UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA 1

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4 TESIS DOCTORAL UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DEL ARNm DE LAS ONCOPROTEÍNAS E6 Y E7 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN EL SEGUIMIENTO DE PACIENTES TRATADAS POR CIN 2-3 Autor Dr. Adolfo Loayza Galindo Directores Dr. Javier de Santiago García Dr. Ignacio Zapardiel Gutiérrez Universidad Autónoma de Madrid Facultad de Medicina y Cirugía Madrid,

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6 Don Javier De Santiago García, Doctor en Obstetricia y Ginecología, y profesor asociado del Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad Autónoma de Madrid como director del Proyecto de Tesis presentado por Don Adolfo Loayza Galindo, con el título: UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DEL ARNM DE LAS ONCOPROTEÍNAS E6 Y E7 DEL VPH EN EL SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES TRATADAS POR CIN 2-3 CERTIFICA QUE: El trabajo presentado por Don Adolfo Loayza Galindo realizado bajo mi dirección, reúne los requisitos científicos, metodológicos, formales y de originalidad suficientes para ser defendido como Tesis Doctoral ante el Tribunal que legalmente proceda. Y para que conste donde proceda, firmo el presente documento en Madrid a 19 de mayo de Dr. D. Javier De Santiago García. 6

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8 Don Ignacio Zapardiel Gutiérrez, Doctor en Obstetricia y Ginecología, y profesor asociado del Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad Autónoma de Madrid como director del Proyecto de Tesis presentado por Don Adolfo Loayza Galindo, con el título: UTILIDAD CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DEL ARNM DE LAS ONCOPROTEÍNAS E6 Y E7 DEL VPH EN EL SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES TRATADAS POR CIN 2-3 CERTIFICA QUE: El trabajo presentado por Don Adolfo Loayza Galindo realizado bajo mi dirección, reúne los requisitos científicos, metodológicos, formales y de originalidad suficientes para ser defendido como Tesis Doctoral ante el Tribunal que legalmente proceda. Y para que conste donde proceda, firmo el presente documento en Madrid a 19 de mayo de Dr. D. Ignacio Zapardiel Gutiérrez. 8

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10 AGRADECIMIENTOS Desde que surgió la idea de realizar este trabajo, ha pasado mucho tiempo y han sido muchas las personas que han participado en su elaboración. Y ahora voy a intentar acordarme de todos. En primer lugar, agradecer al Dr. Javier De Santiago por permitirme realizar esta tesis, por su apoyo incondicional y por contar conmigo para llevar adelante el magnífico proyecto de la Maternidad del Hospital La Paz. Agradecer, también de manera especial, al Dr. Zapardiel, director, al igual que el Dr. De Santiago, de mi tesis. Contar con tu experiencia como investigador ha sido clave para poder terminar con esta tesis. Gracias por el tiempo que inviertes en darme consejos, en revisar todos los temas, por tu disponibilidad cada vez que te lo he pedido. A mis compañeros de la Unidad del Tracto Genital inferior: Dra. Ana Pérez, Dra. Serrano y, muy especialmente a la enfermera Elena López. A todas ellas por haberme ayudado con la captación de pacientes y recogida de muestras. A Labec Pharma y a sus integrantes: Javier de Echevarría, Bibiana Palao y María Moreno por haber financiado el coste total de la prueba HPV OncoTect. A la Dra. María del Pilar Romero, viróloga del Servicio de Microbiología del HULP, por su participación en la realización de las pruebas de detección de ADN y de ARNm del VPH (Nuclisens). A la Dra. Rosario madero del servicio de Bioestadística por su inestimable ayuda en el campo de la estadística. A la Dra. Alicia Hernández por animarme a seguir con la tesis en esos momentos de indecisión. Al Dr. Dans por sus consejos, por no dejarme de recordar que tengo que acabar la tesis, por su ayuda en el tema administrativo. Y, por supuesto, agradecer a toda mi familia que me ha apoyado y siempre me ha animado a seguir con mis ideales y, de manera muy especial a mi mujer 10

