Estequiometría del crecimiento y formación de producto

Transcripción

1 Estequiometría del crecimiento y formación de producto Para un balance de materia con reacción, se debe conocer la estequiometría de la reacción. Cuando existe crecimiento celular, las células son el producto de reacción y deben, por tanto, estar representadas en la ecuación de reacción. Ahora se mostrará cómo se formulan las ecuaciones de la reacción de crecimiento y de síntesis del producto. La estequiometría metabólica posee muchas aplicaciones en bioprocesos: al igual que en los balances de materia y energía, puede utilizarse para comparar rendimientos de producto teóricos y experimentales, comprobar la consistencia de los datos de fermentación experimentales y formular medios de nutrición. Estequiometría del crecimiento y balances elementales A pesar de su complejidad y de que existen miles de reacciones intracelulares, el crecimiento de las células obedece a la ley de conservación de la materia. Todos los átomos de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y otros elementos consumidos durante el crecimiento se incorporan a las nuevas células o se expulsan como productos. Centrando nuestra atención en aquellos compuestos consumidos o producidos en cantidades significativas, si los únicos productos extracelulares formados son CO 2 y H 2 0, el crecimiento aerobio de las células puede describirse mediante la siguiente ecuación: (1) En la ecuación (1), es la fórmula química que representa el sustrato (por ejemplo, para la glucosa, w = 6, x = 12, y = 6 y z = 0). es la fórmula química de la fuente de nitrógeno y CH O N es la «fórmula» química de la biomasa seca, a, b, c, d y e son los coeficientes estequiométricos. La ecuación (1) se escribe tomando como referencia un mol de sustrato, de manera que se consumen a moles de O 2 y se forman dmoles de CO 2 por cada mol de sustrato consumido, etc. Como se muestra en la Figura 1, la ecuación representa un punto de vista macroscópico del metabolismo ya que ignora la estructura detallada del sistema y considera únicamente aquellos componentes que presentan un intercambio neto con el ambiente que les rodea. A pesar de su simplicidad, la aproximación macroscópica resulta ser una herramienta muy útil en el análisis termodinámico. La ecuación (1) no incluye gran cantidad de compuestos

2 como el ATP y el ADNH que integran el metabolismo y que sufren cambios cíclicos en las células, pero que no sufren cambios netos con el ambiente. Podrían también incluirse compuestos tales como las vitaminas y minerales tomados durante el metabolismo, aunque estos factores de crecimiento se consumen generalmente en tan pequeñas cantidades que su contribución a la estequiometría y a la energía de la reacción es despreciable. Figura 1: Conversión del sustrato, oxígeno y nitrógeno para el crecimiento celular. Ecuaciones de balance. En la ecuación (1), la biomasa se representa por la fórmula CH O N. No existe objeción alguna a que exista una fórmula molecular para describir las células, aunque ésta no se aplique normalmente en biología. La fórmula muestra simplemente la composición de la biomasa. Los microorganismos como la Escherichia coli contienen una gran variedad de elementos aunque el 90-95% de la biomasa está constituida por cuatro elementos mayoritarios: C, H, O y N. Las fórmulas de biomasa seca, tienen como base de referencia un átomo de C; la cantidad total de biomasa formada durante el crecimiento puede calcularse mediante el coeficiente estequiométrico c de la ecuación (1). Las bacterias tienden a tener contenidos de nitrógeno ligeramente mayores (11-14%) que los hongos ( %). Para determinadas especies, la composición celular depende también de las condiciones de cultivo y del sustrato utilizado: de ahí que se encuentran diferentes fórmulas para un mismo organismo. Sin embargo, cabe destacar que los resultados son muy similares para células y condiciones muy diferentes. Por ello, cuando no se dispone de la composición puede utilizarse como fórmula general CH 1.8 O 0.5 N 0.2,. El «peso molecular» medio de la biomasa basado en los contenidos de C, H, O y N es por lo tanto 24.6, aunque existe normalmente un 5-10% de ceniza residual que no se incluye en la fórmula. C w H x O y N z + a0 2 + bh g O h N i cch O N + dco 2 + eh 2 O (1)

3 La ecuación (1) no es completa a menos que se conozcan los coeficientes estequiométricos a, b, c, d y e. Una vez obtenida la fórmula de la biomasa, estos coeficientes pueden calcularse mediante los procedimientos normales de las ecuaciones de balances; es decir, mediante balances elementales y resolución simultánea de ecuaciones. Balance de C:w = c + d(2) Balance de H:x + bg = c + 2e(3) Balance de O:y+ 2a + bh = c +2d+e(4) Balance de N:z + bi = c (5) Obsérvese que existen cinco coeficientes desconocidos (a, b, c, d y e) pero sólo cuatro ecuaciones de balances. Esto significa que se necesita alguna información adicional pararesolver el sistema. Generalmente esta información se obtiene experimentalmente. Un parámetro muy útil, medible de forma experimental, es el cociente de respiración (RQ); (6) Cuando se dispone de un valor experimental de RQ, las ecuaciones (2) a (6) pueden ya resolverse y así determinar los coeficientes estequiométricos. Los resultados son, sin embargo, muy sensibles a pequeños errores en el valor de RQ, el cual debe medirse con gran exactitud. Cuando la ecuación (1) está completa, las cantidades de sustrato, nitrógeno y oxígeno necesarias para la producción de biomasa pueden determinarse directamente. Balances de electrones Aunque los balances elementales son útiles, la presencia de agua en la ecuación (1) causa algunos problemas en la aplicación práctica. Teniendo en cuenta que generalmente el agua se encuentra en gran exceso y que cambios en la concentración de agua son difíciles de medir o verificar experimentalmente, los balances de H y O pueden presentar dificultades. En su lugar, un principio muy útil es la conservación de potencia reductora o electrones disponibles, la cual puede utilizarse para calcular relaciones cuantitativas entre sustratos y productos. Un balance de electrones muestra cómo se distribuyen en la reacción los electrones disponibles del sustrato.

