RepublicofEcuador EDICTOFGOVERNMENT±

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1 RepublicofEcuador EDICTOFGOVERNMENT± Inordertopromotepubliceducationandpublicsafety,equaljusticeforal, abeterinformedcitizenry,theruleoflaw,worldtradeandworldpeace, thislegaldocumentisherebymadeavailableonanoncommercialbasis,asit istherightofalhumanstoknowandspeakthelawsthatgovernthem. NTE INEN 0019 (1973) (Spanish): Leche pasteurizada. Ensayo de la fosfatasa

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3 CDU: AL Norma Técnica Ecuatoriana LECHE PASTEURIZADA ENSAYO DE LA FOSFATASA INEN OBJETO Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Casilla Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro Quito-Ecuador Prohibida la reproducción 1.1 Esta norma tiene por objeto establecer el método rápido de Scharer para el ensayo de la fosfatasa, usado para verificar la eficiencia del proceso de pasteurización o para comprobar la contaminación de la leche pasteurizada con leche fresca, (ver nota 1). 2. TERMINOLOGIA 2.1 Fosfatasa. Es una enzima que, en estado activo, libera fenol de los esteres fenil-fosfóricos; está presente principalmente en la leche fresca y es desactivada fácilmente con el calor. 2.2 Unidad de fosfatasa. Es una medida indirecta de la cantidad de fosfatasa activa presente en la leche o en los productos lácteos, y corresponde a 1 mg de fenol liberado por 1000 cm 3 de leche o producto lácteo. 3. DISPOSICIONES GENERALES 3.1 Deberán cumplirse las disposiciones generales indicadas en la norma INEN Las muestras deberán ensayarse tan pronto como lleguen al laboratorio; caso contrario deberán mantenerse a una temperatura comprendida entre 3º y 5ºC y ensayarse antes de las 24 h. 3.3 El material de vidrio y los tapones que se usen para este ensayo deberán estar completamente limpios, no deberán usarse para otras finalidades y deberán mantenerse separados del resto del instrumental del laboratorio. 3.4 Deberá usarse una pipeta limpia y estéril para cada muestra, teniendo precaución de no contaminar las pipetas con saliva. Nota 1. La fosfatasa siempre está presente en la leche fresca y es inactivada mediante el proceso de pasteurización. (Continúa) -1-

4 3.5 El ensayo deberá realizarse de tal manera que no incida la luz solar directa sobre la muestra o sobre los reactivos. 3.6 Para cada muestra analizada deberá realizarse un control positivo y un control negativo, con el fin de verificar el buen estado y funcionamiento de los reactivos. 4. FUNDAMENTO 4.1 El método se basa en la acción que ejerce la fosfatasa sobre el fosfato fenil disódico, liberando fenol que se detecta haciéndolo reaccionar con 2,6-dicloroquinona- cloroimida (CQC) para formar indofenol que produce color azul en medio básico. 4.2 La cantidad de enzima activa se mide en unidades de fosfatasa, comparando la coloración de la muestra ensayada con soluciones coloreadas estandarizadas. 4.3 Las principales reacciones que ocurren en el ensayo son las siguientes; 5. INSTRUMENTAL 5.1 Tubos de ensayo, estériles con tapón de goma (completamente libre de fenol), y calibrados a 5, 5,5 y 8,5 cm 3 hasta la parte superior del menisco. 5.2 Pipetas de 5 cm 3, graduadas con divisiones de 0,1 cm Pipetas aforadas de 0,5 cm Baño de agua, con regulador de temperatura, ajustado a 40º ± 1ºC. -2-

