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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12Q 1/68 C12P 19/34 C07H 1/12 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Marcadores genéticos para el tamaño de camadas de cerdos. k Prioridad: US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 73 Titular/es: IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC. 214 O & L Building, Iowa State University Ames, 1A Iowa 0011-, US BIOTECHNOLOGY RESEARCH AND DEVELOPMENT CORPORATION k 72 Inventor/es: Rothschild, Max F. y Jacobson, Carol D. k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Dávila Baz, Angel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCION Marcadores genéticos para el tamaño de camadas de cerdos Campo de la invención Esta invención se refiere generalmente a la detección de diferencias genéticas para la eficacia reproductora entre cerdos y particularmente a marcadores genéticos útiles para identificar cerdos, más probablemente para producir mayores tamaños de las camadas. Antecedentes de la invención La eficacia reproductora, que puede definirse como el número de cerdos producidos por hembra reproductora, es el factor limitativo principal en la producción eficaz de ganado porcino. El número de cerdos nacidos vivos en los Estados Unidos es por término medio aproximadamente 9, cerdos por camada. La heredabilidad para el tamaño de la camada es baja ( %-1 %) y los métodos genéticos estándar para seleccionar hembras reproductoras sobre la base del tamaño de camadas anteriores no han sido eficaces. Por lo tanto, hay una necesidad de un sistema que trate de la selección y la reproducción al nivel celular o del DNA. Las razas chinas son conocidas por alcanzar la pubertad a una edad temprana y por su gran tamaño de las camadas. Las razas americanas son conocidas por sus mayores velocidades de crecimiento y magrez. Así, sería deseable combinar las mejores características de ambos tipos de razas, mejorando de ese modo la eficacia de la producción de ganado porcino en los EE.UU. Estos esfuerzos estarían muy apoyados por el descubrimiento de genes o marcadores genéticos que estuvieran asociados con el tamaño incrementado de la camada en cerdos. La reproducción en los mamíferos tiene lugar en respuesta a una cadena de sucesos que se producen entre el cerebro y los órganos reproductores. Las hormonas esteroideas, tales como el estrógeno, juegan un papel crucial. Las hormonas esteroideas interactúan con células y tejidos, iniciando una serie de sucesos que dan como resultado la capacidad para reproducirse satisfactoriamente. En los cerdos, el estrógeno, que es producido principalmente por los ovarios, tiene efectos profundos sobre el útero, el cerebro y la glándula pituitaria. Los estrógenos modulan el inicio de la pubertad, los comportamientos reproductores, la liberación cíclica de gonadotropinas y el comportamiento alimenticio. Los efectos de los estrógenos tienen lugar como resultado de la unión de estrógeno a proteínas receptoras específicas encontradas en el núcleo de las células sensibles a estrógeno. McEwen y otros, Recent Prog. Horm. Res., 38:41-92 (1982). El gen responsable de codificar el receptor de estrógeno humano se ha identificado, y está disponible públicamente de the American Type Culture Collection. Véase el Catálogo de ATCC de Septiembre de 1990, página 112, entrada La sonde se denomina por3 y tiene 1,3 kb. Green y otros, Nature (Londres) 3: (1986). Se sabe que el gen humano es polimórfico como resultado del análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Castagnoli y otros, Nucl. Acids Res., 1:886 (1987); Coleman y otros, Nucl. Acids. Res., 16:78 (1988). Las diferencias funcionales relativas a estos genotipos diferentes no se entienden bien, pero se han implicado en abortos espontáneos incrementados en seres humanos con cáncer de mama. Lehrer y otros, The Lancet, 33: (17 de Marzo de 1990). El gen receptor de estrógeno se ha aislado y sometido a secuenciación para otras especies, pero no para cerdos. Koike y otros, Nucl. Acids. Res., 1: (1987) presentan el aislamiento y la secuenciación de un clon de cdna del receptor de estrógeno de útero de rata. Los autores indican que una comparación de secuencias de receptor de estrógeno de rata, ser humano y pollo indica la presencia de tres regiones altamente conservadas, sugiriendo que estas regiones juegan papeles importantes en la función del receptor de estrógeno. Además, Koike y otros, Biochemistry 26: (1987), presenta la caracterización parcial del sitio de unión a receptor de estrógeno porcino. El artículo presenta un fragmento de aproximadamente kda que probablemente corresponde a la región media C-terminal hidrófoba y tiene más de 90 % de homología con las secuencias de rata, ser humano y pollo correspondientes. El análisis del RFLP ha sido usado por varios grupos para estudiar el DNA del cerdo. Jung y otros, Theor. Appl. Genet., 77: (1989) describe el uso de técnicas de RFLP para mostrar variabilidad 2

