UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA ESCUELA DE QUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS INSTRUMENTAL ANALITICO GUIA DE CROMATOGRAFÍA

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1 UNIVESIDD CENTL DE VENEZUEL ESCUEL DE QUIMIC FCULTD DE CIENCIS INSTUMENTL NLITICO GUI DE COMTOGFÍ Caracas 2008

2 Tabla de Coteido DEFINICIONES IMPOTNTES...3 Cromatografía...3 Clasificació de los Métodos Cromatograficos:...3 Cromatograma:...3 Tiempo de eteció...4 Tiempo Muerto...4 ECUCIONES BSICS EN COMTOGFÍ...4 Costate de Distribució...4 Factor de Capacidad...4 Factor de Selectividad...5 Eficiecia de ua Columa...5 esolució de ua Columa...7 PLICCIONES DE L COMTOGFÍ... 8 álisis Cualitativo...8 álisis Cuatitativo... 8 Calibració absoluta...9 Método del estádar itero...9 Normalizació de área...10 BIBLIOGFI ECOMENDD...11

3 DEFINICIONES IMPOTNTES Cromatografía La cromatografía es u método de separació de diferetes compoetes de ua muestra, este método logra la separació de los mismos a través del paso de ua muestra por ua fase estacioaria co la ayuda de la fase móvil, cada compoete de la muestra tiee propiedades particulares que permitirá su iteracció e forma diferete etre la fase estacioaria y móvil, de esta forma cada compoete se retrasa e forma particular y si el caudal, las característica de la fase estacioaria y móvil y la logitud de la columa so las adecuadas se lograra la separació completa de todos los compoetes de la muestra. El objetivo pricipal de u estudio cromatografía es lograr la separació de todos los compoetes e ua muestra, para ello es ecesario jugar co ua serie de factores cromatograficos, es por ello que es ecesario coocer como está relacioados los diferetes factores experimetales co las ecuacioes cromatograficas. Clasificació de los Métodos Cromatograficos: Segú como se coloque e cotacto la fase móvil y estacioaria: cromatografía e columa y cromatografía plaa Segú el tipo de fase móvil utilizada: Cromatografía gaseosa y cromatografía Liquida y cromatografía de fluidos súper críticos Cromatograma: Es la represetació grafica de la señal e fució del tiempo ua vez que la muestra es iyectada a u sistema cromatografico. Para obteer este cromatograma a la salida de la columa se coloca u sistema de detecció y registro, que permite respoder a ua propiedad de la solució que cotiee el aalito o del propio aalito e fució del tiempo, figura 1.

4 Figura 1.- Cromatógrama de dos compoetes Tiempo de eteció El tiempo que trascurre después de la iyecció de la muestra para que el pico del aalito alcace el detector se deomia tiempo de reteció y se le da el símbolo t. (ver figura 1) Tiempo Muerto Es el tiempo t M para que la especie o reteida alcace el detector (ver figura 1) ECUCIONES BSICS EN COMTOGFÍ Costate de Distribució Los equilibrios de distribució implicados e cromatografía se describe por ecuacioes simples que supoe la trasferecia de u aalito etre las fases estacioaria y móvil. sí para ua especie móvil estacioaria La costate de este equilibrio K se deomia, costate de distribució y se defie como: CS K = ec. 1 CM dode C S es la cocetració molar de aalito e la fase estacioaria y C M es la cocetració molar de aalito e la fase móvil. Factor de Capacidad Es u parámetro (k ) que se utiliza para describir las velocidades de migració de los aalitos e las columas y se iterpreta cosiderado que mietras mayor sea el valor de este factor meor es la velocidad de migració de los solutos e la columa. Para ua especie, el factor de capacidad k se defie como: K VS k = ec. 2 V M

