IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2 DE Staphylococcus aureus.

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1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Unidad de Biociencias IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2 DE Staphylococcus aureus. Memoria del Trabajo experimental correspondiente al Máster en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina Presentada por Yanara A. Astudillo Silva Septiembre de 2012

2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Unidad de Biociencias IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa2 DE Staphylococcus aureus. Memoria del Trabajo experimental correspondiente al Máster en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina Presentada por Yanara A. Astudillo Silva Realizada bajo la dirección del Dr. Salvador Ventura y de la Dra. Susanna Navarro Yanara A. Astudillo S. Dr. Salvador Ventura Dra. Susanna Navarro Bellaterra, Septiembre de 2012

3 INDICE 1. RESUMEN INTRODUCCIÓN PLEGAMIENTO PROTEICO AGREGADOS PROTEICOS Fibras Amiloides PROTEÍNAS PRION Sup Staphylococcal secretory antigen (Ssa2) DOMINIOS CHAP MODELAJE DE LA ESTRUCTURA PROTEÍCA SWISS-MODEL OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS MÉTODOS BIOINFORMÁTICOS Modelaje de la estructura proteica Análisis de propensidad de agregación... 8 a) PASTA... 8 b) WALTZ MÉTODOS DE DNA RECOMBINANTE Clonación Transformación de células competentes de E. coli Codon Plus EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa Medios de cultivo y antibióticos Condiciones del cultivo Crecimiento de cultivos e Inducción de expresión proteica Purificación de la proteína SsaA2 mediante cromatografía de afinidad Preparación de las muestras para los geles de Acrilamida-Bis- Acrilamida Determinación de la concentración proteica MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS Electroforesis en Geles de Agarosa Electroforesis SDS- PAGE i

4 4.4.3 Tinción y Destinción de los Geles DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA MÉTODOS BIOFÍSICOS Tinción específica de fibras amiloides Unión de Tioflavina T Unión de Congo Red Unión de Bis-ANS Dicroísmo Circular Determinación de Fluorescencia Intrínseca Microscopia electrónica de transmisión (TEM) para la visualización de fibras amiloides Ensayo de Citotoxicidad Celular RESULTADOS Y DISCUSIÓN CLONACIÓN DE Ssa2 en el VECTOR pet 28-B ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS SIMILARES Y MODELAJE DE LA ESTRUCTURA PROTEICA DE Ssa ANÁLISIS DE LA PROPENSIÓN DE AGREGACIÓN EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE FIBRAS AMILOIDES TINCIÓN ESPECÍFICA DE FIBRAS AMILOIDES Unión Tioflavina T y Congo Red Unión a bis-ans ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE Ssa Dicroísmo Circular (CD) Determinación de la Fluorescencia Intrínseca TEM ENSAYO DE TOXICIDAD CELULAR CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA ii

5 ABREVIATURAS Bis-ANS: Ácido 4,4 -dianilino-1, 1 - binphthyl-5,5 disulfónico CR: Congo Red Da: Daltons DC: Dicroismo Circular DO: Densidad Óptica EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético GPI: Glicosil Fosfatidilinositol IPTG: isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido LB: Luria Broth PDB: Protein Data Bank PSA: Persulfato de Amonio SDS PAGE: Sodio Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis Ssa2: Stahphylococcal secretory antigen TEM: Microscopía/ Microscopio Electrónico de Transmisión TEMED: Tetramethylethylenedimine Th-T: Tioflavina-T