3 ES T3 1 2 genética entre dos razas de cerdo. Se demostró polimorfismo para genes de Clase I de antígeno leucocítico porcino (SLA). Hoganson y otros, Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, de Marzo de 1990, presenta el polimorfismo de genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) porcino para cerdos chinos, también demostrado mediante análisis del RFLP. Jung y otros, Animal Genetics, :79-91 (1989) presenta el análisis del RFLP de genes de SLA Clase I en ciertos verracos. Los autores indican que los resultados sugieren que puede haber una asociación entre genes de SLA/MHC Clase I porcinos y los rasgos de producción y comportamiento. También indican que el uso de fragmentos de restricción de SLA Clase I, como marcadores genéticos, puede tener potencial en el futuro para mejorar el comportamiento de los cerdos. Chardon y otros (Immunogenetics, 21: (198)) usaba sondas de cdna de HLA humano para analizar el polimorfismo RFLP del SLA-complejo principal de histocompatibilidad en cerdos. WO 88/0847 describía polimorfismos en el gen de insulina humana y mostraba que éstos eran predictivos de hipertensión por alto contenido de renina en sujetos humanos individuales. Antes de la presente invención, el análisis del RFLP no se ha aplicado al gen receptor de estrógeno de cerdo, que incluso no se ha identificado. La presente invención vence estas deficiencias. Proporciona marcadores genéticos, basados en el descubrimiento de polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de cerdo, que se refieren al tamaño incrementado de la camada en cerdos. Esto permitirá el rastreo y el tipaje genético de cerdos con respecto a sus genes receptores de estrógeno. También permitirá la identificación de machos y hembras individuales que se esperará que produzcan un tamaño de la camada mayor que la media para su raza. Sumario de la invención Un objetivo de la invención es proporcionar un método para rastrear cerdos para determinar los más propensos a producir camadas mayores Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para identificar marcadores genéticos para el tamaño de camadas de cerdos. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar marcadores genéticos para el tamaño de camadas de cerdos. Otro objetivo más de la invención es proporcionar un estuche para evaluar una muestra de DNA de cerdo. Objetivos y ventajas adicionales de la invención se indicarán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvios a partir de la descripción, o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los objetivos y las ventajas de la invención se alcanzarán por medio de las herramientas y combinaciones apuntadas particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Para alcanzar los objetivos y de acuerdo con el propósito de la invención, según se expresa y se describe ampliamente aquí, la presente invención proporciona un método para rastrear cerdos para determinar los más propensos a producir una camada mayor cuando se reproducen. Se obtiene una muestra de DNA genómico de un cerdo, y se determina la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen receptor de estrógeno correlacionado con el tamaño incrementado de las camadas. Preferiblemente, el polimorfismo es un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción. La presencia o ausencia de un fragmento o patrón de RFLP específico se identifica mediante las siguientes etapas. En primer lugar, el DNA genómico se digiere con una endonucleasa de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en al menos un lugar. En segundo lugar, los fragmentos obtenidos de la digestión se separan, preferiblemente mediante electroforesis en gel. En tercer lugar, los fragmentos se detectan con una sonda capaz de hibridarse a ellos. Esto genera un patrón de restricción. Finalmente, el patrón de restricción se compara con un patrón de RFLP conocido para este gen que se correlaciona con el tamaño incrementado de las camadas. El segundo patrón es uno obtenido usando la misma endonucleasa de restricción y la misma sonda o una sonda equivalente. Preferiblemente, la sonda es el gen receptor de estrógeno humano. En otra modalidad, la invención comprende un método para identificar un marcador genético para el tamaño de camadas de cerdos. Se reproducen cerdos macho y hembra de la misma raza o cruce de razas 3

