitor; PMSF, a serine protease inhibitor; E-64, un inhibidor papain-type-protease inhibitor.

21 AcYVAD-AMC, Caspasa 1 (vacuolar) Inhibidores sintéticos específicos de caspasas anulan HR inducida por bacteria en hojas de tabaco

22 ..pero no afectan la activación de los mecanismos de defensa

23 La actividad de clivaje del Ac-YVAD-AMC (amino methyl coumarina) puede ser detectada en extractos preparados de plantas de tabaco que sufren muerte celular HR

24 Trío de proteasas que son indispensables para la MC, con diferente especificidad de sustrato y diferente localizacion subcelular VPEs (sustrato YVAD: Tyr-Val-Ala- Asp) Metacaspasa tipo II (conservan el residuo catalítico caspasa-específico, pero no dividen péptidos después de un aspartato, sino que tienen preferencia por residuos arginina o lisina en posiciones específicas en el sustrato VEIDasa (divide el sustrato Val-Glu-Ile- Asp)

25 Sustrato: Val-Glu-Ile-Asp Caspasa 6. VEIDasa 6AcVEID-AMC Caspasa 6

26 Actividad VEIDasa durante el desarrollo del cariopse de cebada

27 Localización in vitro e inhibición de actividad VEIDasa en el endosperma VEIDase activity can be visualized in vivo with the substrate VEIDN, included in the CyToxiLux- PLUS kit DAPI y el kit CyToxiLux Plus Núcleos y Autofagosomas

28 Autofagosomas A-C: In vitro D-F: In vivo C y F: combinación de las dos figuras previas Debido a su naturaleza acídica y a la composición lipídica de la membrana, los autofagosomas que contienen proteasas pueden ser específicamente teñidos con monodansylcadaverina

29 TUNEL en secciones de cariopse de cebada A-B: En nucela (13 dps) C-D: endosperma amiláceo proximo a la capa de aleurona (19 dps)

30 MCP durante el desarrollo del cariopse

31 Lombardi L Programmed cell death of the nucellus during Sechium edule Sw. seed development is associated with activation of caspase-like proteases. Journal of Experimental Botany 58:

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33 Cambios de morfología nuclear y fragmentación de DNA in nucela que degenera N, nucela; IN, tegumento

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35 A. Análisis de la actividad proteasa (usando azocaseína como sustrato) extraído desde las regiones nucelares proximal, subproximal y distal B y C. Efecto de los inhibidores para diferentes clases de proteasas, usando azocaseína como sustrato) desde extractos de nucela medido para los picos de actividad a ph 5 y ph 7

36 Actividad proteolítica en las regiones proximal, sub-proximal, and distal de la nucela hacia el sustrato para la caspasa A. Para la caspasa c- YVAD-pNA B. Para la caspasa 3 Ac- DEVD-pNA C. Para la caspasa 6 Ac- VEID-pNA D. medida en diferentes ph. E. Efectos de los inhibidores para las diferentes clases de proteasas de los inhibidores específicos para la caspasa animal caspase-1 F. caspase-3 G. caspase-6. Relativo a la actividad maxima de los tres sustratos (ph 4).

37 Xu Q, Zhang L Plant caspase-like proteases in plant programmed cell death. Plant Signaling & Behavior Fluorescence resonance energy transfer (FRET) es una técnica que permite monitorear la compartimentalización y los blancos subcelulares como visualizar las interacciones proteína-proteína y la actividad proteasa en células vivas FRET es un proceso mecánico cuántico por el cual la energía de excitación es transferida desde un fluorocromo donante a un fluorocromo aceptor. FRET ocurrirá cuando: (1) el espectro de absorción del cromóforo aceptor se superponga con el espectro de emisión de fluorescencia del donante, y (2) la proximidad de los dos cromóforos sea menor que 10 nm. Una sonda FRET para monitorear la activación de la caspase-3-like proteasas en células de plantas vivas en RT construida en el lab de Xing permitió detectar primero, la activación de la caspase-3-like prtease. Primero la caspasa fue detecta in vivo por transfectar el protoplasto de Arabidopsis con la construcción recombinante sustrato caspasa. Este plasmido recombinante esta compuesto de la proteína fluorescente enhanced cyan fluorescent protein) (ECFP) como el donante y enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) como el aceptor, ligados por un p ptido que contiene la secuencia DEVD, la cual ha sido definida como una secuencia óptima para la casspasa animal 3. Cuidadosa optimización de la eficiencia de la transfección, claramente demuestra que la caspase-3-like activity en células vivas de plantas, pudo ser detectada en RT durante el proceso de plantas inducidas por UV, con el análisis FRET. Este método permitió también estudiar la activación de la capase-3-like protease y los eventos claves de la MCP en tejidos específicos usando promotores específicos de esos tejidos y de esas células y plantas transgénicas. (Zhang LR, Xu QX, Xing D, Gao CJ, Xiong HW. Real-time detection of caspase-3-like proteases activation in vivo using fluorescence resonance energy transfer during plant programmed cell death induced by ultraviolet-c overexposure.plant Physiol. 2009;150: )

38 Zhang et al Real-Time Detection of Caspase-3-Like Protease Activation in Vivo Using Fluorescence Resonance Energy Transfer during Plant Programmed Cell Death Induced by Ultraviolet C Overexposure1[C] Lingrui. Plant Physiol. 150: , Algunas imágenes:

39 Ver bibliografía en las diapositivas.