4 Los electrones disponibles se refieren al número de electrones disponibles para transferir al oxígeno en la combustión de una sustancia a CO 2, H 2 O y compuestos que contengan nitrógeno. El número de electrones disponibles encontrados en los materiales orgánicos se calcula a partir de la valencia de sus elementos: 4 para C, 1 para H, -2 para O, 5 para P y 6 para S. El número de electrones disponibles para N depende del estado de referencia: -3 si la referencia es amoníaco, 0 para nitrógeno molecular N 2 y 5 para nitratos. El estado de referencia para el crecimiento celular se elige generalmente que sea el mismo que la fuente de nitrógeno del medio. En la siguiente discusión se supone por conveniencia que se utiliza amoníaco como fuente de nitrógeno, aunque el cambio es muy sencillo si se emplean otras fuentes de nitrógeno. El grado de reducción se define como el número de equivalentes de electrones disponibles en aquella cantidad de materia que contenga 1 átomo de carbono. Por lo tanto, para el sustrato C w H x O y N z, el número de electrones disponible es (4w+x-2y-3z). Él grado de reducción del sustrato es, por lo tanto. (4w+x-2y-3z)/w. El grado de reducción para el CO 2, H 2 O y NH 3 es cero. Los electrones disponibles para transferir al oxígeno se conservan durante el metabolismo. En una ecuación de crecimiento correctamente ajustada, el número de electrones disponibles se conserva en virtud del hecho de que las cantidades de cada elemento químico también se conservan. Aplicando este principio a la ecuación (1) y utilizando amoníaco como fuente de nitrógeno, el balance de electrones disponibles es: donde y son los grados de reducción del sustrato y de la biomasa, respectivamente. Obsérvese que el balance de electrones disponibles no es independiente de la serie completa de balances elementales; si la ecuación estequiométrica se ajusta en función de cada elemento que contenga H y O, el balance se satisface implícitamente. Rendimiento de biomasa Generalmente, para calcular los coeficientes estequiométricos se utiliza la ecuación (7) junto con los balances de carbono y nitrógeno, ecuaciones (2) y (5), y el valor medido de RQ.Sin embargo, un balance de electrones, dos balances elementales y una cantidad medida son todavía una información inadecuada para resol ver cinco coeficientes desconocidos, necesitándose

5 todavía otra cantidad experimental para ello. Conforme las células crecen existe, como regla general, una relación lineal entre la cantidad de biomasa producida y la cantidad de sustrato consumido. Esta relación se expresa cuantitativamente utilizando elrendimiento de biomasa, Y XS : (8) El rendimiento de biomasa se ve afectado por gran cantidad de factores como la composición del medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrógeno, el ph y la temperatura. El rendimiento de biomasa es mayor en cultivos aerobios que en los anaerobios; la elección del aceptor de electrones, es decir, O 2, nitrato o sulfato, puede tener también un efecto significativo. Cuando Y XS es constante durante el crecimiento, su valor determinado experimentalmente puede utilizarse para calcular el coeficiente estequiométrico c en la ecuación (1). La ecuación (8) expresada en términos de la estequiometría de la ecuación (1) es: (9) donde MW es el peso molecular y «MW células» significa el peso-fórmula de la biomasa más cualquier ceniza residual. Sin embargo, antes de aplicar los valores medidos de Y xs y la ecuación (9) para calculare, debe estarse seguro de que el sistema de cultivo experimental está correctamente representado por la ecuación estequiométrica. Por ejemplo, debemos estar seguros de que el sustrato no se utiliza para sintetizar otros productos extracelulares que no sean CO 2 y H 2 O. Una complicación de los cultivos reales es que alguna fracción de sustrato se consume para actividades de mantenimiento tales como el mantenimiento del potencial de la membrana y del ph interno, la recuperación de componentes celulares y la movilidad celular. Estas funciones metabólicas requieren sustrato pero no producen necesariamente biomasa celular, CO 2 y H 2 O, tal como se describe en la ecuación (1). Es importante tener en cuenta este mantenimiento, cuando se utiliza información experimental para completar las ecuaciones estequiométricas. En el Capítulo 11 se discuten con más detalle las necesidades de mantenimiento y la diferencia entre rendimientos observados y reales. Por el momento se considerará que los