11 Marina y mis dos hijas Laura y Sofía por la paciencia y por esas que he dejado de estar con ellas. 11

12 ABREVIATURAS AGC: células glandulares atípicas AGUS: células glandulares atípicas de significado indeterminado ALTS: ASCUS-L-SIL Triage Study ASC: células escamosas atípicas ASC-H: lesión intraepitelial en la que se debe excluir lesión de alto grado ASCUS: lesión intraepitelial de significado incierto ATP: adenosín trifosfato CBL: citología en base líquida CIN: neoplasia intraepitelial cervical CIS: carcinoma in situ CT: Chlamydia trachomatis FDA: Food and Drug Administration FGF-BP: factor de crecimiento fibroblástico vinculante HC2: Hybrid Capture 2 HSIL: lesión escamosa intraepitelial de alto grado htert: telomerasa transcriptasa inversa humana HULP: Hospital Universitario La Paz IARC: International Agency for Research on Cancer ISESCC: Colaboración Internacional de los Estudios Epidemiológicos de cáncer de Cuello Uterino LEEP: escisión con asa electroquirúrgica LLETZ: escisión con asa grande de la zona de transformación) LSIL: lesión escamosa intraepitelial de bajo grado P53: proteína 53 PRb: proteína del retinoblastoma RR: riesgo relativo SEGO: Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia SIL: lesión escamosa intraepitelial TBS: sistema Bethesda VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial 12

13 VHS: VIH: VPH: VPP: virus del herpes simplex virus de inmunodeficiencia humano virus del papiloma humano valor predictivo positivo 13

14 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN CONCEPTO E HISTORIA DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL EPIDEMIOLOGÍA DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Y DEL CÁNCER DE CUELLO DE UTERO HISTORIA NATURAL DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL El virus del papiloma humano Papel de la infección por el VPH Prevalencia Vías de transmisión Factores de riesgo para la exposición al VPH A. Número de parejas B. Comportamiento sexual de las parejas C. Falta de uso del preservativo D. La iniciación sexual Factores del VPH asociados con el desarrollo de CIN de alto grado Tipo de VPH Persistencia de la infección por el VPH Carga viral Cofactores en la patogénesis de CIN Papel de la inmunidad en la historia natural de CIN Tabaco Otros agentes infecciosos El uso de anticonceptivos hormonales Elevada paridad Papel del epitelio metaplásico Carcinogénesis Papel de las oncoproteínas E6 y E7 en la oncogénesis A. FUNCIONES DE LA PROTEÍNA E B. FUNCIONES DE LA PROTEÍNA E CLASIFICACIÓN ANATOMO-PATOLÓGICA DE CIN El sistema Bethesda Características histológicas de las lesiones escamosas

15 1.5. MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL DIAGNÓSTICO Cribado del cáncer de cuello de útero La citología A. Rendimiento clínico de la citología B. Citología en basa líquida Pruebas de detección de ADN del VPH Cribado citológico y detección del ADN del VPH La detección del ADN del VPH como prueba de cribado primario Manejo de los resultados positivos del cribado Pacientes con ASCUS en la citología Pacientes con LSIL en la citología Otras alternativas de cribado Cribado primario con test de detección de ADN del VPH Auto-toma de muestra para el test de ADN del VPH Auto-toma de muestras y posterior clasificación con citología Detección del ARNm de E& y E7 en cribado primario Detección de p Cribado en mujeres vacunadas La colposcopia TRATAMIENTO DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Introducción Evaluación pretratamiento Condiciones de la paciente Características de la lesión Tipos de tratamiento Tratamientos destructivos A. Criocoagulación B. Electrocoagulación diatérmica C. Coagulación con láser Tratamientos escisionales A. Conización B. Histerectomía SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES TRATADAS POR CIN

