DIFERENCIACIÓN ANALÍTICA DE GENOTIPOS DE CERDO IBERICO

Transcripción

1 Proyecto Nº SC DIFERENCIACIÓN ANALÍTICA DE GENOTIPOS DE CERDO IBERICO Equipo Investigador: Mª Carmen Rodríguez Valdovinos (Dra. C.B.) Carmen Castellanos Sánchez (I.T.A.) Jaime Rodrigáñez Bustos (I.A.) Julián Pérez Pérez (Dr. C.B.) Equivalente de jornada completa: 2,60 Centro de Investigación: Centro de Investigación y Tecnología. (SGIT). INIA. Duración: Coste: Enero Diciembre 1997 Miles de pesetas: Financiación INIA 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS En la actualidad la producción de cerdos Ibéricos está orientada mayoritariamente al mercado de productos curados de alta calidad, como son jamones, paletas y lomos. Debido al lento crecimiento de los cerdos Ibéricos puros y al bajo rendimiento de sus canales, la mayor parte de los animales sacrificados proceden de cruzamientos con otras razas, fundamentalmente Duroc. La generalización del cruzamiento con esta raza ha originado que, según el censo realizado en 1995 por la asociación de ganaderos de cerdo Ibérico (AECERIBER), mas de 1/3 de las reproductoras censadas de tipo Ibérico sean híbridas Ibérico x Duroc. Se estima que menos del 25% de los animales sacrificados son Ibéricos puros, el 35% de las canales son de animales Ibéricos al 50% y el 40% restante de animales al 75%. Hasta el momento la caracterización de los animales de tipo Ibérico se ha basado exclusivamente en criterios de tipo morfológico que, si bien pueden ser de cierta utilidad en animales cruzados al 50%, pueden ser de escasa utilidad en animales con un 25% o menos de genes Duroc. Por otra parte, aunque las reglamentaciones de las Denominaciones de Origen existentes exigen una proporción mínima del 75% de genes de Ibérico para sus productos elite, no existe ningún procedimiento que permitan determinar la existencia de genes Duroc en las canales o en los productos elaborados, aunque tradicionalmente se asocia óptima calidad con cerdos Ibéricos puros. Los objetivos del proyecto estaban dirigidos a: ƒ1. Establecimiento de un sistema analítico de diferenciación de los tipos genéticos: Ibérico, 50% Duroc/50% Ibérico y 25% Duroc/75% Ibérico. Basado en un mínimo de 7 marcadores RAPD diagnóstico del genotipo Duroc ƒ2. Aplicación del sistema a lomos y jamones en sangre y curados. ƒ3. Extensión del método a la diferenciación de líneas de Ibérico. 1. Obtención de marcadores específicos del genomio Duroc El desarrollo experimentado en los últimos años por las técnicas de biología molecular ha permitido disponer de polimorfismos basados en la detección de diferencias moleculares a nivel de ADN. El avance ha sido aún mayor a partir del hallazgo de la técnica PCR. Los marcadores elegidos para esta parte del proyecto han sido los RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) por su facilidad de obtención y abundancia. 2. Aplicación del sistema a lomos y jamones Para ello se ha dispuesto de muestras de carne y de productos elaborados de larga duración (jamones de 2 años de curación). El método de trabajo fue análogo al empleado para las muestras de sangre, previa liofilización y trituración de las muestras de músculo. 3. Diferenciación de líneas de Ibérico Para la consecución de este tercer objetivo se han empleado, además de los marcadores RAPD, otros dos tipos de marcadores: RDA y AFLP RDA (Representational Difference Analysis) 2