6 1. RESUMEN Las proteínas después de ser sintetizadas en los ribosomas adquieren una conformación específica de la cual depende su función biológica. La incapacidad de las proteínas para asumir dicha conformación puede deberse a mutaciones o factores ambientales que dificultan a la proteína llevar a cabo su función biológica normal y que pueden resultar en la formación de agregados produciendo enfermedades en animales y humanos. Las proteínas tipo prion son capaces de formar agregados, por lo que consideradas proteínas patógenas por ser transmisibles y causar ciertas enfermedades. Sin embargo existen proteínas de tipo prion que desempeñan una función biológica. Actualmente se conocen proteínas prion en humanos, animales y levaduras. Con el fin de caracterizar proteínas de tipo prion en otros organismos en este trabajo se estudió la proteína Ssa2 de Staphylococcus aureus. Ssa2 se seleccionó mediante un algoritmo computacional basado en la homología de secuencias. La proteína fue comparada secuencialmente con la proteína priónica Sup35 de levaduras, encontrando cierta homología como una estructura basada en un dominio desestructurado en el extremo N terminal y otro globular. Además, la secuencia N terminal de Ssa2 contiene un alto número de residuos de Triptófano y Asparaginas (7 y 31), característica importante de las proteínas tipo prion. La proteína recombinante se obtuvo mediante la clonación de un gen sintético en la cepa bacteriana E. coli BL21 Codon Plus, y su posterior expresión y purificación mediante cromatografía de afinidad. Así mismo, la fracción globular de la proteína se cortó y clonó para proceder a su expresión y purificación con el fin de analizarla por separado. La caracterización de la capacidad de formar agregados amiloides de la proteína total y del dominio globular se analizó por métodos computacionales con los programas PASTA y WALTZ y mediante técnicas específicas como la tinción con Congo Red y Tioflavina-T, obteniendo como resultados gran tendencia a agregar sugiriendo que Ssa2 puede ser un prion potencial. 1

7 2. INTRODUCCIÓN 2.1 PLEGAMIENTO PROTEICO El proceso por el cual una proteína adquiere su conformación funcional una vez sintetizada en el ribosoma se denomina plegamiento. Este proceso genera estructuras tridimensionales desde una cadena polipeptídica lineal que posee una secuencia de residuos de aminoácidos particular. Aunque algunas cadenas polipéptidas adquieren espontáneamente su estado nativo, para otras proteínas, el plegamiento no se produce sin ayuda y está supervisado por un número de proteínas auxiliares, tales como catalizadores y chaperonas moleculares, que garantizan un alto grado de fidelidad en el plegamiento (Ecroyd & Carver, 2008). Errores en el proceso de plegamiento pueden generar una variedad de condiciones patológicas, ya que las proteínas pueden perder su función y adquirir propiedades tóxicas. La proteína en su estado nativo no es estática. Los elementos estructurales secundarios de los dominios, tanto como los dominios en sí están continuamente moviéndose en el espacio. Además, las actividades funcionales de las proteínas dependen de varios cambios conformacionales provocado por la unión de ligandos. A pesar de ser un proceso relativamente rápido, el plegado de una proteína normalmente no se produce en un solo paso, sino por el contrario, sucede a través de un número de estados de plegamiento intermediarios en los que se establecen contactos que son cruciales en la dirección de la estructura de la proteína correcta (Ecroyd & Carver, 2008). Aquellos estados intermediarios corresponden a aquella estructura termodinámicamente más estable en condiciones fisiológicas (Dobson, 2003; Selkoe, 2003). El proceso plegamiento es reversible. La proteína plegada, cuando sea necesario o cuando se somete al estrés puede desplegarse parcialmente a estados intermedios. 2.2 AGREGADOS PROTEICOS A pesar del control celular que existe para asegurar el correcto plegamiento de las proteínas, se pueden presentar problemas durante el proceso resultando en la formación de depósitos proteicos de estructura ordenada llamadas fibras amiloides causando enfermedades 2