5 5.5 Frasco gotero, de vidrio color ámbar, calibrado para proporcionar aproximadamente 50 gotas por cada cm 3 de reactivo CQC (ver 6.11). 5.6 Termómetro, graduado hasta no menos de 100ºC. 5.7 Centrifuga, para operar a 3000 r/min. 6. REACTIVOS 6.1 Sesquicarbonato de sodio, (NaHCO 3.Na 2 CO 3.2H 2 O), reactivo para análisis. 6.2 Sulfato cúprico, (CuSO 4.5H 2 O), reactivo para análisis. 6.3 Solución 0,1 N de ácido clorhídrico, debidamente estandarizada. 6.4 Alcohol metílico, o alcohol etílico, reactivo para análisis. 6.5 Alcohol n-butílico neutralizado, con punto de ebullición comprendido entre 116º y 118ºC, (ver A.1). 6.6 Fenol anhidro, reactivo para análisis. 6.7 Fosfato fenil disódico, exento de fenol (ver A.2.1); debe guardarse en refrigerador ,6 - Dicloro-quinona-cloroimida, (CQC), cristalina, especial para trabajos con fosfatasa. 6.9 Solución tampón. Disolver 100 g de sesquicarbonato de sodio en agua destilada y diluir hasta un volumen de 1000 cm Sustrato tampón. Disolver 0.5 g de fosfato fenil disódico en 25 cm 3 de solución tampón y completar el volumen a 500 cm 3 con agua destilada. Guardar la solución, protegida de la luz, en refrigerador, y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación, (ver A.2.2). -3-

6 6.11 Reactivo CQC. Disolver 30 mg de 2,6 - dicloroquinona-cloroimida en 10 cm 3 de alcohol metílico o etílico. Transferir parte de la solución a un frasco gotero (ver 5.5) y el resto a un frasco ámbar con tapón de vidrio. Guardar la solución en refrigerador y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación. Si antes de los 7 días aparece un color pardo, se la desecha Catalizador. Disolver 200 mg de sulfato cúprico en 100 cm 3 de agua destilada Solución patrón de fenol, de 1 mg/cm 3. Pesar, con aproximación al 0,1 mg, exactamente un gramo de fenol anhidro; transferirlo a un matraz aforado de 1000 cm 3, completar el volumen con solución 0,1 N de ácido clorhídrico y disolverlo. La solución es estable durante varios meses en refrigerador Solución A de fenol. Diluir 10 cm 3, exactamente medidos, de solución patrón de fenol hasta un volumen de 1000 cm 3 con agua destilada. Cada cm 3 de esta solución contiene 10 µg de fenol. Guardar la solución en refrigerador y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación Solución B de fenol. Debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Diluir 10 cm 3, exactamente medidos, de solución A de fenol hasta un volumen de 50 cm 3 con agua destilada. Cada cm 3 de esta solución contiene 2 µg de fenol Soluciones testigo. Preparar tres soluciones testigo correspondientes a 1, 2 y 5 unidades de fosfatasa (ver 2.2) de la manera siguiente: Agregar a tres tubos de ensayo (ver 5.1) las cantidades de solución B de fenol, agua destilada y solución tampón, que se indican en la tabla 1. TABLA 1. Composición de las soluciones testigo Solución B de Agua destilada Solución fenol (cm 3 ) (cm 3 ) tampón (cm 3 ) -4-

7 Agregar a cada tubo, dos gotas de catalizador y seis gotas de reactivo CQC, mezclar inmediatamente y calentar durante 5 minutos a 40 ± 1 C, en baño de agua Extraer el azul indofenol, desarrollado en cada tubo, con 3 cm 3 de alcohol n-butílico neutralizado y dejar la mezcla en reposo hasta que se separen completamente las dos fases De cada tubo extraer, con una pipeta, una porción medida del extracto alcohólico, transferir a otro tubo de ensayo y diluir con un volumen igual de alcohol n-butílico neutralizado Leche fresca, sin pasteurizar y almacenada durante un tiempo no mayor de 48 h. 7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 7.1 Muestra para ensayo. Homogeneizar la muestra mediante agitación. Si la muestra ha sido enfriada previamente (ver 3.2) llevarla a temperatura ambiente y agitarla. En ningún instante la temperatura de la muestra debe exceder de 20 C. 7.2 Muestra para control negativo. Transferir aproximadamente 5 cm 3 de muestra a un tubo de ensayo y calentar a 85 C durante un tiempo no menor de 1 minuto, introduciendo el tubo en agua caliente y controlando la temperatura con un termómetro (el tiempo de calentamiento se registra desde que la temperatura de la muestra alcanza los 85 C); finalmente, agitar la muestra para asegurar la inactivación completa de la fosfatasa. 7.3 Muestra para control positivo. Agregar 0,1 cm 3 de leche fresca (ver 6.17) a 100 cm 3 de muestra para ensayo (previamente hervida durante 1 min y enfriada a la temperatura ambiente). 8. PROCEDIMIENTO 8.1 Debe efectuarse un ensayo sobre cada una de las tres muestras preparadas de acuerdo con el capítulo Usando una pipeta limpia, transferir 0,5 cm 3 de muestra para ensayo al tubo de ensayo respectivo. Repetir la operación, usando cada vez una pipeta limpia, con las muestras para control negativo y positivo. -5-