16 Importancia del seguimiento Protocolos de seguimiento Medios para el seguimiento La citología La colposcopia Detección del ADN del VPH HIPÓTESIS Y OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL OBJETIVOS SECUNDARIOS MATERIAL Y MÉTODOS DISEÑO DEL ESTUDIO SELECCIÓN DE LAS PACIENTES Tamaño de la muestra y periodo de reclutamiento Criterios de inclusión SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES PROCEDIMIENTOS DEL ESTUDIO Y EVALUACIONES Conización Recogida de la muestra para la citología y pruebas moleculares La citología en base líquida La colposcopia Detección de ADN del HPV Detección del ARNm del VPH-Nuclisens Detección del ARNm del VPH- OncoTect CRITERIO DE FRACASO TERAPEÚTICO ANÁLISIS ESTADÍSTICO ÉTICA Y LEGISLACIÓN La información a la paciente y el consentimiento informado RESULTADOS ESTUDIO DESCRIPTIVO Tamaño de la muestra y tiempo de seguimiento Edad de las pacientes Diagnóstico citológico previo a la conización

17 Resultado de la biopsia previa a la conización Resultado de la pieza de conización Resultados de la citología en la primera revisión tras la conización Test de detección de ARNm OncoTect HPV Test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ Test de detección de ADN del VPH Seguimiento citológico Biopsias en el periodo de seguimiento ESTUDIO DE COCORDANCIA ENTRE LOS TESTS ANALIZADOS Concordancia entre los tests de detección de ARNm OncoTect HPV y NucliSENS EasyQ Concordancia entre el test de detección de ARNm OncoTect HPV y el test de detección de ADN Concordancia entre el test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ y el test de detección de ADN ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS DE LA PRIMERA REVISIÓN Test de detección de ARNm OncoTect HPV Test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ Test de detección de ADN ANÁLISIS DE LOS DATOS DE SEGUIMIENTO Test de detección de ARNm OncoTect HPV Test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ Test de detección de ADN ANÁLISIS DE LA PROBABILIDAD DE RECURRENCIA Test de detección de ARN del VPH de alto riesgo OncoTect HPV Test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ Test de detección de ADN DISCUSIÓN VALIDEZ Y SEGURIDAD DE LAS PRUEBAS EVALUADAS Prueba de detección de ARNm de E6 y E7 OncoTect HPV Prueba de detección de ARNm NucliSENS EasyQ CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

18 8. ANEXOS ANEXO I. HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO POR ESCRITO ANEXO II. HOJA DE INFORMACIÓN

19 1. INTRODUCCIÓN 19

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21 1. INTRODUCCIÓN 1.1. CONCEPTO E HISTORIA DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Los diversos grados de lesión microscópica en el epitelio cervical que preceden al cáncer invasor de cuello de útero son considerados como neoplasia intraepitelial cervical, conocidos con el acrónimo inglés de CIN (cervical intraepithelial neoplasia). La infección persistente por los tipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) juega un papel importante en el desarrollo de estas lesiones intraepiteliales y su posible progresión hacia el cáncer. La neoplasia intraepitelial cervical se caracteriza por alteraciones en la maduración y anomalías nucleares de las células afectadas. Se dividen en tres grados según la extensión de la lesión. El término displasia fue introducido por Reagan en 1953 para diferenciar la atipia cervical del carcinoma in situ. El término de neoplasia intraepitelial cervical, fue acuñado por Richart en La CIN se dividió en tres grados: CIN 1 displasia leve, CIN 2 displasia moderada y CIN 3 displasia grave y carcinoma in situ (CIS). El mismo autor en 1990, teniendo en cuenta el papel del VPH en la etiología del cáncer cervical de células escamosas modificó la clasificación. Clasificó las lesiones en: de bajo grado o lesiones relacionadas con el VPH y de alto grado o lesiones que tienen características de los precursores de cáncer (1). Las recomendaciones del Instituto nacional del Cáncer de EEUU denominada Sistema Bethesda introdujo el término lesión intraepitelial escamosa (squamous intraepithelial lesion [SIL]) y divide las lesiones en lesión intraepitelial de bajo grado (low squamous intraephitelial lesion [L-SIL]) y lesiones de alto grado (high squamous intraephitelial lesion [H-SIL]). L-SIL abarca los cambios condilomatosos por VPH y CIN de bajo grado, H-SIL abarca CIN 2-3 (2). 21