8 amiloidogénicas como Alzheimer, Huntington, entre otras (Dobson, 2004; Ecroyd & Carver, 2008). Los agregados pueden también formar estructuras más densas y desordenadas denominadas cuerpos de inclusión (Figura 1). Cada enfermedad amilodoigénica involucra la agregación de una proteína además de otros componentes incluyendo otras proteínas y carbohidratos (Sunde, 1997). Figura 1. Proceso de plegamiento de las proteínas pasando por estados intermedios. Desde el estado intermediario pueden formar agregados ordenados como las fibras amiloides agregados desordenados resultando en precipitaciones (Ecroy et al, 2008) Gracias al estudio de proteínas y péptidos con características amiloidogénicas se ha revelado que eventos como el cambio en la secuencia de una proteína influyen en la tendencia a agregar indicando así que la secuencia primaria de las proteínas tiene un rol importante en la propensión a formar depósitos insolubles (Wurth et al., 2002; Dobson, 2003). Además, propiedades físico- químicas como la carga, la hidrofobicidad o la capacidad para adoptar conformación β estarán están involucrados también en dicho proceso (Chiti, 2003). No toda la secuencia de polipéptido contiene regiones de igual importancia para la agregación, se han observado fragmentos cortos de aminoácidos que pueden actuar como inhibidores de la agregación; mientras que otros pueden ser inductores de la misma (Ivanova et al., 2004; Ventura et al., 2004). Aquellas regiones inductoras que dirigen la agregación tienen una elevada tendencia a agregar cuando son aisladas, razón por la que se denominan Hot spots Fibras Amiloides Las fibras amiloides son agregados ordenados de una proteína o péptido. Más de 20 péptidos y proteínas se han identificado en fibrillas amiloides in vivo (Nilson, 2004). En algunos 3

9 casos, estas proteínas no están involuvradas en enfermedades amiloidogénicas lo que hace pensar que la habilidad para formar estructuras amiloides es un característica intrínseca de las cadenas polipetídicas y que cualquier proteína en condiciones apropiadas podría conseguir formar fibras amiloides (Dobson, 2003). A pesar de las diferencias en el tamaño, la estructura nativa y función de proteínas amiloides, todas las fibrillas de amiloides son de duración indeterminada, tienen aproximadamente 70 a 120Å (Figura 2) de diámetro, y muestran birrefringencia verde cuando se ven en la luz polarizada después de la tinción con Congo Red (Sunde & Blake, 1997; Makin & Serpell, 2005). Figura 2. Microscopia electrónica de transmisión de fibras amiloides teñidas. Se pueden observar fibras largas y no ramificadas de 100Å aproximadamente. (Makin, O. S. & Serpell, L. C. 2005). El proceso de agregación implica la formación de especies oligoméricas como resultado de interacciones relativamente no específicas. Los primeros agregados observados son estructuras descritas como pequeños agregados amorfos o micelas. Éstos parecen transformarse después en estructuras con morfologías más distintivas descritas como protofilamentos o protofibrillas que son generalmente cortas, espiraladas y delgadas (Dobson 2003; Dobson 2004). Las fibras amiloides son transmisibles produciendo patologías como en el caso de las formadas por el prion Scrapie. Existen además otras proteínas que forman las fibras que son putativamente transmisibles como Tau, Hungtinina y Aβ que provocan Taupatias, la enfermedad de Hungtinton y Alzheimer respectivamente. Sin embargo, otras proteínas amiloideas pueden transmitir funciones biológicas como es el caso de Sup35 (Soto, 2012). Existen métodos específicos para identificar la presencia de estas fibras. Las estructuras amiloides pueden ser detectas mediante tinción específica con Tioflavina T (Th-T) y Congo Red (CR). Sin embargo la formación de estas estructuras es comprobada también mediante microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular. 4

10 2.3 PROTEÍNAS PRION Los priones, descubiertos primero en hámsters (Prusiner 1982), son definidos como proteínas patógenas infecciosas causantes de un grupo de enfermedades neurodegenerativas (encefalopatías espongiformes transmisibles); y que a diferencia de virus y viroides, son resistentes a tratamientos inactivantes de ácidos nucleícos ya que carecen de ellos (Glover et al, 1997). Existen proteínas priones que son constituyentes normales de algunas membranas celulares como las de las neuronas del sistema nervioso central o membranas del tejido linfoide. El prion patógeno, denominado PrPSc, como otros priones patógenos se caracterizan por ser muy resistentes a proteasas y tener una estructura en hoja β. El alto porcentaje de hojas β presente en la proteína prion le proporciona la característica de no ser soluble en detergentes no desnaturalizantes y de formar fibras amiloides con frecuencia (Collinge, 2001; Apetri, 2004). Los proteínas prion están presentes en varios organismos como en humanos y ovejas causando patogenicidad o en levaduras cumpliendo una funcional biológica como es el caso de Sup Sup35 La Sup35 es una proteína de levadura formada por 685 residuos que pertenece a una familia de proteínas estructurales designadas como factores de liberación de cadenas polipeptídicas en eucariotes (erf3). Esta proteína está compuesta por dos dominios: los primeros 123 residuos correspondientes al dominio N terminal constituyen un dominio de tipo prion; es decir que produce fibras amiloides y además es transmisible, aunque no es homóloga a las proteínas priónicas de mamíferos. Mientras que el dominio C terminal que es altamente conservado es estructuralmente similar al factor de elongación EF-1α y es necesario para la viabilidad celular (Balbirnie et al., 2000; Pauskin et al., 1997). 5