4 ES T3 1 o linaje genético similar, y se determina el número de descendencia producido por cada cerdo hembra. El polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de cada cerdo se determina y se asocia con el número de descendencia. Preferiblemente, se usa análisis del RFLP para determinar el polimorfismo y, lo más preferiblemente, el DNA genómico se digiere con la endonucleasa de restricción Pvu II. Para cerdos de la raza Meishan, tal análisis produce un fragmento de 4,3 kilobases asociado con un tamaño incrementado de la camada. La invención comprende además un estuche para evaluar una muestra de DNA de cerdo. Como mínimo, el estuche es un recipiente con uno o más reactivos que identifican polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de cerdo. Preferiblemente, el reactivo es una sonda que se hibrida con el gen receptor de estrógeno de cerdo o fragmentos del mismo. Preferiblemente, la sonda es el gen receptor de estrógeno humano. Preferiblemente, el estuche contiene además una enzima de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en al menos un lugar. La figura adjunta, que se incorpora en y constituye una parte de esta memoria descriptiva, ilustra una modalidad de la invención y, junto con la descripción, sirve para explicar los principios de la invención. Breve descripción del dibujo La figura 1 muestra el análisis del RFLP de DNA de cerdo Duroc (trayectoria 1) y chino (trayectorias 2-16) usando la sonda de gen de receptor de estrógeno humano. Descripción detallada de la invención Se hará ahora referencia con detalle a las modalidades actualmente preferidas de la invención, que, junto con los siguientes ejemplos, sirven para explicar los principios de la invención. La invención se refiere a marcadores genéticos para el tamaño de las camadas en cerdos. Proporciona un método para rastrear cerdos para determinar los más propensos a producir una camada mayor cuando se reproducen, identificando la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen receptor de estrógeno que se correlaciona con el tamaño incrementado de la camada. Según se usa aquí, el término tamaño incrementado de la camada significa un incremento significativo en el tamaño de la camada por encima de la media de una población dada. El uso de RFLPs es el método preferido para detectar el polimorfismo. Sin embargo, puesto que el uso del análisis del RFLP depende finalmente de los polimorfismos y los sitios de restricción de DNA a lo largo de la molécula de ácido nucleico, también pueden usarse otros métodos para detectar el polimorfismo. Tales métodos incluyen los que analizan el producto génico polimórfico y detectan polimorfismos detectando las diferencias resultantes en el producto génico. El análisis del RFLP en general es una técnica bien conocida para los expertos en la industria. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU concedida el 1 de Abril de 1986 a Erlich, y , concedidael19demayode1987agusella. En general, la técnica implica obtener el DNA que ha de estudiarse, digerir el DNA con endonucleasas de restricción, separar los fragmentos resultantes y detectar los fragmentos. En la presente invención, se obtiene una muestra de DNA genómico de un cerdo. Generalmente, se usan células de sangre periférica como la fuente del DNA. Se obtiene una cantidad suficiente de células para proporcionar una cantidad suficiente de DNA para análisis. Esta cantidad será conocidaofácilmente determinable por los expertos en la industria. El DNA se aísla de las células sanguíneas mediante técnicas conocidas para los expertos en la industria. En ciertos casos, puede ser deseable amplificar la cantidad de DNA a través del uso de técnicas estándar, tales como la reacción en cadena de la polimerasa. Esta técnica se describe en las Patentes de EE.UU , concedida el 28 de Julio de 1987 a Mullis y otros, , concedida el 28 de Julio de 1987 a Mullis y otros, , concedida el 24 de Enero de 1989 a Mullis y otros, , concedida el 26 de Diciembre de 1989 a Gelfand y otros, y , concedida el de Febrero de 1990 a Columbus y otros. El DNA aislado se digiere a continuación con una endonucleasa de restricción que segmenta o corta DNA hidrolíticamente en una secuencia nucleotídica específica, denominada un sitio de restricción. Tales 4

5 ES T endonucleasas, también llamadas enzimas de restricción, son bien conocidas para los expertos en la industria. Paralapresenteinvención, debe elegirse una que segmente el gen receptor de estrógeno de cerdo en al menos un lugar, produciendo al menos dos fragmentos del gen. Se realiza una determinación de si tales fragmentos son polimórficos o no y si el polimorfismo está asociado con el tamaño de la camada mediante técnicas conocidas en la industria junto con las enseñanzas contenidas aquí. Preferiblemente, tal endonucleasa de restricción es Pvu II. La cantidad de tal enzima que ha de añadirse a la muestra que contiene el DNA de cerdo y las otras condiciones apropiadas para tratar la muestra serán fácilmente determinables por personas expertas en la industria, dadas las enseñanzas contenidas aquí. Los fragmentos de restricción se analizan a continuación mediante técnicas conocidas que implican generalmente la separación de los fragmentos para obtener un patrón particular o la determinación de diferentes tamaños de los fragmentos. La