8 8.3 Agregar, a cada tubo. 5,0 cm 3 de substrato tampón y, luego de mezclar el contenido de cada tubo, verificar el ph y ajustarlo a 9,5-10,0 con la solución tampón, en caso de ser necesario. 8.4 Tapar los tubos e invertirlos varias veces para que la mezcla sea completa. 8.5 Colocar los tubos en el baño de agua a 40 ± 1 C e incubarlos durante 15 min. 8.6 Retirar los tubos del baño de agua y agregar, a cada uno, seis gotas de reactivo CQC y dos gotas de catalizador. Taparlos, invertirlos varias veces para mezclar su contenido e incubarlos nuevamente a 40 ± 1 C durante 5 min. 8.7 Retirar los tubos del baño de agua, enfriarlos en corriente de agua y agregar, a cada uno, 3 cm 3 de alcohol n-butílico neutralizado. Taparlos,invertirlos cuatro o cinco veces (con intervalos de un segundo entre cada inversión) para mezclar su contenido y extraer el azul de indofenol, y colocarlos horizontalmente sobre una superficie plana durante 2 min para permitir la separación del alcohol butílico. A continuación repetir, una vez más, las operaciones de agitación y separación. 8.8 Si se forma una emulsión y no se consigue una capa alcohólica clara y transparente, enfriar los tubos sumergiéndolos en agua con hielo durante 5 min y centrifugarlos a 3000 r/min durante 5 min, 8.9 Colocar los tubos en posición vertical y comparar los colores de las capas de alcohol butílico con tos colores de las soluciones testigo. La comparación debe hacerse contra una luz blanca uniforme La capa de alcohol butílico correspondiente a la muestra para control negativo no debe presentar ninguna coloración; caso contrario debe repetirse la determinación después de verificar el buen estado de los reactivos (ver nota 2) y la correcta preparación de la muestra para control negativo La capa de alcohol butílico correspondiente a la muestra para control positivo debe presentar un color azul de mayor intensidad que el correspondiente a la solución testigo con 1 unidad de fosfatasa; caso contrario debe repetirse la determinación después de verificar el buen estado de los reactivos y la correcta preparación de la muestra para control positivo. NOTA 2. Cualquier color que se desarrolle en el ensayo sobre una muestra para control negativo, no puede deberse a la presencia de fosfatasa residual, sino mas bien, a contaminación de los reactivos. -6-

9 8.12 La capa del alcohol butílico correspondiente a la muestra para ensayo, no debe presentar coloración o debe presentar un color azul de menor intensidad que el correspondiente a la solución testigo con 1 unidad de fosfatasa; caso contrario debe compararse la coloración con las dos soluciones testigo restantes. 9. INFORME DE RESULTADOS 9.1 Dependiendo de la coloración de la capa de alcohol butílico correspondiente a la muestra para ensayo, debe reportarse el resultado como: cero unidades de fosfatasa, si es incolora; menos de 1 unidad de fosfatasa, si presenta un color azul de menor o igual intensidad que el correspondiente a la solución testigo de 1 unidad, y más de 1 unidad de fosfatasa, si presenta un color azul de mayor intensidad que el correspondiente a la solución testigo de 1 unidad. En este último caso puede indicarse, en forma aproximada, el número de unidades de fosfatasa que se aprecia al comparar con las otras soluciones testigo. 9.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado. 9.3 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra. -7-