11 2.3.2 Staphylococcal secretory antigen (Ssa2) Ssa2 es una proteína secretada subcelularmente por la bacteria S. aureus, que tiene 269 aminoácidos y un peso molecular de 29650Da (http://uniprot.org/uniprot/q2g2j2) Su función todavía a no es conocida, sin embargo; por similitud con otras proteínas de la misma familia se deduce que es una proteína inmunogénica, involucrada en procesos de virulencia que contiene un dominio peptidasa C51 y un dominio CHAP. La secuencia aminoacídica de Ssa2 es: MKKIATATIA TAGFATIAIA SGNQAHASEQ DNYGYNPNDP TSYSYTYTID AQGNYHYTWK GNWHPSQLNQ DNGYYSYYYY NGYNNYNYNN YNNGYSYNNY SRYNNYSNNN QSYNYNNYNS YNTNSYRTGG LGASYSTSSN NVQVTTTMAP SSNGRSISSG YTSGRNLYTS GQCTYYVFDR VGGKIGSTWG NASNWANAAA RAGYTVNNTP KAGAIMQTTQ GAYGHVAYVE SVNSNGSVRV SEMNYGYGPG VVTSRTISAS QASSYNFIH Staphylococcus aureus es un patógeno humano que causa diversas enfermedades desde abscesos en la piel hasta enfermedades invasivas severas. Vive en la piel, en membranas mucosas de animales de sangre caliente y sobre casi cualquier superficie incluyendo el agua. Esta bacteria es un coco Gram positivo agrupado en forma de racimo; mide de 0,5 a 1,5μm de diámetro; es móvil; anaerobio facultativo y fermentador de glucosa. La mayoría crece en presencia de 15% a 40% de sal (Bergey, 2007; Deuremberg & Stobberingh, 2008) DOMINIOS CHAP El dominio CHAP (cysteine, histidine- dependent amidohydrolases/peptidases) es una región entre 110 a 140 aminoácidos que se encuentra involucradoa en procesos de unión y división de peptidoglicanos, y está presente en gran variedad de proteínas de bacterias, bacteriófagos, Archea y otros organismos. En bacterias está comúnmente asociado con el dominio SH3 (Bateman & Rawlings, 2003). 6

12 Muchas de las proteínas que contienen este dominio no están caracterizadas, sin embargo, se cree que su función es la hidrólisis de peptidoglicanos. Además, se ha sugerido que las proteínas que lo contienen utilizan un residuo de cisteína catalítico en un mecanismo de ataque nucleofílico. Los primeros estudios realizados en este dominio sugirieron que tiene una estructura α + β. Estando su región N terminal compuesta por hélices α y su región C terminal por hojas β (Rigden et al., 2003; Bateman & Rawlings, 2003; 2.4 MODELAJE DE LA ESTRUCTURA PROTEÍCA El Modelaje de estructuras proteicas es un método por el cual se pueden generar modelos 3- D reales de proteínas que comparten una secuencia similar con proteínas cuyas estructuras son conocidas. La mayoría de algoritmos diseñados usan el Protein Data Bank (PDB) para derivar sus modelos, usando relaciones observadas entre trozos cortos de secuencia contigua y estructura secundaria SWISS-MODEL Swiss Model utiliza una librería de estructuras dianas experimentales para alinearlas con secuencias plantilla significantemente similares con la proteína conocida, la plantilla más similar es escogida. Basado en el alineamiento entre la secuencia de la proteína diana y la estructura de la plantilla, las coordenadas del modelo se construyen para las regiones del modelo estructuralmente conservadas. Los residuos correspondientes a las inserciones y deleciones en la alineación de la secuencia diana tienen que ser modelados de novo sin utilizar información de la plantilla. Después de aplicar mecanismos moleculares limitados basados en la minimización de la energía para regularizar la geometría de los modelos, se utilizan métodos de estimación de modelos de calidad para detectar los posibles errores e imprecisiones (Guex N, et al., 2009). 7