22 1.2. EPIDEMIOLOGÍA DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Y DEL CÁNCER DE CUELLO DE UTERO Según los datos de la serie GLOBOCAN publicado por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (International Agency for Research on Cancer [IARC]), el cáncer de cuello de útero es el cuarto tipo de cáncer más frecuente entre las mujeres de todo el mundo, y el séptimo en general, con estimaciones de nuevos casos en Más del 85% de la carga mundial se produce en los países en desarrollo, donde representa casi el 12% de todos los cánceres femeninos. Las regiones de mayor riesgo, con una estimación de más de 30 casos por habitantes, incluyen África Oriental (42,7 casos), Melanesia (33,3 casos), Sur de África (31,15 casos) y África Central (30,6 casos). Las tasas más bajas están en Australia/Nueva Zelanda (5,5 casos) y Asia Occidental (4,4 casos). El cáncer de cuello de útero sigue siendo el cáncer más común en las mujeres de África Oriental y Central (Figura 1). Figura 1.Incidencia estimada de cáncer de cérvix en el mundo para 2012 por habitantes. 22

23 Se han estimado unas muertes por cáncer de cuello de útero en todo el mundo en 2012, representando el 7,5% de todas las muertes por cáncer en mujeres. Casi nueve de cada diez (87%) muertes por cáncer cervical se producen en las regiones menos desarrolladas del mundo. La mortalidad varía 18 veces entre las distintas regiones del mundo, con tasas que van desde menos de 2 por en Asia Occidental, Europa Occidental y Australia/Nueva Zelanda a más de 20 por en Melanesia, África Oriental y África Central (Figura 2). Figura 2. Mortalidad estimada por cáncer de cérvix en el mundo para 2012 por habitantes. Respecto a las lesiones precursoras del cáncer de cuello de útero (CIN II-III) según los datos de un reciente meta-análisis la prevalencia es de 1,2% (0,8-1,5) cuando se utiliza la captura de híbridos para detectar el ADN del virus del papiloma humano conjuntamente con la citología (3). 23

24 1.3 HISTORIA NATURAL DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL El virus del papiloma humano Es un virus pequeño de unos nm de diámetro. Las partículas están formadas por moléculas de ADN circular de unos 8000 pares de bases envueltas por una cubierta proteica (cápside). El genoma está organizado en regiones codificantes y no codificantes. En la región codificante han sido identificadas zonas de lectura abierta (ORF). De estas, 8 son de expresión temprana o early (E1-E8) y 2 de expresión tardía o late2 (L1-L2). E1-E8 codifican proteínas que interactúan con el genoma del huésped para producir nuevo ADN viral mientras que L1 y L2 se activan sólo después de la replicación del ADN viral y codifican las proteínas de la cápside viral. La zona no codificante se encarga de la regulación de la expresión génica, la replicación del genoma y su ensamblaje en partículas virales. Todos los virus del papiloma son organismos intranucleares obligatorios con tropismo específico hacia los queratinocitos (Figura 3) (4)(5). Figura 3. Representación esquemática del genoma del VPH, mostrando la disposición de los genes E tempranos, los genes de la cápside (L1 y L2) y la región no codificante (URR). En Vaccine. Capítulo 1: El VPH en la etiología del cáncer humano. 24

