Significancia de los micronúcleos en lesiones cervicales intraepiteliales y carcinoma

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1 Significancia de los micronúcleos en lesiones cervicales intraepiteliales y carcinoma María E. Gonsebatt Universidad Nacional Autónoma de México

2 > 90 % de los cánceres se originan en tejidos de origen epitelial (Cairns, 1975). Los tejidos epiteliales limitan tanto las cavidades internas como las superficies libres del cuerpo. Están en contacto directo con los agentes tóxicos (genotóxicos) o sus metabolitos.

3 Los epitelios se renuevan por división mitótica de las células basales o estaminales no diferenciadas. Este proceso es continuo y su velocidad de recambio depende de cada tejido. nasofaríngeas 15 días, vejiga 60 días.

4 Las células epiteliales se pueden obtener por raspado epitelial (cels. bucales, cervicales), por centrifugación de muestras de orina, en muestras bronquioalveolares, etc.

5 La citopatología estudia las alteraciones morfológicas de las células desprendidas libremente de los epitelios de revestimiento o extraídas de distintas zonas del cuerpo La citogenética molecular estudia la estructura, función y comportamiento de los cromosomas utilizando técnicas de biología molecular como la hibridización in situ fluorescente o FISH e hibridación genómica comparativa o CGH

6

7 El cáncer cérvico uterino es una de las principales causas de muerte por cáncer en la mujer, en todo el mundo, especialmente en países en desarrollo. Es producido por la infección con virus del papilloma humano (HPV) de las cepas consideradas de alto riesgo. 16 y 18 (70%) 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Esta infección produce lesiones en el cuello del útero que pueden resolverse o no Este tipo de cáncer es prevenible si se detecta a tiempo porque su progresión no es muy rápida (en la mayoría de los casos). La forma de prevenirlo y detectarlo es mediante exámenes citopatológicos (Papanicolaou) periódicos (al menos una vez por año).

8 Este examen toma muestras celulares cervico-vaginales y las clasifica de acuerdo al Sistema Bethesda: Sin cambios inflamatorios o asociados a malignidad, Con alteraciones por inflamación leve, moderada o severa. Atipias (ASGUS, ASCUS) LEIBG (LIBG) LEIAG(LIAG) (carcinoma in situ).

9 (Shiffman, 2007)

10 Estudiamos la frecuencia de micronúcleos (MN) en 275 preparaciones o Papanicolaous de Instituto de Cancerología de la Ciudad de México 13% Normales 23% ASCUS 14% LIBG 13% LIAG 23% CIS 14% IRR

11

12 Bajo grado Alto grado Carc. In situ

13

14

15 El uso de técnicas citogenéticas moleculares para mejorar la detección de cáncer del cérvix. (UNAM, UC, INCan) para investigar el origen de los micronúcleos

16 Origen de los MN y células aneuploides 2n±1 2n Célula aneuploide, casi diploide (45 o 47 cromosomas) 4n 4n±1 Tetraploide (92 cromosomas) Célula casi tetraploide (91-93 cromosomas)

17 Las pacientes acudían al INCan para su examen citopatológico FISH Sondas de DNA Diagnóstico citopatológico UNAM, UC Riverside

18 Se reclutaron 143 pacientes mexicanas con distintos diágnósticos citopatológicos de acuerdo al sistema Bethesda. Mediante cuestionarios se obtuvo información relevante de las pacientes. Se usaron sondas para los cromosomas 3 y 17 para el análisis de ploidía y sondas pancentroméricas para el análisis de los MN.

19 Sondas pericentroméricas para los cromosomas 1, 3, 11 y 17 Sondas pancentroméricas

20 Relación entre tetraploidía y diagnóstico # tetraploid cells/ Inflamación: valor de p = ASCUS: = LIBG: = LIAG: < Normal N=39 Inflamación 48 ASCUS 6 LIBG 9 LIAG 41

21 Relación entre aneuploidía y diagnóstico # Hyperdiploid aneuploid cells/ Inflamación: valor de p< ASCUS: < LIBG: = LIAG: < Normal N=39 Inflamación 48 ASCUS 6 LIBG 9 LIAGL 41

22 Correlación entre MN y células cervicales tetraploides P < ; R 2 = Células tetraploides per 1000

23 Frequencias of células micronucleadas MN+ o MNsegún diagnóstico (sondas pericentroméricas) N Células micronucleadas/ MN+ (pérdida de cromosoma) MN- (rompimiento cromosómico) * Normal (n=24) Inflamación (20) ASCUS (1) LIBG (6) LIAG (23) * * *