13 3. OBJETIVOS Identificar y caracterizar la proteína Ssa2 de Staphylococcus aureus mediante su clonación expresión y purificación. Caracterizar la capacidad de formar agregados amiloides por métodos computacionales y prácticos. Comprobar el comportamiento priónico de Ssa2 mediantes técnicas específicas para el análisis de agregación. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 MÉTODOS BIOINFORMÁTICOS Modelaje de la estructura proteica El algoritmo computacional de modelaje usado en esta investigación fue SWISS-MODEL con el fin de obtener una estructura modelo de la proteína estudiada en base a la secuencia de la proteína Sup35, que posee una fracción desestructurada y otra globular, ya que estas se asemejan secuencialmente Análisis de propensidad de agregación a) PASTA Este método PASTA (Trovato et al, 2006; predice regiones propensas a la agregación en función del apareamiento en forma de hoja β de dos cadenas polipeptídicas idénticas. Partiendo de la secuencia, el algoritmo calcula la energía teórica de apareamiento empleando un potencial de apareamiento basado en la tendencia del residuo a formar hojas β. Cuando para un apareamiento se calcula una energía inferior a un valor umbral los fragmentos proteicos implicados son identificados como propensos a agregar. b) WALTZ El algoritmo WALTZ (http://waltz.switchlab.org/) utiliza una matriz de puntaje de posición específica deducida del análisis biofísico y estructural de las propiedades amiloides de un gran 8

14 conjunto de hexapéptidos a distinguir entre secuencias de agregación amiloides o amorfas Este método se basa en que los hexapéptidos pueden formar fibrillas amiloides por sí mismo y en que la inserción de una larga secuencia amiloidogénica de seis residuos en una proteína soluble es suficiente para inducir la agregación en fibrillas amiloides (Castillo et al., 2011). 4.2 MÉTODOS DE DNA RECOMBINANTE Clonación Para la obtención de la proteína Ssa2 recombinante se realizó la clonación de un gen sintético correspondiente a su secuencia desde el vector puc57, adquirido comercialmente, al vector pet 28-B para su posterior transformación a la cepa de expresión E.coli BL21 Codon Plus. El vector pet 28-B (Figura 3), es un vector de expresión que posee varios sitios de restricción, tiene un tamaño de 5368 pb y contiene el gen de resistencia a kanamicina. Además contiene una cola de Histidinas que facilita la purificación de la proteína. Figura 3. Mapa del Vector pet28b (5568 pb). Cada vector se transformó en la cepa de clonaje E.coli XL1-Blue con resistencia a Ampicilina en el caso de puc57 y resistencia a Kanamicina en el de pet 28-B. Para comprobar que los vectores se clonaron correctamente se realizó la respectiva extracción de DNA plasmídico 9