técnica preferida para hacer esto es la electroforesis en gel. En esta técnica, los fragmentos digeridos se separan en un medio de soporte por tamaño bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. Se usan típicamente láminas o tabletas de gel, tales como agarosa o agarosa-acrilamida, como el medio de soporte. La muestra, que contiene los fragmentos de restricción, se añade a un extremo del gel. Uno o más marcadores de tamaño se hacen pasar sobre el mismo gel como controles para permitir una estimación del tamaño de los fragmentos de restricción. Este procedimiento permite generalmente un grado de resolución que separa fragmentos que difieren en tamaño entre sí en tan poco como 0 pares de bases. Los fragmentos separados, preferiblemente, a continuación, se desnaturalizan y se transfieren físicamente desde el gel hasta un filtro, preferiblemente una membrana de nailon, poniendo en contacto el gel con el filtro en presencia de reactivos apropiados y bajo condiciones apropiadas que promueven la transferencia del DNA. Tales reactivos y condiciones son bien conocidos para los expertos en la industria. Así, se mantienen las posiciones relativas de los fragmentos de DNA resultantes del procedimiento de separación. La siguiente etapa implica la detección de las diversas categorías de tamaños de los fragmentos o, alternativamente, la detección de un fragmento de un tamaño particular. El último puede ser de particular interés debido a que es un marcador genético asociado con el tamaño incrementado de la camada. En cualquier caso, la técnica preferida es el uso de una sonda de hibridación. Tal sonda es un oligonucleótido o polinucleótido que es suficientemente complementario u homólogo con los fragmentos para hibridarse con ellos, formando complejos de sonda-fragmento. Preferiblemente, la sonda es una sonda de cdna. El oligonucleótido o polinucleótido se etiqueta con una entidad detectable. Esto permite la detección de los fragmentos de restricción, a los que están hibridadas las sondas. Las sondas se etiquetan mediante técnicas de etiquetaje estándar, tales como una radioetiqueta, una etiqueta enzimática, una etiqueta fluorescente, una etiqueta de biotina-avidina, y similares. En la presente invención, se usa un cdna para el gen receptor de estrógeno humano como el polinucleótido de la sonda. Preferiblemente, el resto detectable es 32 P o biotina-avidina. Los inventores han descubierto que esta sonda es suficientemente homóloga al gen receptor de estrógeno de cerdo para unirse a él y a los diversos fragmentos producidos mediante endonucleasas de restricción. Sin embargo, otras sondas sustancialmente equivalentes pueden ser determinadas por los expertos en la industria, dadas las enseñanzas contenidas aquí. Según se usa aquí, una sonda que es sustancialmente equivalente a la sonda del gen del receptor de estrógeno humano es una que se hibrida a los mismos fragmentos polimórficos de digestos del gen receptor de estrógeno de cerdo que la sonda del gen receptor de estrógeno humano cuando se usa la misma enzima de restricción. Por ejemplo, fragmentos particulares que están asociados con el tamaño de la camada de los cerdos pueden someterse a secuenciación mediante técnicas conocidas, y pueden prepararse sondas sintéticas, también mediante técnicas conocidas. En el método preferido, las sondas se ponen en contacto con la membrana de nailon que contiene los fragmentos de restricción durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones de hibridación apropiadas para que las sondas se hibriden a los fragmentos. El filtro se lava a continuación preferiblemente para retirar sondas no unidas y otros materiales no deseados. Los complejos de sonda-fragmento, que están unidos al filtro, se detectan a continuación mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, si la sonda se ha etiquetado radiactivamente ( 32 P), la detección implica poner en contacto el papel de membrana de nailon con un trozo de película radiosensible. Después de un período de exposición apropiado, se visualiza el fragmento de interés, incluyendo fragmentos de control. La etapa de detección proporciona un patrón, resultante de la separación de los fragmentos por