25 1.3.2 Papel de la infección por el VPH Los VPH son los agentes etiológicos de los cánceres epiteliales del cuello uterino y otros órganos. La persistencia de las infecciones por tipos de alto riesgo del VPH es el mayor factor de riesgo para la progresión maligna. La infección por el virus del papiloma humano de alto riesgo es la causa principal y necesaria para el desarrollo de la neoplasia intraepitelial cervical de alto grado y del cáncer de cuello de útero. La IARC ha reunido la mayor serie de casos de cáncer cervical invasivo. Alrededor de 1000 mujeres con verificación histológica de invasión del cáncer de cuello uterino fueron reclutadas de 22 países de todo el mundo. Las biopsias congeladas de los tumores fueron analizadas en un laboratorio central para la detección de ADN de VPH. Después de un nuevo análisis de los casos inicialmente negativos para el VPH, el ADN del VPH se detectó en el 99,7% de los tumores, lo que lleva a la conclusión de que el VPH es una causa necesaria para el desarrollo del cáncer de cuello uterino (6) Prevalencia La infección por el virus del papiloma humano es la infección de transmisión sexual más común a nivel mundial, con altas prevalencias tanto en hombres como en mujeres (7). La distribución de los diferentes tipos de VPH entre las mujeres presenta una gran variabilidad según la edad y la situación geográfica. En un análisis conjunto donde se incluyeron más de mujeres entre 15 y 74 años con citologías normales se observó que la prevalencia puede variar hasta casi veinte veces, 1,4% en España frente al 25,6% en Nigeria (8). En un met-análisis sobre la prevalencia mundial del ADN del VPH en mujeres con citología normal la prevalencia se estimó en 10,4% (IC 95%: 10,2-10,7). Las estimaciones fueron: África 22%, América central y México 20%, América del norte 11,3%, Europa 8,1% y Asia un 8%. En todas las regiones del mundo, la prevalencia del VPH fue mayor en las mujeres menores de 35 años y disminuye en los grupos de edad media. Los tipos más comunes de VPH son 25

26 similares a los descritos con mayor frecuencia en los casos de CIN y cáncer, aunque la contribución relativa de HPV 16 y 18 es sustancialmente menor en las mujeres con citología normal (9). En España los estudios de prevalencia señalan al VPH 16 como el más frecuente (20,7%), seguido de las infecciones duales por los tipos 31 y 51 (13,8%) y del VPH 51 (10,3%). La infección genital por el VPH en las mujeres es predominantemente adquirida en la adolescencia, y el pico de prevalencia en mujeres de mediana edad parece diferir según las regiones geográficas. En numerosos estudios se observa un aumento de la prevalencia en mujeres mayores de 65 años con la excepción de Asia. Estas variaciones podrían estar explicadas por la pérdida gradual de inmunidad o por diferencias en el comportamiento sexual en las diferentes áreas geográficas (10) Vías de transmisión El coito es la principal vía de infección genital por el virus del papiloma humano. En un estudio de seguimiento de mujeres vírgenes se demostró que sólo las mujeres que habían iniciado actividad sexual (coito) se hicieron positivas para el ADN del VPH y/o desarrollaron anticuerpos contra el VPH (11). El coito incluye tanto el coito vaginal como el coito anal. El riesgo de transmisión por contacto digital-genital u oral-genital parece ser mínimo (12). En un estudio de 154 muestras de vagina y de cuello de útero obtenidas de mujeres vírgenes, 2 muestras fueron positivas para el ADN del VPH 6 (13). Se ha reportado la posibilidad de transmisión vertical de madre a recién nacidos. En un estudio de niños nacidos de madres con antecedentes de CIN y/o verrugas genitales, el 38 % de los niños fueron positivos para el ADN del VPH a las 24 horas y el 31% a las seis semanas. Se desconoce si la adquisición del virus del papiloma humano durante el período neonatal predispone a un mayor riesgo de CIN en la vida adulta (14). 26