15 siguiendo el protocolo del kit GeneJet Plasmid Miniprep (Fermentas Life Sciences); y se los observó en geles de agarosa 0,8%. Comprobada la correcta clonación de los vectores, se realizó su digestión con las enzimas XhoI y NcoI durante dos horas a 37 C en las siguientes proporciones: puc57-ssa2 (7µg/µL) 7µL pet 28-B (2,2µg/µL) 9µL XhoI 10u/ µl 1µL XhoI 10u/µL 1µL NcoI 10u/µL 1µL NcoI 10u/ µl 1µL Agua 7µL Agua 5µL buffer tango 10x 4µL buffer tango 10x 4µL La comprobación de la digestión se realizó cargando 10µL del producto digerido en geles de agarosa 2%. A continuación se cortaron del gel las bandas correspondientes al gen de Ssa2 y se las purificó con el kit GFT TM PCR and Gel Band Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante (GE HealthCare). Para la inserción del fragmento de interés en pet28-b, se desfosforiló al vector (20µL pet28 b, 1µL CIP y 2µL buffer 10x) durante 30 minutos a 37 C dicha reacción se detuvo con 1µL fosfatasa (1u/µL) a 75 C durante dos minutos. Se ligó el vector con el inserto durante 1h a 16 C. Se confirmó la presencia del vector con el inserto mediante digestión con las enzimas anteriormente utilizadas y su posterior separación por electroforesis en gel de agarosa 2%. El vector conteniendo 7,5µL de inserto se transformó en las células competentes de E. coli BL21 Codon Plus. La concentración de DNA se determinó mediante espectrofotometría, en el espectrofotómetro libre de cubeta NanoDrop, para lo cual se necesitó 1µL de DNA. La longitud de onda se fijó a 260 nanómetros. 10

16 4.2.2 Transformación de células competentes de E. coli Codon Plus La transformación de células competentes E.coli BL21 Codon Plus se realizó por choque térmico, procediendo de la siguiente manera: Se añadió 1µg del plásmido pet 28-B Ssa2 en 100µL de células competentes y se dejó incubar en hielo durante 30 minutos. Pasado este tiempo se realizó el choque térmico colocando las células competentes en baño a 42 C durante dos minutos y transfiriéndolas en hielo durante cinco minutos. Se añadió 900µL de medio LB y se las incubó una hora a 37 C en agitación. A continuación se centrifugó la muestra durante 3 minutos a 3000 RPM, se extrajo 900µL del sobrenadante y se resuspendió el pellet en los 100µL restantes. Para finalizar se sembraron las células en una placa de LB con Kanamicina y se incubaron las placas a 37 C overnight. 4.3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA Ssa Medios de cultivo y antibióticos Para la realización de los cultivos se prepararon los medios de cultivo Luria Broth (LB) y agar bacteriológico americano (Laboratorios CONDA S.A.), según la formulación siguiente: LB liquido: 10g triptona, 10g Cloruro de Sodio, 5g extracto de levadura /L H 2 O destilada Agar: 10g triptona, 10g Cloruro de Sodio, 5g extracto de levadura/l H 2 O destilada con Agar bacteriológico 1,5% ph 7. Los antibióticos utilizados fueron Kanamicina y Cloranfenicol (Sigma), a una concentración de 100µg/mL Condiciones del cultivo Los cultivos de E.coli BL21 Codon Plus en medio líquido se dejaron crecer en una incubadora Multriton Estándar (Insfors HT) con agitación constante de 250 RPM a 37 C durante 12 horas. 11