6 ES T tamaño. La comparación de estos fragmentos con fragmentos de control de tamaño conocido que también se han hecho pasar sobre el mismo gel permite la estimación del tamaño de los diversos grupos de fragmentos. Los diversos polimorfismos en el gen receptor de estrógeno de cerdo se determinan a continuación por comparación de los patrones producidos mediante un análisis similar de DNA procedente de un número de cerdos diferentes. Para algunos de los cerdos individuales, los patrones digerirán el patrón habitual producido por la mayoría de los otros cerdos. Esto se deberá a uno o más polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción, es decir, fragmentos de restricción de una longitud diferente producidos por la endonucleasa que corta el gen receptor de estrógeno de cerdo. Esto indica diferentes secuencias de pares de bases en tales cerdos. Una vez que se ha identificado un RFLP particular, es decir, un fragmento de restricción de una longitud particular, puede construirse una sonda para este fragmento mediante el uso de técnicas conocidas. Esto permite formatos alternativos y más rápidos para detectar tal polimorfismo. Por ejemplo, una vez que el DNA se digiere, puede usarse un formato de hibridación de tipo sándwich. Tal ensayo se describe en las Patentes de EE.UU , concedida el 4 de Diciembre de 1984 a Ranki y otros, y , concedida el 7 de Enero de 1986 a Ranki y otros. La muestra se pone en contacto con una sonda de captura que está inmovilizada sobre un portador sólido. La sonda se une al fragmento. El portador se lava a continuación y se añade una sonda de detección etiquetada. Después del lavado opcional, la sonda de detección se detecta, demostrando de ese modo la presencia del fragmento deseado. Una vez que se ha determinado el patrón de RFLP o se ha determinado un fragmento polimórfico particular, se compara con un segundo patrón de RFLP o un fragmento conocido que se correlaciona con el tamaño incrementado de las camadas. Este segundo patrón o fragmento también se ha determinado a partir del gen receptor de estrógeno de cerdo, usando la misma endonucleasa de restricción que el primero y la misma sonda o un equivalente de la misma. En una modalidad alternativa de la invención, los fragmentos de restricción pueden detectarse mediante hibridación en solución. En esta técnica, los fragmentos se hibridan en primer lugar con la sonda y a continuación se separan. Los complejos de sonda-fragmento separados se detectan a continuación detectando el resto detectable en la sonda según se analiza anteriormente. Generalmente, tales complejos se detectan sobre el gel sin transferencia a papel de filtro. Aunque los métodos anteriores se describen en términos del uso de una sola enzima de restricción y una sola sonda, los métodos no están limitados así. Pueden usarse una o más enzimas de restricción y/o sondas adicionales, si se desea. Las enzimas, las razas y las sondas construidas adicionales pueden determinarse a partir de la experimentación habitual. Los marcadores genéticos para el tamaño de camadas de cerdos se determinan como sigue. Se aparean cerdos macho y hembra de la misma raza o cruce de razas o derivados de linajes genéticos similares. Se determia el número de descendencia producido por cada cerdo hembra. Se efectúa el análisis del RFLP del DNA parental según se analiza anteriormente para determinar polimorfismos en el gen receptor de estrógeno de cada cerdo. Los polimorfismos se asocian con el número de descendencia. Se usan al menos y preferiblemente al menos cerdos hembra para realizar estas determinaciones. El número de veces que cada hembra produce una camada (es decir, la paridad) es al menos una vez. Preferiblemente, el ciclo de reproducción y nacimiento se repite al menos dos veces y lo más preferiblemente tres veces. Las razas preferidas de cerdos son Meishan, Fengjing, Minzhu, Duroc, Hampshire, Landrace, Large White, Yorkshire, Spotted Poland China, Bershire, Poland China, y Chester White. Las razas más preferidas son Duroc, Hampshire, Landrace, Large White, Yorkshire, y Chester White. Cuando este análisis se efectúa para la raza Meishan y el polimorfismo se determina mediante análisis del RFLP usando la endonucleasa de restricción Pvu II, se asocia un fragmento de 4,3 kilobases con el tamaño incrementado de la camada. Los reactivos adecuados para aplicar los métodos de la invención pueden envasarse en estuches convenientes. Los estuches proporcionan los materiales necesarios, envasados en recipientes adecuados. Preferiblemente, los recipientes también son soportes útiles al realizar el ensayo. Como mínimo, el estuche contiene un reactivo que identifica un polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de cerdo que está asociado con un tamaño incrementado de la camada. Preferiblemente, el reactivo es una sonda que se hibrida con el gen receptor de estrógeno de cerdo o fragmentos del mismo. Preferiblemente, se incluyen en el estuche tanto la sonda como la enzima de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en al menos un lugar. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la sonda comprende el gen receptor de estrógeno humano, un gen receptor de estrógeno de cerdo, o un fragmento génico que se ha etiquetado con una entidad detectable, y la enzima de restricción comprende Pvu II. Preferiblemente, el estuche comprende además medios adicionales, tales como reactivos, para detectar 6