3 El objetivo de esta parte del proyecto era la obtención de marcadores específicos de raza mediante la técnica RDA, que permite detectar diferencias específicas entre genomas de dos individuos (Lisitsyn et el., 1993; Myers, 1993). El objetivo de la técnica es buscar RFLPs entre el ADN de dos individuos, mediante ciclos sucesivos de hibridación selectiva y amplificación. Con el fin de facilitar la puesta apunto de la técnica se escogieron en una primera fase dos razas de cerdos muy alejadas: Landrace e Ibérico. Como método de constatar la eficacia de la técnica se emplearon muestras de ADN tanto de machos como de hembras. Si el método funcionaba deberíamos obtener fragmentos específicos del Cromosoma Y Marcadores AFLP Este tipo de marcadores son fragmentos de restricción obtenidos mediante digestión del ADN genómico y posterior amplificación PCR. Debido a sus especiales cualidades pueden resultar muy útiles para la caracterización de poblaciones. En este proyecto se han empleado para caracterizar 2 poblaciones de cerdos Ibéricos tradicionales del tipo Negro Lampiño: Guadyerbas y Coronado. El número total de animales utilizados ha sido de catorce, de los cuales diez correspondían a la primera de las estirpes (5 machos y 5 hembras) mientras que de la segunda se emplearon 4 machos. Los productos de amplificación se analizaron mediante geles de poliacrilamida desnaturalizados, visualizando posteriormente por autorradiografía los patrones AFLP. Las similaridades genéticas entre líneas se analizaron mediante el programa NTSYS-PC Versión 1.8, para lo cual los fragmentos polimórficos fueron identificados con la clave 1 para presencia y 0 para ausencia. Para el cálculo de las matrices de similaridad se usó el coeficiente de Jaccard: donde: S = N XY / (N XY +N X +N Y ) N XY : es el número de fragmentos de ADN comunes a los individuos comparados (X e Y). N X y N Y : es el número total de fragmentos existentes en los individuos X e Y respectivamente. Las matrices así definidas son analizadas mediante el método UPGMA y los resultados usados para la construcción de dendogramas. A fin de constatar la utilidad de los AFLP para la construcción de dendogramas se calculó otro, para los individuos de la estirpe Guadyerbas, utilizando la matriz de coeficientes de parentesco. Para la estirpe Coronado no fue posible esto por carecer de genealogía controlada. La similitud entre los dendogramas construidos a partir de los 2 tipos de información nos permitirá constatar la validez de estos marcadores para estudiar las relaciones filogenéticas. RESULTADOS Marcadores Ibérico Duroc A lo largo de los tres años de duración del proyecto se han identificado los siguientes marcadores específicos: ƒ7 marcadores del genomio Ibérico. Estos marcadores, presentes en animales Ibéricos, no han sido detectados en ninguna de las otras razas analizadas (Duroc, Landrace, L. White). La frecuencia de aparición de estos marcadores específicos del genomio Ibérico está siendo analizada en la actualidad. 3

4 ƒ6 marcadores del Cromosoma Y Se han detectado 6 marcadores de cromosoma sexual masculino, que son específicos de genomio porcino pues no han podido ser detectados en el genomio de las otras especies analizadas: Vacuno, Ovino, Ratón y Humano. ƒ9 marcadores del genomio Duroc, presentes en las poblaciones muestreadas. Estos marcadores se encuentran a frecuencias muy variables, comprendidas entre el 13 y el 93%, siendo los tamaños de los fragmentos de amplficación de 500 a 1700 pb. Uno de los marcadores ha resultado ser específico de una de las líneas Duroc. Estos marcadores no aparecen en las otras razas de cerdos disponibles (Landrace y Large White). Este conjunto de marcadores específicos permite la discriminación de muestras procedentes de animales puros y cruzados hasta el 75%, siendo la probabilidad de error despreciable. Sin embargo la detección de marcadores diagnóstico no se da por totalmente finalizada, ya que la discriminación de muestras individuales de genotipos con menor proporción de genes Duroc, de gran interés para proteger el Libro Genealógico de la Raza, requiere disponer de un mayor número de marcadores. Los resultados se han verificado con las muestras disponibles de animales cruzados Ib x D. Se ha comprobado asimismo su aplicación a muestras de jamones de dos años de curación. Comparación de líneas de Ibérico La comparación molecular de líneas de Ibérico, mediante AFLP y RAPD, ha permitido detectar: Marcadores RAPD 5 específicos de la línea Coronado (y por tanto ausentes en Guadyerbas) 2 específicos de Guadyerbas (ausentes en Coronado Sin embargo solamente 3 de los 5 marcadores de Coronado y uno de los 2 de la línea Guadyerbas, están ausentes de las otras líneas de cerdo Ibérico que se han analizado. Marcadores AFLP El análisis mediante las 12 combinaciones analizadas produjo aproximadamente 1733 bandas, lo que representa una media de 140 bandas por combinación. Sólo un 6% del total de bandas encontradas resultó ser polimórfico. De estas bandas 26 se encontraban presentes en todos los individuos de una de las líneas y ausentes en los individuos de la otra línea. Hemos encontrado 12 marcadores específicos de la estirpe Coronado y 14 de la estirpe Guadyerbas, así como 8 marcadores específicos del cromosoma Y. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES El ADN utilizado procedía de muestras de sangre obtenidas a partir de animales de origen conocido. El ADN genómico se extrajo a partir de muestras de 2 ml. De sangre,usando precicipatión con fenol-cloroformo y etanol. El precipitado se resuspendió en buffer TE ph 7.4 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA). La composición del banco de ADN disponible aparece en la siguiente Tabla: Raza Nº. Líneas/Ganaderías Nº. De Animales 4