5 dode K es la costate de distribució, V S es el volume de la fase estacioaria y V M es el volume de la fase móvil. Tambié puede ser descrito e térmios experimetales los cuales puede ser tomados de u cromatograma: k ( t ) t M = ec. 3 tm dode (t ) es el tiempo de reteció del compoete y t M es el tiempo muerto obteido para ua especie o reteida. Factor de Selectividad El factor de capacidad α de ua columa, como su ombre lo idica, es u térmio que defie que ta selectiva es ua columa para separar dos picos. Es de hacer otar, que la columa puede ser selectiva a ua separació, que se idetifica por u valor alto de este factor, pero si o se cosidera la mejora de los parámetros que puede afectar el acho de u pico, au así o se lograría la separació de los mismos. Etoces el factor de selectividad de ua columa para dos especies y B se defie como: k B α = ec. 4 k dode k B es el factor de capacidad del compuesto B, que es el mas reteido y k es el factor de capacidad del compuesto, que es el meos reteido. Co esta defiició α siempre es mayor que la uidad. E térmios tomados a partir de u cromatograma α se puede calcular como sigue: ( t ) t B M ( t ) t M α = ec. 5 Eficiecia de ua Columa. Como se dijo aterior mete, si o se toma e cueta los factores que afecta el acho de u pico para la separació cromatografía o se podría lograr ua buea separació au cuado se tega u factor de selectividad alto para estos picos e ua columa particular. Es decir que mietras mayor es la capacidad de la columa de producir picos mas estrechos mayor es su eficiete. La achura de ua bada aumeta a medida que se mueve a través de la columa, debido a que cuato más tiempo trascurre mayor es la dispersió que puede teer lugar. Por ello la achura de la zoa está relacioada directamete co el tiempo de residecia e la columa, e iversamete co la velocidad a la que fluye la fase móvil.

6 Se utiliza dos térmios afies co frecuecia como medida cuatitativa de la eficacia de ua columa cromatográfica: (1) la altura equivalete de plato teórico o H y (2) el úmero de platos teóricos N. Los dos está relacioados por la ecuació: L N = ec. 6 H dode L es la logitud (ormalmete e cetímetros) del relleo de la columa. La eficacia de la columa cromatográfica aumeta cuado mayor es el úmero de platos, y cuado meor es la altura de plato. La evaluació experimetal de H y N se puede realizar a partir de las siguietes ecuacioes: 2 LW H = ec t dode L es la logitud de la columa, W es el acho del pico a cosiderar y t es su tiempo de reteció. 2 t N = 16 ec. 8 W Para teer ua mejor idea de cómo afecta las diferecias variables cromatográficas el acho de u pico, que a se vez, se traduce e la modificació de la eficacia de ua columa Va Deemter presetó la siguiete ecuació: H = + B / u + Cu ec. 9 E esta ecuació se evalúa varios térmios que puede cotribuir al esachamieto de ua bada los cuales se puede iterpretar como sigue: El termio, igual a 2 λd p y atribuido a la difusió e remolio, represeta el efecto de trayecto múltiple de la fase móvil a través de ua columa empacada. Icorpora la desidad λ del empaque y el promedio del diámetro de partícula, d P Para las columas capilares si relleo este térmio es cero. La difusió logitudial (B/u), es ua causa del esachamieto de bada por las que los aalitos difude desde la zoa más cocetrada del cetro de la bada hacia las regioes más diluidas por delate y por detrás del cetro de la bada, es decir, e el mismo setido y e el setido opuesto a la direcció del flujo. El termio B, 2 γdm, expresa la tortuosidad γ de los caales e la columa empacada y el coeficiete de difusió molecular del soluto e la fase movil El termio C esta dado por ( 8/ π )[ k /( 1+ k) ]( 2d f / D E ). efleja la resistecia a la trasferecia de masa etre la fase móvil y la estacioaria, y detro de la propia fase estacioaria, e dode k es el factor de capacidad, d f es el espesor de la película de la fase estacioaria y D E es el coeficiete de difusió del soluto e la fase estacioaria. La figura ilustra represetacioes gráficas, determiada experimetalmete, de EPT (H) e fució de la velocidad promedio, ū, para cromatografía de gases, cromatografía de fluidos supercriticos y la cromatografía liquida. Como se puede observar, hay ua diferecia sigificativa etre la cromatografía de gases y la cromatografía líquida, tato e el valor de H como e el itervalo óptimo de ū. Las separacioes de GC se hace a meudo cerca del puto optimo de H versus ū. Si embargo, las velocidades de flujo a las que se