7 ES T3 o medir la entidad detectable o proporcionar un control. Si se desea también pueden incluirse otros reactivosusadosparahibridación, prehibridación, extracción de DNA, etc. 1 2 Los métodos y los materiales de la invención también pueden usarse más generalmente para evaluar DNA de cerdo, tipificar genéticamente cerdos individuales y detectar diferencias genéticas del cerdo. En particular, una muestra de DNA genómico de cerdo puede evaluarse mediante referencia a uno o más controles. El análisis del RFLP se realiza con respecto al gen receptor de estrógeno de cerdo, y los resultados se comparan con un control. El control es el resultado de un análisis del RFLP del gen receptor de estrógeno de cerdo de un cerdo diferente. De forma similar, un cerdo puede tipificarse genéticamente obteniendo una muestra de su DNA genómico, efectuando el análisis del RFLP del gen receptor de estrógeno en el DNA y comparando los resultados con un control. De nuevo, el control es los resultados del análisis del RFLP de un gen receptor de estrógeno de un cerdo diferente. Finalmente, las diferencias genéticas entre cerdos pueden detectarse obteniendo muestras del DNA genómico a partir de al menos dos cerdos, identificando la presencia o ausencia de polimorfismo en el gen receptor de estrógeno y comparando los resultados. Estos ensayos son útiles para identificar marcadores genéticos relacionados con el tamaño de la camada, según se analiza anteriormente, para identificar otros polimorfismos en el gen receptor de estrógeno que pueden correlacionarse con otras características, y para el análisis científico general de genotipos y fenotipos de cerdo. Debe entenderse que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o un entorno específico estará dentro de las capacidades de alguien que tenga una experiencia normal en la industria a la luz de las enseñanzas contenidas aquí. Los ejemplos de los productos y los procedimientos de la presente invención aparecen en los siguientes ejemplos. Ejemplo Marcador Genético para el Tamaño Incrementado de la Camada en Cerdos Meishan Materiales y Métodos Los procedimientos para detectar los polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) eran como sigue. Se obtuvieron ml de sangre estéril de cada cerdo. Se realizó a continuación el aislamiento de DNA genómico a partir de glóbulos blancos, seguido por la digestión mediante endonucleasa de restricción Pvu II, transferencia Southern e hibridación con la sonda de gen receptor de estrógeno, según se esboza en Flanagan y otros, Immunogenetics 27: (1988). Se determinaron los tamaños moleculares de los fragmentos de restricción mediante comparación con marcadores del tamaño molecular para fragmentos de restricción de DNA de lambda cortado con Hind III que se hacen pasar en paralelo sobre los geles de hibridación. La sonda del receptor de estrógeno era una sonda de 1,3 kb del gen receptor de estrógeno aislado de seres humanos (locus ESR) que se obtenía de The American Tissue Culture Collection NIH repository of Human and Mouse DNA Probes (ATCC N 7681) y etiquetado con 32 P. Resultados Usando el gen receptor de estrógeno humano como una sonda, se ha usado análisis del RFLP sobre cerdos chinos, americanos y NIH miniatura para detectar diferencias genéticas con respecto al locus del receptor de estrógeno homólogo en el cerdo. Los resultados revelan que hay al menos cuatro fragmentos que son polimórficos en el cerdo. Estos fragmentos están en 3,7, 4,3,,0 y 7,7 kb. Además, se investigó si los patrones de los fragmentos de restricción polimórficos estaban relacionados con el tamaño de la camada en las 22 hembras Meishan originales. Véase la Tabla 1. Basándose en los resultados, el fragmento de 4,3 kb parece incrementar el tamaño de la camada mientras que no tener el 4,3 kb parece ser una desventaja. Estos datos indican que se ha encontrado un marcador génicoparael tamaño de la camada en cerdos Meishan. 7

8 ES T3 TABLA 1 Medias y errores estándar del tamaño de la camada en hembras Meishan mediante paridad y fragmento de receptor de estrógeno Paridad Fragmentos Con NB 12,7 ± 0,84 14,2 ± 1,16 16,3 ± 0,33 4,3 kb NBA 12,4 ± 0,81 12,8 ± 0,92 1,0 ± 1,3 N 7 3 Sin NB 11,4 ± 0,71 11,4 ± 1,31 13, ± 1,84 4,3 kb NBA,9 ± 0,6,2 ± 1,17 13,3 ± 1,79 N NB = Número de Nacimientos, NBA = Número de Nacimientos Vivos, N = Número de camadas