10 ANEXO A ACONDICIONAMIENTO DE LOS REACTIVOS A.1 Neutralización del alcohol n-butílico. A.1.1 Para determinar el grado de acidez del alcohol n-butílico, mezclar, en un tubo de ensayo, un volumen de alcohol con un volumen igual de agua destilada; añadir unas gotas de indicador azul de bromotimol, tapar el tubo, agitar su contenido y dejar separar las fases. Si el alcohol está neutro, la capa acuosa deberá presentar, una coloración verde o ligeramente azul: si está ácido, la coloración será amarilla. A.1.2 Para neutralizar el alcohol n-butílico, agregarle una solución 0,1 N de hidróxido de sodio hasta que al ensayar una pequeña porción con indicador azul de bromotimol, aplicando el procedimiento descrito en A.1.1 se obtenga una coloración verde o ligeramente azul. A.2 Purificación del fosfato fenil disódico A.2.1 Determinación de la presencia de fenol. Disolver 100 mg de fosfato de fenil disódico en 5 cm 3 de solución tampón (ver 6.9), agregar una gota de reactivo CQC (ver 6.5), agitar muy bien la solución y dejarla en reposo durante 10 min. La presencia de coloración azul indica la contaminación con fenol del fosfato fenil disódico. A.2.2 Preparación del substrato tampón. Si el fosfato fenil disódico está contaminado con fenol, el substrato tampón debe prepararse de la manera siguiente: Disolver 0,5 g de fosfato fenil disódico en 25 cm 3 de solución tampón; transferir la solución a un tubo de separación y agregar dos gotas de reactivo CQC; agitar muy bien la solución y dejarla en reposo durante 10 min para que se desarrolle completamente el color; agregar 10 cm 3 de alcohol n-butílico neutralizado y agitar la mezcla enérgicamente para extraer el azul de indofenol; dejar la mezcla en reposo hasta que la fase alcohólica se separe completamente y eliminar la capa alcohólica, diluir la capa acuosa restante, libre ya de fenol, con agua destilada hasta 500 cm 3, y verificar el ph que debe estar comprendido entre 10 y 10,5; guardar la solución protegida de la luz, en refrigerador y usarla únicamente dentro de los 7 días siguientes a su preparación. -8-

11 APENDICE Z Z.1 NORMAS A CONSULTAR INEN 17 Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales. Z.2 NORMAS PUBLICADAS SOBRE EL TEMA INEN 3 Leche y productos lácteos. Definiciones. INEN 4 Leche y productos lácteos. Muestreo. INEN 9 Leche fresca. Requisitos. INEN 10 Leche pausterizada. Requisitos. INEN 11 Leche. Determinación de la densidad relativa. INEN 12 Leche. Determinación del contenido de grasa. INEN 13 Leche. Determinación de la acidez titulable. INEN 14 Leche. Determinación de sólidos totales y cenizas. INEN 15 Leche. Determinación del punto de congelación. INEN 16 Leche. Determinación de proteínas. INEN 17 Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales. INEN 18 Leche. Ensayo de reductasas. INEN 19 Leche pasteurizadas. Ensayo de fosfatasa. INEN 20 Leche. Determinación de bacterias activas. INEN 21 Leche pasteurizada. Contaje de bacterias coliformes. INEN 91 Leche. Determinación del indice refractométrico. Z.3 BASES DE ESTUDIO Propuesta de Norma Centroamericana ICAITI h13. Leche y productos lácteos. Determinación de la fosfatasa. Método rápido de Scharer. Instituto Centroamericano de Investigación y Tecnología Industrial, Guatemala, 1970, -9-

12 NTE INEN 19 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

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