24 Pérdida preferencial del cromosoma 17 en células casi tetraploides Cr 3 1/39 Cr 17 3/39 Cs 3 Cs 17 Normal or sin pérdida 35/39 Normal o sin pérdida 13/41 Cr 17 28/41 Célula cervical casi tetraploide con pérdida del cr.17 Normal N=39 LIAG N=41 P-value <

25 Las oncoproteínas E6 y E7 de los HPV de alto riesgo generan inestabilidad cromosómica. Duensing & Münger, 2002

26 Modelo que explica el desarrollo de cáncer cervico-uterino Apoptosis Pérdida y rompimiento del cromosoma 17 Célula cervical casi tetraploide Continúa la pérdida y rompimientos cromosómicos Las proteínas E6 y E7 de HPV inhiben la expresión de genes supresores de tumores Célula del epitelio cervical infectada por HPV de alto riesgo Célula cervical tetraploide HPV infección persiste Células micronucleadas por rompimiento o pérdida de cromosomas Ganancia o pérdida y rompimiento de cromosomas (cr.3) Célula cervical casi tetraploide Cervical cancer near-diploid Regresión

27 Las muestras con diagnóstico inflamatorio también presentan un número significativo de células aneuploides y tetraploides Olarhaskyi et al., 2006

28 El protocolo que siguen las pacientes con inflamación ( a veces post electrocirugía) es el de recibir otro examen cada 3 o 6 meses hasta que tener un diagnóstico de normalidad. Muchas pacientes no regresan La prueba de PCR para detectar el tipo HPV puede no ser conclusiva o sensible. La presencia de células tetraploides podrá ser usado como indicador de mayor riesgo para malignidad.

29 OBJETIVO: Asociar la presencia de células tetraploides en Pap con diagnóstico inflamatorio con la presencia de infección por HPV de alto riesgo

30 METODOLOGÍA Se analizaron 137 Pap con diagnósticos normales e inflamatorios Criterios de inclusión: Pap con diagnóstico normal o inflamatorio. Criterio de exclusión: Pap de pacientes con cualquier tipo de tratamiento Pap de pacientes con otras infecciones virales Pap de pacientes con lesiones cervicales

31 Diagnóstico HPV-DNA positivo (N) HPV-DNA negativo (N) HPV alto riesgo (N) HPV bajo riesgo (N) Inflamación(N=77) Con EC (N=44) Sin EC (N=33) Normal (N=55) Con EC (N=28) Sin EC (N=27)

32 No encontramos diferencias entre la frecuencia de células tetraploides/aneuploides y la presencia de infección por HPV de alto o bajo riesgo

33 Los Pap con inflamación pos EC tienen una mayor frecuencia de células tetraploides

34 La electrocirugía o cono es un procedimiento quirúrgico para remover LIBG o LIAG. Los Pap inflamatorios pos cono presentan una elevada proporción de células tetraploides que puede asociarse a reparación tisular (Hanselmann & Oberringer, 2001). PPAR β/δ es un marcador de reparación de tejido epitelial.

35 r = p= # de células con expresion de pparβ cono sin cono

36 Diagnóstico citológico Expresión de PPARβ/δ Número total de Positive Negative pacientes Normal Normal post-ec Inflamación Inflamación post-ec

37 La presencia de células tetraploides/aneuploides puede indicar persistencia de la infección con HPV, que no resultó detectada por PCR. En inflamación la presencia de células tetraploides puede también originarse por reparación/proliferación del tejido epitelial. La expresión de PPARβ/δ puede ser de utilidad para detectar poliploidías originadas por reparación tisular.

38 Agradecimientos y participantes Universidad Nacional Autónoma de México Elsa Gutiérrez, M.Sc. Patricia Guzmán, M.Sc. Luisrael Santiago, B.Sc Leticia Rocha-Zavaleta, Ph.D. Cecilia Aguilar, B.Sc. Marcela Lizano-Soberón, Ph.D. Alejandro Mohar, Ph.D. Universidad de California (Riverside) David A. Eastmond, Ph.D. Andrew Olarhaski, Ph.D. UC-Mexus, PAPIIT Instituto Nacional de Cancerología Rita Sotelo-Regil Hallman, M.D. Gilberto Solorza-Luna, M.D. Pacientes del INCan

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