9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Un método para rastrear cerdos para determinar los más propensos a producir camadas mayores, que comprende las etapas de: obtener una muestra de DNA genómico de un cerdo; y determinar la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen receptor de estrógeno asociado con el tamaño incrementado de la camada El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polimorfismo es un polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP). 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha etapa de identificar la presencia o ausencia de dicho RFLP comprende las etapas de: digerir dicho DNA genómico con una endonucleasa de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en al menos un lugar; separar los fragmentos obtenidos de dicha digestión; detectar dichos fragmentos con una sonda capaz de hibridarse a dichos fragmentos, generando de ese modo un patrón de restricción; y comparar dicho patrón con un segundo patrón de RFLP para el gen receptor de estrógeno de cerdo obtenido usando dicha endonucleasa de restricción y dicha sonda o un equivalente de la misma, en donde dicho segundo patrón de RFLP está asociado con el tamaño incrementado de la camada. II. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha endonucleasa de restricción es Pvu. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha separación es mediante electroforesis en gel. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha sonda es el gen receptor de estrógeno humano o un equivalente sustancial del mismo, estando etiquetado dicho gen o equivalente sustancial con una entidad detectable. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha etapa de comparar dichos patrones de restricción comprende identificar fragmentos específicos por tamaño y comparar los tamaños de dichos fragmentos. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además la etapa de amplificar la cantidad de dicho gen receptor de estrógeno de cerdo antes de dicha etapa de digestión El método de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicha etapa de identificar la presencia o ausencia de dicho RFLP comprende la etapa de: añadir a dicha muestra una enzima de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en fragmentos; y detectar los diferentes tamaños de dichos fragmentos.. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha etapa de detectar los diferentes tamaños de dichos fragmentos comprende las etapas de: separar dichos fragmentos por tamaño usando electroforesis en gel en presencia de un fragmento de DNA de control de tamaño conocido; poner en contacto dichos fragmentos separados con una sonda que se hibrida con dichos fragmentos para formar complejos de sonda-fragmento; y determinar el tamaño de los fragmentos separados detectando la presencia de los complejos de sonda- 9

10 ES T3 fragmento y determinando sus posiciones relativas con respecto a dicho fragmento de DNA de control El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha etapa de identificar la presencia o ausencia de dicho RFLP comprende las etapas de: añadir a dicha muestra una enzima de restricción que segmenta el gen receptor de estrógeno de cerdo en fragmentos; y determinar la presencia o ausencia de un fragmento de DNA de tamaño conocido. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha etapa de determinar la presencia o ausencia de dicho fragmento de DNA de tamaño conocido comprende las etapas de: poner en contacto dicha muestra con una sonda que se hibrida con dicho fragmento de DNA de tamaño conocido para formar complejos de sonda-fragmento; y detectar la presencia o ausencia de dichos complejos. 13. Un método para identificar un marcador genético para el tamaño de camadas de cerdos que comprende las etapas de: reproducir cerdos macho y hembra de la misma raza o cruce de razas o derivados de linajes genéticos similares; 2 determinar el número de descendencia producido por cada cerdo hembra; determinar el polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de cada cerdo; y 3 asociar dicho número de descendencia con dicho polimorfismo. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho polimorfismo se determina mediante análisis del RFLP. 1. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la etapa de determinación comprende aislar uno o más fragmentos de restricción. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los uno o más fragmentos se identifican como un marcador o marcadores para el tamaño incrementado de camadas de cerdo El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha raza se selecciona del grupo que consiste en Meishan, Fengjing, Minzhu, Duroc, Hampshire, Landrace, Large White, Yorkshire y Chester White. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha raza es Meishan y dicho polimorfismo se determina mediante análisis del RFLP. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho análisis del RFLP comprende digestión de DNA genómico con la endonucleasa de restricción Pvu II. 0. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho análisis del RFLP produce un fragmento de 4,3 kilobases correlacionado con el tamaño incrementado de la camada.

11 ES T3 21. Un marcador genético para el tamaño incrementado de la camada en cerdos, que comprende el fragmento de restricción de 4,3 kilobases obtenido digiriendo DNA que comprende el gen ESR y aislado de dichos cerdos con la endonucleasa de restricción Pvu II NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 11

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