17 4.3.3 Crecimiento de cultivos e Inducción de expresión proteica Para la expresión de la proteína de interés se realizó un cultivo LB a partir de una colonia de células BL21- Codon Plus que contenía el plásmido con el inserto clonado. Para determinar el crecimiento bacteriano se utilizó el método de dispersión de luz, el cual permite conocer la cantidad de bacterias presentes en el cultivo a partir de la medida de densidad óptica (D.O) a 600nm. El medio de cultivo que contenía una dilución 1/100 de cada antibiótico (kanamicina y cloranfenicol), se incubó a 37 C en agitación hasta alcanzar una D.O. entre 0.5 y 0.7. Una vez alcanzada la D.O. mencionada, se indujo la expresión proteica añadiendo 1mM IPTG durante 4h. Los cultivos se centrigufaron después de la inducción a 4500 RPM durante 30 minutos. Obtenido el pellet, éste se resuspendió en 30mL de tampón nativo por litro de cultivo (50mM Tris HCl, 100mM NaCl ph7.5 con 6M de Cloruro de Guanidina). A continuación los cultivos se sonicaron durante 30 minutos a 70% de intensidad con intervalos de un segundo y centrifugados nuevamente a RPM durante 20 minutos para obtener el sobrenadante el cual fue sonicado 10 minutos más y filtrado en filtros de 0,45mm (Millipore), para proceder a la purificación Purificación de la proteína SsaA2 mediante cromatografía de afinidad Se purificó la proteína Ssa2 y la parte globular mediante cromatografía de afinidad usando columnas Histrap HP de 5mL (GE HealthCare) pre-empaquetadas con sefarosa de níquel que sirven para la purificación de proteínas que poseen una cola de histidinas. La columna se equilibró pasando 10 volúmenes (50mL) de binding buffer (5mM Imidazol; 0.5 NaCl; 6M GndHCl), a una velocidad de flujo de 3mL/minuto. Y 10 volúmenes de tampón Histrap 1 (20mM Tris HCl ph 8; 0,5M NaCl; 20mM Imidazol; 6M Gnd HCl), a una velocidad de flujo de 3mL/minuto. Una vez equilibrada la columna se cargó la proteína previamente filtrada a una velocidad de flujo de 1mL/min, seguido, se lavó la columna con 10 volúmenes de Histrap 1, y finalmente se 12

18 eluyó la proteína en 3 volúmenes de tampón Histrap 2 (50mM Tris HCl; 0,5M NaCl; 500mM imidazol y 6M Gnd HCL) Preparación de las muestras para los geles de Acrilamida-Bis-Acrilamida Para comprobar la correcta expresión de la proteína se prepararon diferentes muestras de los cultivos antes y después de la inducción con IPTG. Como control negativo se tomó 1mL de cultivo antes de añadir IPTG, la muestra fue centrifugada durante 15 minutos a máxima velocidad y el pellet obtenido se resuspendió en tampón nativo (50mM Tris HCl ph7.5, 100mM NaCl, 1mM EDTA). En cuanto al cultivo inducido, se tomó una muestra de 1 ml del cual se separó 100 µl que sería el extracto total, el resto de la muestra fue sonicada por un minuto al 70% y luego centrifugada 15 minutos a RPM. Se separó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en tampón nativo. Para comprobar la purificación de la proteína se tomaron muestras de la proteína antes de purificarla, después de cargarla en la columna, del lavado y de la elución en un volumen de 100 µl cada una. Se añadió 30µL de tampón de carga 3X ph 6.8 (Tris 180mM, Glicerol 30%, SDS 9%, β- mercaptoetanol 15%, azul de bromo fenol 0.05%) y se calentó las muestras durante 10 minutos a 90 C Determinación de la concentración proteica Una vez obtenidas las proteínas se determinó su concentración mediante espectrofotometría. Para calcular la concentración se aplicó la ley de Lambert-Beer a una longitud de 280nm. C= DO 280 /Ɛ 280. d Donde C equivale a la concentración de la proteína, DO 280 es la absorbancia de la muestra a 280 nm. Ɛ 280 el coeficiente de extinción molar (M -1 cm -1 ) para la proteína de interés a la misma longitud de onda y d el ancho del paso de la luz en cm. En nuestro caso Ɛ ml/mg.cm. 13

19 También se midió la absorbancia a 320nm, que proporciona información de scattering de la muestra, para determinar la concentración de posibles agregados presentes en las muestras. De esta manera se resta el valor de DO 320 a DO 280 con el fin de determinar la concentración de proteína soluble total. 4.4 MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS Electroforesis en Geles de Agarosa Los geles de agarosa se prepararon al 2% para la visualización de los productos de digestión, y al 0,8% para comprobar la clonación de los vectores. El producto de digestión se cargó en los pocillos del gel en un volumen de 10µL. Una vez preparada la agarosa se la vertió en la cubeta añadiendo 1,5µL de Bromuro de Etidio. El gel polimerizado se colocó en la cubeta de recorrido, la cual se aforo con Tampón TAE 1X. Los geles corrieron a 95V durante 30 minutos. TAE 1X: Gel Agarosa 2% 40mM Tris acetate 1mM EDTA 5g Agarosa 500mL TAE 1X Electroforesis SDS- PAGE El método electroforético usado fue la electroforesis SDS-PAGE, que se basa en la separación de las moléculas en función de su carga y su peso molecular aplicando un campo eléctrico externo. En nuestro caso se realizaron geles de Acrilamida - Bis- Acrilamida (37,5:1) al 15% con la siguiente composición: Gel Gel Separador Acrilamida (40% Concentrador 0,225mL 1,87mL Acrilamida/Bisacrilamida) Solución B --- 1,25mL 14