6 valores disponibles de rendimiento de biomasa reflejan sólo el consumo de sustrato para el crecimiento. Estequiometría del producto Considérese la formación de un producto extracelular C j H k O l N m durante el crecimiento. La ecuación (1) puede extenderse para incluir la síntesis del producto de la siguiente manera: C w H x O y N z + a0 2 + bh g O h N i cch O N + dco 2 + eh 2 O +fc j H k O l N m (10) Donde f es el coeficiente estequiométrico para el producto. La síntesis del producto introduce otro coeficiente estequiométrico desconocido a la ecuación, por lo que se necesitará conocer otra relación más entre coeficientes. Para ello se utiliza generalmente otro coeficiente de rendimiento determinado experimentalmente, el rendimiento de producto a partir del sustrato, Y ps Como se ha mencionado anteriormente en relación al rendimiento de biomasa, debe asegurarse de que el sistema experimental utilizado para medir Y ps corresponde a la ecuación (10). La ecuación (10) no es válida si la formación de producto no está directamente relacionada con el crecimiento; asimismo no puede aplicarse a la producción metabólica secundaria como la fermentación de la penicilina o en biotransformaciones como la hidroxilación de esteroides que involucran sólo un pequeño número de enzimas. En estos casos, para describir el crecimiento y síntesis de producto deben utilizarse ecuaciones de reacción independientes. (11) Demanda teórica de oxígeno La demanda de oxígeno es un parámetro importante en el bioprocesado ya que el oxígeno es a menudo el sustrato limitante en las fermentaciones aerobias. La demanda de oxígeno está representada por el coeficiente estequiométrico a en las ecuaciones (1) y (10). Las necesidades de oxígeno están directamente relacionadas con los electrones disponibles para la transferencia de oxígeno por lo que la demanda de oxígeno puede derivarse a

7 partir de un balance de electrones apropiado. Cuando existe síntesis de producto, como el representado por la ecuación (10), el balance de electrones es: (12) donde obtiene: es el grado de reducción del producto. Reordenando la ecuación se (13) La ecuación (13) es una ecuación muy útil. Significa que si se conocen los organismos ( ), el sustrato (w y ) y el producto (j y ) involucrados en el cultivo celular, y el rendimiento de biomasa (c) y de producto (f), la demanda de oxígeno puede calcularse rápidamente. Por supuesto a puede también determinarse resolviendo los coeficientesestequiométricos de la ecuación (10) como se ha descrito. La ecuación (13) permite una evaluación más rápida y no es necesario conocer las cantidades de NH 3 CO 2 y H 2 O involucradas. Rendimiento máximo posible De la ecuación (12) se deduce que el reparto de electrones disponibles en el sustrato puede escribirse como: (14) El primer término de la parte derecha de la ecuación (14) es la fracción de electrones disponibles transferidos desde el sustrato al oxígeno, el segundo término es la fracción de electrones disponibles transferidos a la biomasa y el tercero es la fracción de electrones disponibles transferidos al producto. Esta relación puede utilizarse para obtener los rendimientos de biomasa y producto a partir del sustrato. Si se define como la fracción de electrones disponibles en el sustrato transferidos a la biomasa: (15)

8 En ausencia de formación de producto, si todos los electrones disponibles se utilizaran para la síntesis de biomasa sería igual a la unidad. Bajo estas condiciones, el valor máximo del coeficiente estequiométrico c es: (16) c max puede convertirse a rendimiento de biomasa con unidades de masa mediante la ecuación (9). Entonces, incluso si no se conoce la estequiometría de crecimiento, el límite superior de rendimiento de biomasa puede calcularse rápidamente a partir de la fórmula molecular del sustrato y del producto. Si no se conoce la composición de las células, puede tomarse como 4.2 que es el valor medio de la fórmula de la biomasa CH 1.8 O 0.5 N 0.2. Los rendimientos máximos de biomasa pueden expresarse en términos de masa (Y xs, max ) o como número de átomos de C en la biomasa por átomo de C de sustrato consumido (c max/w ). Estas cantidades se denominan algunas veces como rendimientos termodinámicas máximos de biomasa. Los sustratos con alto contenido energético, indicado por elevados valores de, producen los mayores máximos de rendimientos de biomasa. De esta manera puede determinarse el rendimiento máximo de producto en ausencia de síntesis de biomasa, a partir de la ecuación (14): (17) La ecuación (17) permite calcular rápidamente el límite superior del rendimiento de producto a partir de la fórmula molecular del sustrato y del producto. En conclusión la ecuación de la reacción química para la conversión del sustrato sin crecimiento es una pobre aproximación de la estequiometría global cuando existe crecimiento celular. Cuando se calculan los rendimientos y las demandas de oxígeno para cualquier proceso que incluye crecimiento celular debe utilizarse la ecuación estequiométrica global incluyendo la biomasa. Por otro lado, la naturaleza química o el estado de oxidación del sustrato presentan su mayor influencia sobre el rendimiento de producto o a biomasa a través del número de electrones disponibles.