7 alcaza el valor óptimo e LC so ta bajas que las separacioes de LC se hace ormalmete a u valor algo por ecima del puto óptimo Figura 2. HEPT versus velocidad promedio lieal Claramete, el valor de N es muy sesible a las codicioes de operació, y la comparació de la eficacia de u tipo de cromatografía co otra o icluso ua columa co otra, es por ello que se recomieda realizar u estudio mas serio del tema utilizado los libros que se recomieda e la bibliografía. esolució de ua Columa La resolució S de ua columa costituye ua medida cuatitativa de su capacidad para separar dos aalitos, e este térmio si se toma e cueta el esachamieto de los picos, así que la magitud de este valor si permite asegurar la separació de dos picos. [( t ) ( t ) ] B S = 2 ec. 10 W + WB dode W y WB so los achos de bada de las badas y B respectivamete. Estadísticamete se puede demostrar que ua resolució de 1,5 permite ua separació esecialmete completa de los dos compoetes, mietras que o es así co ua resolució de 0,75, por supuesto siempre y cuado las badas sea gausseaas, es decir simétricas e ambos lados. sí co ua resolució de 1,0; la zoa de cotiee aproximadamete 4% de B, y la zoa B cotiee ua catidad similar de. Co ua resolució de 1,5, el solapamieto es del orde de u 0,3% La resolució expresada e térmios teóricos se preseta a cotiuació: S = N 4 2 α 1+ k B α 1 k B ec. 11

8 PLICCIONES DE L COMTOGFÍ álisis Cualitativo U aálisis cromatográfico puede dar ua amplia iformació cualitativa si se escoge el sistema de detecció adecuado para determiar y evaluar los aalitos separados, así si se utiliza u detector que permita obteer u espectro de cada compuesto separado y a su vez cotega ua base de datos que pueda realizar su comparació co ua biblioteca de espectros se podría, de ua forma muy precisa, establecer la idetidad de los compoetes de ua muestra, de hecho esto se logra fácilmete co cromatógrafos que cotiee sistema de detecció como el Ifrarrojo (I), el de esoacia Magética Nuclear (MN) o el espectrómetro de Masas (MS). Si embargo, estos sistemas so muy costosos, es por ello que la mayoría de los laboratorios cueta co cromatografos co sistemas de detecció secillos como el detector de ioizació a la llama (siglas e igles, FID) o el detector de coductividad térmica (siglas e igles (TCD) e el caso de cromatografía de gases o detectores de absorbacia o ídice de refracció para los casos de cromatografía de líquidos. La úica iformació cualitativa que puede ofrecer estos sistemas es el tiempo de reteció del aalito, el cual, solo puede ser usada cotrolado bie las codicioes cromatográficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacioaria e el caso de gases o composició química de la fase móvil además de las otras variables mecioadas ateriormete para el caso de cromatografía de liquida, además de que se debe teer coocimieto de los posibles compuestos de la muestra y ua amplia variedad de patroes para realizar comparacioes. Si embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tega el mismo tiempo de reteció, lo que imposibilita su idetificació. Por supuesto que, a partir de cromatogramas obteidos co diferetes fases móviles (para cromatografía liquida) y estacioarias y a diversas temperaturas de elusió (para cromatografía gaseosa), se puede obteer datos adicioales. álisis Cuatitativo El uso de la cromatografía se ha extedido e todo el mudo, e las ultimas cuatro décadas, o solo por su capacidad de separar compuestos sio porque se puede realizar u aálisis cuatitativo de las especies proporcioadas. E la cromatografía e columa, el aálisis cuatitativo se basa e la comparació de la altura, o del área, del pico del aalito co la de uo o más patroes iyectados bajo las mismas codicioes cromatográficas. El uso de ua u otro termio depederá de las características de la bada obteida, auque e la actualidad co el uso de sistemas de itegració de área computarizados, la precisió es muy alta para el calculo de área, si embargo siempre es importate coocer las otras herramietas a utilizar para calcular el área de ua bada y e que mometo es mejor usar altura e vez de área por si llega a faltar el sistema computarizado. Para lograr u aálisis cuatitativo de los compoetes separados de ua muestra existe ua gra variedad de métodos de aálisis etre los que se puede mecioar: 1. Calibració absoluta

9 2. Método del estádar itero. 3. Normalizació de área (co y si factor de respuesta) Cada método tiee sus vetajas y desvetajas. Calibració absoluta Para realizar el cálculo de composició, se iyecta masas exactas del compoete puro al cromatógrafo y se determia el área. Se realiza u grafico relacioado el área de pico co la masa (figura 2), se obtedrá etoces ua curva de calibració que debe ser lieal y pasar por el orige. Figura 3.- Calibració absoluta La ecuació de esta curva vedrá dada etoces por = mw ec. 12 Etoces se iyecta ua masa exacta de la muestra (W ij ) y se determia el área del compoete a aalizar, por ejemplo el compoete, de la curva extrapolado la masa de por W = /m y después se aplica la siguiete ecuació: W % W = *100 ec. 13 W ij Las desvetajas de este método so que la iyecció de la muestra debe ser exacta y que las codicioes del sistema o debe cambiar de ua iyecció a la otra. Las iyeccioes exactas se logra mas co u sistema automatizado de iyecció o co el uso de válvulas de iyecció mauales co lazo de volúmees exactos como el caso de cromatografía liquida de alta resolució Método del estádar itero Este método es coocido como calibració relativa o idirecta. Para ello, relació de masas coocidas de u patró de la muestra y de u estádar deber ser preparadas e iyectadas al cromatógrafo para luego determiar las relacioes de área. Estas relacioes de áreas so graficadas e fució de la relacioes de masa, como se muestra e la figura 3.