20 (1.5 M Tris 0.4% SDS) Solución C 0,5mL --- (0.46 M Tris 0.4% SDS) Agua destilada 1,27mL 1,87mL PSA 22,2µL 20 µl TEMED 2µL 5 µl Para correr los geles se preparó la cubeta del kit de electroforesis y se la aforó con tampón de recorrido 1X (Stock 10X: 12g Tris; 57,6g Glicina; 4g SDS). Los geles se corrieron a 20mA durante 2 horas Tinción y Destinción de los Geles Los geles se tiñeron durante minutos aproximadamente, mediante inmersión en Azul de Comassie preparada con la siguiente composición: 2 pastillas PhastGel Blue TM (Amersham Biosciences) 360mL 180mL 60mL Agua destilada Metanol Ácido Acético ácido acético). Posteriormente los geles se sumergieron en solución de destinción (20% metanol, 7,5% 4.5 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA Para este ensayo 5 µl de Ssa2 total y 5 µl de su fracción globular en tampón 50mM NaAc/ 100mM NaCl se digirieron con 1µg proteinasa K y se incubaron a 37 C en baño. Las alícuotas se removieron a diferentes intervalos de tiempo y la reacción se paró añadiendo 50µL de tampón de carga 3X. Seguidamente las muestras se calentaron durante 10 minutos a 90 C, y cargaron en geles de electroforesis 15% SDS-PAGE para observar la digestión de la proteína. 15

21 4.6 MÉTODOS BIOFÍSICOS Tinción específica de fibras amiloides El uso de compuestos que se unen específicamente a las estructuras amiloides es una de las técnicas más comunes para su detección. Dos de los más utilizados son el Congo Red (CR) y la Tioflavina- T (Th-T), sin embargo todavía no se conoce como estos compuestos interaccionan con dichas estructuras Unión de Tioflavina T El ensayo de Tioflavina se llevó a cabo utilizando 10µM de proteína total y 10µM de la fracción globular; y 25µM Th-T (Stock 250µM). De esta manera, 50uL de proteína (Stock 20µM) se mezclaron con 40µL tampón 50mM NaAc/100mM NaCl ph7.5 y 10µL de Th-T para alcanzar un volumen de 100µL. La mezcla se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. Los espectros de fluorescencia se recogieron en un equipo Jasco SpectroFluorometer FP La longitud de onda de excitación se fijó a 445nm y se registró el espectro de emisión entre 460 y 570nm. La apertura de la rejilla de excitación se fijó en 5nm, mientras que la de la rejilla de emisión en 10nm Unión de Congo Red Se mezcló 100µL de proteína, 20µL de CR (250µM) y 80µL de tampón (50mM NaAc/100mM NaCl ph 7.5). Las muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. La unión del CR a las fibras amiloides se midió mediante espectrofotometría utilizando un espectrofotómetro de luz UV- visible CARY 400 B-10. Se recogió el espectro de absorción del CR, de la proteína Ssa2 completa y la fracción globular antes y después de añadir CR en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 380 y 650nm Unión de Bis-ANS Para alcanzar un volumen final de 200µL se mezcló 99µL de proteína total o de fracción globular, 1µL de solución bis-ans 200µM y 100µL (50mM NaAc/100mM NaCl ph7.5). Los espectros de fluorescencia se recogieron en un equipo Jasco SpectroFluorometer FP La 16

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