5 Ibérico Duroc 8 82 Ibérico x Duroc 1 13 Landrace 1 76 Large White 1 6 TOTAL Marcadores RAPD Para la detección de este tipo de marcadores se han empleado 295 oligonucleótidos de 10 pares de bases, correspondientes a los kits A, B, C, E, F, H, N, R, T, W, X, Y, Z, AA y AB ( Operon Technologies Inc). En primer lugar se realizó un bulked analysis, para lo cual se mezclaron cantidades iguales de ADN genómico. El nº de animales empleado para las mezclas estuvo en función de las disponibilidades de ADN de cada línea/raza, con un máximo de diez. Como testigo del genomio Ibérico se utilizó una muestra de ADN de animales de l estirpe Torbiscal. Una vez detectado un posible marcador de línea se hizo análisis individual con las muestras disponibles. Las condiciones experimentales utilizadas en la PCR se indican en las dos Tablas siguientes: Volumen de Reacción: 25 µl; Tampón PCR 1x Cebador DNTPs Cl 2 Mg ADN Taq 0.2 µl 0.2 mm 2.0 mm 15 ng 1.0 U Programa (Termociclador Perkin - Elmer 2400) Temperatura 94º C 42º C 72º C 5 Ciclos 1 min. 1 min. 2 min. 35 Ciclos 30 seg. 30 seg. 75 seg. Extensión Final min. Aplicación del sistema a lomos y jamones. Se ha dispuesto de muestras de carne y de productos elaborados de larga duración (jamones de 2 años de curación). El método de extracción fue análogo al empleado para la sangre, previa liofilización y trituración de las muestras de músculo. Diferenciación de líneas de Ibérico. Para la consecución de este tercer objetivo se han empleado, además de los marcadores RAPD, otros dos tipos de marcadores: RDA y AFLP. RDA (Representational Difference Analysis) El objetivo era la obtención de marcadores específicos de raza mediante la técnica RDA, que permite detectar diferencias específicas entre genomas de dos individuos (Lisitsyn et el., 1993; Myers, 1993). El objetivo de la técnica es buscar RFLPs entre el ADN de dos individuos, mediante ciclos sucesivos de hibridación selectiva y amplificación. Con el fin de facilitar la puesta apunto de la técnica se escogieron en una primera fase dos razas de cerdos muy alejadas: Landrace e Ibérico empleandose muestras de ADN tanto de machos como de hembras. Si el método funcionaba deberíamos obtener fragmentos específicos del Cromosoma Y. 5

6 El protocolo experimental utilizado fue el descrito por Lisitsyn y col. (1993), utilizando oligonucleótidos BamHI y tres ciclos PCR de amplificación PCR e hibridación selectivas. Los productos PCR RDA se digirieron con BamHI, previamente defosforilada para evitar las insercciones múltiples y ligada al plásmido puc18 cortado con BamHI. EL sistema de marcaje utilizado fue no-radiactivo (Amersham; Fluorescein Gene Images:RPN 3510). El ADN se fijó a una membrana de nylon durante 2 horas a 80ºC, realizandose las hibridaciones a 65ºC. Como se ha indicado este método consiste en la búsqueda de secuencias de ADN distintas entre dos genomas de partida, denominados generalmente "Tester" y "Driver" y requiere las siguientes fases: a) Preparación de amplicones: El primer paso es la preparación de representaciones de los dos genomas a analizar para reducir su complejidad. Para ello las dos muestras de ADN se digieren con un enzima de restricción y a continuación se ligan unos adaptadores específicos de secuencia conocida que permiten la amplificación por PCR (de este modo trabajamos con una porción del genoma consistente en los fragmentos de ADN de tamaño amplificable por PCR). b) Hibridación sustractiva: Esta segunda fase de la técnica consiste en varios ciclos con los pasos siguientes: b.1.-desnaturalización de las muestras b.2.-hibridación competitiva entre una mínima cantidad de ADN Tester y una cantidad considerable de ADN Driver, de modo que aseguramos que las secuencias que sean comunes a los dos genomas formen híbridos tipo Tester-Driver o Driver-Driver. b.3.-amplificación por PCR utilizando como cebadores secuencias complementarias a los adaptadores del ADN Tester. De este modo, en los ciclos sucesivos se produce un enriquecimiento gradual de las secuencias que están presentes en el ADN Tester (híbridos tipo Tester-Tester), pero no en el Driver, que serán por lo tanto las secuencias específicas de ADN Tester que diferencian ambos genomas. Marcadores AFLP Estos marcadores son fragmentos de restricción obtenidos mediante digestión del ADN genómico y posterior amplificación PCR. Por sus cualidades pueden resultar muy útiles para la caracterización de poblaciones. En este proyecto se han empleado para caracterizar 2 poblaciones de cerdos Ibéricos tradicionales del tipo Negro Lampiño: Guadyerbas y Coronado. El número total de animales utilizados ha sido de catorce, de los cuales diez correspondían a la primera de las estirpes (5 machos y 5 hembras) mientras que de la segunda se emplearon 4 machos. Para esta técnica se ha empleado el protocolo descrita por Vo y col (1995), aunque con ligeras modificaciones. La amplificación de los fragmentos de ADN tuvo lugar en dos etapas. Primero se realizó una preamplificación, con las combinaciones de primers siguientes: EcoRI+A/MseI+C, EcoRI+A/MseI+G, EcoRI+A/MseI+T, EcoRI+C/MseI+C y EcoRI+C/MseI+T. Las condiciones PCR se describen en las Tablas siguientes: Volumen de Reacción: 20 µl; Tampón PCR 1x Primer EcoRI Primer MseI DNTPs Cl 2 Mg ADN diluido Taq 30 ng. 30 ng. 4 mm 2.0 mm 3 µl 0.4 U Programa (Termociclador Perkin Elmer 9600) Temperatura 94º C 60º C 72º C 28 Ciclos 30 seg. 60 seg. 60 seg. 6