10 Figura 4.- Calibració relativa. De esta curva se obtiee la ecuació lieal y = mx. Etoces se adicioa ua masa coocida del estádar itero a ua masa coocida de muestra y esta mezcla se iyecta al cromatógrafo. Del cromatógrama se obtiee las áreas de aalito y del estádar y luego co la ecuació de calibració y coociedo la masa del estádar se puede obteer la masa del aalito e la muestra. patró rea * Westadar W estadar aalito = ec. 14 m partir de esta masa se puede calcular el % de este compoete e la muestra como sigue W % W = aalito aalito *100 ec. 15 W muestra La vetaja de este método es que es idepediete del volume de iyecció de muestra lo que es sumamete importate para aquellas técicas cromatografías que utiliza u metodo de itroducció de muestra o automatizado como por ejemplo el uso de jerigas de iyecció e cromatografía gaseosa. equerimietos para u bue estádar itero: Debe ser resuelto de los otros picos Debe eluir cercao al pico de iterés Debe usarse ua cocetració similar al pico de pico de iterés.- Debe ser de las mismas características estructurales. Normalizació de área La ormalizació de área es u medio para establecer el porcetaje de cada compoete e la muestra. Se calcula dividiedo el área de cada compoete etre el área total y multiplicado por 100%, es decir: rea de % = *100 ec. 16 rea total Este térmio es idepediete del volume de iyecció de muestra y debe cumplirse que todos los picos debe estar separados. Si embargo, esta ecuació solo se puede aplicar

11 para ua serie homologa de compuestos de puto de ebullició muy parecidos y co similares respuestas del detector, algo mas acorde co la realidad es usar el factor de respuesta. Si embargo el factor de respuesta depede del tipo de detector utilizado el cálculo mas secillo se aplica para el factor de respuesta cuado se utiliza e cromatografía de gases u detector de ioizació a la llama y este es el que se explicara a cotiuació. Factor de espuesta (cálculos para el FID): Cada detector tiee su forma particular de respuesta para cada aalito, es por ello, que la composició de cada compoete e la muestra o se puede relacioar directamete a meos que se uifique la respuesta del detector para cada compoete. La respuesta de u detector de ioizació a la llama (FID) es idepediete de la temperatura, del flujo de gas de arrastre y de la velocidad de flujo. Esto hace más secillos los cálculos, ya que se puede realizar relacioes directas de peso de muestra, lo cual cotribuye a que este sea el detector ideal para el aálisis cuatitativo. El cálculo de factor de respuesta se realiza experimetalmete de la siguiete forma. Se pesa ua catidad exactamete coocida del patró del aalito a estudiar, se determia su área e el cromatógrafo y luego se realiza el cálculo, W ( F ) = ec. 17 sí sucesivamete para todos los compoetes e la muestra. Ua vez coocido el factor de respuesta de cada compoete e la muestra, se puede realizar el cálculo de ormalizació de área co factor de respuesta. % = * ( F ) ( F ) ec. 18 Es de hacer otar, que e alguos libros se utiliza el factor de correcció o la sesibilidad del detector para realizar estos cálculos, e ese caso observara las siguietes ecuacioes. ( F C ) = ec. 15 W y para área: % = / ( F ) /( F ) ec.19 Note que al fial las áreas corregidas será iguales, solo se ivierte los dividedos y productos. Eso si es sumamete importate que o mezcle las dos ecuacioes o se cofuda e los calculas, ya que los resultados será erróeos. BIBLIOGFI ECOMENDD 1.- álisis Istrumetal ubiso y ubiso 2001 Editorial Pretice Hall 2.- álisis Químico Cuatitativo Daiel Harris 3era edició 2007 Editorial everté 3.- Pricipios de álisis Istrumetal Skoog Holler Niema

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