27 Factores de riesgo para la exposición al VPH A. Número de parejas Existen datos que demuestran la asociación entre la probabilidad de encontrar infección por el VPH en muestras del tracto genital inferior y el número de parejas sexuales. El número de parejas sexuales de por vida se asocia con la positividad del VPH. Las mujeres que tenían múltiples tipos del VPH e infección por el VPH de alto riesgo reportaron un número, estadísticamente significativo, mayor de parejas sexuales que las mujeres que tenían infecciones de un solo tipo y de bajo riesgo (15). B. Comportamiento sexual de las parejas El comportamiento sexual de las parejas también constituye un factor de riesgo para la adquisición de la infección por el HPV en mujeres. Las relaciones sexuales del marido fuera del matrimonio se asocia con una OR de 1,45 (IC del 95%: 1,24-1,70) para la positividad del VPH en sus esposas después del ajuste por edad y número de parejas durante toda la vida sexual de las mujeres (15). C. Falta de uso del preservativo El uso del preservativo es eficaz en la protección contra la transmisión del VIH entre mujeres y hombres, y para reducir el riesgo de infección de gonorrea en los hombres. El uso del preservativo se asocia con la protección estadísticamente significativa entre hombres y mujeres de infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por clamidia, gonorrea, virus herpes simple tipo 2, y la sífilis. Los preservativos también pueden estar asociados con la protección de las mujeres contra la tricomoniasis. El uso del preservativo se ha asociado con tasas más altas de regresión de la neoplasia intraepitelial cervical y la remisión de la infección cervical por VPH en mujeres y con la regresión de lesiones de pene asociadas al VPH (16). 27

28 Las mujeres cuyas parejas usaron preservativos para todas las instancias de coito vaginal durante los últimos ocho meses tuvieron un 70 % menos probabilidades de contraer una nueva infección que las mujeres cuyas parejas usaron preservativo menos del 5 por ciento del tiempo, después de ajustar por el número de nuevas parejas y el número estimado de parejas anteriores de la pareja masculina (17). D. La iniciación sexual En un estudio longitudinal se buscó determinar si el intervalo entre la menarquia y la edad de la primera relación sexual se asocia con la infección por VPH y de ser así, si dicha asociación es independiente de la edad de la primera relación sexual. Un intervalo corto está asociado con la infección por VPH, pero la asociación no es independiente de la edad de la primera relación sexual. La edad de la primera relación sexual debe considerarse como un factor de riesgo importante e identificable para la posterior investigación de la infección por el VPH y la práctica clínica (18). En otro estudio de los mismos autores se observó que dicha asociación estaba afectada por otros factores como el número de parejas en los últimos 6 meses, los antecedentes de infecciones de transmisión sexual, el alcohol, el consumo de drogas y el comportamiento sexual y número de parejas de sus compañeros sexuales (19) Factores del VPH asociados con el desarrollo de CIN de alto grado Tipo de VPH De los más de cien tipos de VPH existen algunos que están relacionados en mayor frecuencia con el desarrollo de cáncer de cuello de útero. Son los considerados tipos de alto riesgo. En un estudio que incluía pacientes 28

29 con cáncer de cuello de útero, los tipos más comunes del VPH fueron, en orden decreciente de frecuencia, el 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58 y el 35. Quince tipos de VPH se clasificaron como tipos de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, y 82); 3 se clasificaron como tipos de probable alto riesgo (26, 53 y 66), y 12 fueron clasificados como de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108). De esta manera, además de los tipos de VPH 16 y 18, los tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82 deben ser considerados cancerígenos, o de alto riesgo, y los tipos 26, 53 y 66 deben ser considerados como probablemente cancerígenos (Tabla 1 ) (20). Alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, y 82 Posible alto riesgo 26,53 y 66 Bajo riesgo 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108 Tabla 1. Clasificación de los VPH según su riesgo oncogénico. El VPH 16 es el más carcinogénico, persiste durante más tiempo que otros tipos, y como tal, tiene el mayor riesgo de progresión. El riesgo absoluto de CIN-3 se acerca al 40% a los 5 años de persistencia (21) Persistencia de la infección por el VPH La persistencia de la infección se define como la detección del mismo tipo del VPH en dos o más ocasiones separadas por un intervalo de tiempo. No existe consenso entre la transitoriedad y la persistencia. La mayoría de las mujeres jóvenes con una prueba positiva para el VPH se hacen negativas en el transcurso de 24 meses. Las mujeres con infecciones por el VPH de bajo riesgo son más propensas a la regresión que las mujeres portadoras del VPH de alto riesgo (22). En una revisión sistemática de 2008 se llegó a la conclusión de que la persistencia del VPH está fuertemente asociada con el CIN 2-3/HSIL. La magnitud del efecto de la persistencia del VPH fue más fuerte con una mayor 29