7 La segunda etapa es la amplificación selectiva y se realiza con un primer de la misma secuencia que los usados en la preamplificación, pero que contienen tres nucleótidos selectivos en la posición 3. Las condiciones en esta segunda etapa fueron: Volumen de Reacción: 20 µl; Tampón PCR 1x Primer EcoRI * Primer MseI dntps Productos de la preamplificación ( diluidos) 5 ng. 30 ng. 2 mm 5 µl *Marcado radiactivamente con [ γ 33 P]ATP Programa(Termociclador Perkin Elmer 9600) Temperatura 94º C 65º C 72º C 1 ciclo 30 seg. 30 seg. 60 seg. 12 ciclos En ellos la Tª de annealing baja 0.7ªC por ciclo 23 Ciclos 60 seg. 30 seg #. 60 seg. # La temperatura en esta fase fue de 56º C. Los productos de amplificación se analizaron mediante geles de poliacrilamida desnaturalizados, visualizando posteriormente por autorradiografía los patrones AFLP. Las similaridades genéticas entre líneas se analizaron mediante el programa NTSYS-PC Versión 1.8, para lo cual los fragmentos polimórficos fueron identificados con la clave 1 para presencia y 0 para ausencia. Para el cálculo de las matrices de similaridad se usó el coeficiente de Jaccard: S = N XY / (N XY +N X +N Y ) N XY es el número de fragmentos de ADN comunes a los individuos comparados (X e Y) N X y N Y es el número total de fragmentos existentes en los individuos X e Y respectivamente. Las matrices así definidas son analizadas mediante el método UPGMA y los resultados usados para la construcción de dendogramas. A fin de constatar la utilidad de los AFLP para la construcción de dendogramas se calculó otro, para los individuos de la estirpe Guadyerbas, utilizando la matriz de coeficientes de parentesco. Para la estirpe Coronado no fue posible esto por carecer de genealogía controlada. PUBLICACIONES Artículos científicos Castellanos, C., Rodríguez, C Identificación de líneas de cerdo Ibérico mediante marcadores RAPD. ITEA, Extra.16.I Castellanos, C., Barragán, C., Rodríguez, M.C Detection of four porcine Y - specific markers by RAPD. Animal Genetics, Ovilo, C., Rodríguez, C Caracterización molecular en poblaciones porcinas de las razas Landrace e Ibérica mediante marcadores RAPD. ITEA, 92 A pp. 7

8 Castellanos, C., Barragán, C., Rodríguez, M.C Utilización de RAPD para la detección de marcadores del cromosoma Y en cerdos. ITEA, 92 A pp. Castellanos, C., Ovilo, C., Silió, L Caracterización de dos líneas de cerdo ibérico negro lampiño mediante marcadores PCR RAPD. ITEA, Extra.18I Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Ovilo, C., Castellanos, C., Rodriguez, C., Silió, L. Differentiation of Iberian pig genotypes using RAPD and AFLP markers. Pig Breeders RoundTable. Wye, Kent (Gran Bretaña). Abril, Castellanos, C., Barragán, C., Rodriguez, M.C. Toro, M., Silió, L. Identification of Duroc and Iberian pigs using RAPD as diagnostic markers. 48 th Annual Meeting of teh EAAP. Viena (Austria). Agosto,