30 duración de la infección, con intervalos más amplios entre las pruebas, y con el grado más alto de la lesión cervical (23) Carga viral En una cohorte de mujeres seguidas durante 10 años se midió la carga viral de 13 tipos de VPH de alto riesgo. A pesar de que la presencia del VPH aumentó fuertemente el riesgo de CIN 3, la carga viral más elevada no pudo predecir el riesgo de CIN 3 (24). La carga viral de los VPH de alto riesgo está fuertemente asociada con el diagnóstico de CIN 2 o CIN 3 en mujeres que están en seguimiento por células escamosas atípicas o LSIL en la citología (25). En un estudio de seguimiento de pacientes tras tratamiento quirúrgico de CIN, la carga viral del VPH de alto riesgo tuvo una correlación positiva con la presencia de lesión cervical y una mayor malignidad de las células (26). El papel que desempeña la carga viral en la historia natural de la infección por el VPH sigue siendo incierto (21) Cofactores en la patogénesis de CIN Papel de la inmunidad en la historia natural de CIN Los mamíferos han desarrollado sofisticados mecanismos de inmunidad innata y adaptativa para controlar la infección viral, y para limitar los daños del órgano donde la infección persiste. A pesar de estos mecanismos, la mayoría de las infecciones por el virus del papiloma humano son duraderas. La inmunidad humoral mediada por anticuerpos contra la cápside viral se ha demostrado suficiente para la protección contra la infección al eliminar las partículas virales libres, mientras que la inmunidad innata y adaptativa mediada por células parece importante para la eliminación del virus de las células infectadas y para generar memoria inmunitaria (21, 27). 30

31 Las personas con inmunodepresión causada por la infección por el VIH o trasplante de órganos tienen mayor riesgo de desarrollar cánceres anogenitales asociados al VPH si se comparan con individuos sanos de la misma edad (28) Tabaco La Colaboración Internacional de los Estudios Epidemiológicos de cáncer de Cuello Uterino (International Collaboration of Epidemiological Studies of Cervical Cancer [ISESCC]) ha reunido los datos de mujeres con carcinoma cervical y de mujeres sin carcinoma cervical, de 23 estudios epidemiológicos. Se tuvo en cuenta la edad, el número de parejas sexuales, la edad de la primera relación sexual, el uso de anticonceptivos orales y la paridad. Las fumadoras actuales tenían un riesgo significativamente aumentado de carcinoma de células escamosas de cuello de útero en comparación con las no fumadoras con un RR de 1,6 (IC 95%: 1,48-1,73), p <0,001.También hubo un aumento del riesgo, aunque en menor medida, en las ex-fumadoras, y no había ninguna tendencia clara con respecto al tiempo desde que se dejó de fumar. No se encontró asociación entre el tabaquismo y el adenocarcinoma de cuello uterino ni para las fumadoras actuales, ni para las ex-fumadoras. En las fumadoras, el riesgo relativo de carcinoma de células escamosas aumentó al aumentar el número de cigarrillos fumados por día y también con una menor edad de iniciación del hábito, pero no con la duración del hábito de fumar. En resumen, las fumadoras tienen un riesgo mayor de cáncer de cuello de útero de células escamosas, pero no de adenocarcinoma. El riesgo de carcinoma de células escamosas aumenta en los fumadoras actuales con el número de cigarrillos fumados por día y con una menor edad de iniciación del hábito (29). Mecanismo de la carcinogénesis del tabaco. Estudios epidemiológicos sugieren que el humo del tabaco contiene sustancias cancerígenas que en sinergia con el VPH aumentan el riesgo de progresión a cáncer de cuello de útero. El 31

32 benzopireno, un carcinógeno importante en el humo del cigarrillo, se detecta en el moco cervical y puede interactuar con el VPH. En general, la modulación del ciclo de vida del VPH por el benzopireno podría promover la persistencia viral, la carcinogénesis del tejido huésped, y la permisividad para la progresión del cáncer (30) Otros agentes infecciosos La evidencia apunta a una posible asociación entre las infecciones por el VPH y Chlamydia trachomatis (CT) y el cáncer de cuello de útero mediante la inducción de expresión de mediadores pro-inflamatorios, la alteración de la adhesión intercelular y afectación de la diferenciación celular. Sin embargo, la asociación entre la infección por HPV y CT está aún por determinar (31). Los resultados de un estudio prospectivo, llevan a proponer que las infecciones por Trichomonas vaginalis y el virus del herpes simplex (VHS) son también predictoras de neoplasia cervical (32). Los resultados de un análisis conjunto sugieren que aunque el VHS-2 puede actuar en conjunción con la infección por el VPH aumentando el riesgo de cáncer cervical invasivo, el efecto de la infección por HSV-2 sobre el riesgo de cáncer invasivo de cuello uterino es modesto en comparación con los fuertes efectos de la infección por VPH en el riesgo de cáncer invasivo del cuello uterino (33). La infección por CT puede aumentar la susceptibilidad al VPH a un nivel celular, aumentando el acceso al epitelio basal debido a micro-abrasiones o mediante la alteración de las características de las células epiteliales. También puede producir aumento de la carga viral de la infección por el VPH y facilitar la persistencia. La infección simultánea con CT puede impedir la eliminación del VPH mediante la inducción de un cambio en la respuesta inmunitaria a la infección por el VPH (34). La persistencia de las infecciones por el VPH oncogénico es más frecuente entre las mujeres que han tenido una infección por CT (35). 32

33 El uso de anticonceptivos hormonales El riesgo de cáncer de cuello uterino se incrementa con la duración del uso de anticonceptivos orales combinados. Estudios que han investigado la infección por virus del papiloma humano sugieren que la prevalencia de la infección no aumenta en las mujeres que usan anticonceptivos combinados, el aumento de riesgo de cáncer de cuello uterino se registró en los análisis de los datos de las pacientes que fueron positivas para virus del papiloma humano. Datos de estudios in vitro y estudios en animales sugieren que los estrógenos y los progestágenos pueden aumentar la expresión de ciertos genes del virus del papiloma y estimular la proliferación celular en el cuello del útero humano a través de los elementos de respuesta hormonal en el genoma viral y por medio de mecanismos mediados por receptores, aunque otros mecanismos también podrían estar involucrados (36). La última revisión de la ICESCC informó los siguientes resultados: entre las usuarias actuales de anticonceptivos orales el riesgo de cáncer cervical aumentó con la duración del uso (riesgo relativo para el uso de 5 o más años en comparación con no usar, 1,90 [IC 95% 1,69-2,13]). El riesgo disminuyó después de dejar de fumar, y tras 10 años o más había vuelto al nivel de las no usuarias. Un patrón similar de riesgo se observó tanto para el cáncer invasivo como para el carcinoma in situ, y en las mujeres que dieron positivo para el virus del papiloma humano de alto riesgo (37) Elevada paridad La ICESCC ha analizado los datos de mujeres con carcinoma invasivo, mujeres con CIN 3/carcinoma in situ y mujeres sin cáncer de cuelo de útero a partir de 25 estudios epidemiológicos. Después de controlar por la edad del primer embarazo a término, el RR para carcinoma invasivo de cuello uterino en las mujeres multíparas fue 1,76 (IC 95%: ) para las 33

34 que tuvieron 7 ó más partos frente a las que tuvieron 1 ó 2. Para CIN 3/carcinoma in situ, no se encontró un aumento significativo del riesgo relativo con el incremento del número de nacimientos después de controlar por la edad del primer embarazo a término. La menor edad en el momento del primer embarazo a término también se asoció con el riesgo de carcinoma invasivo de cuello uterino y CIN 3/carcinoma in situ. Después de controlar el número de embarazos a término, el RR para el primer embarazo a término en menores de 17 años en comparación con las mayores de 25 años fue 1,77 (IC 95%: 1,42-2,23) para el carcinoma invasivo de cuello uterino, y 1,78 (IC del 95% IC: 1,26-2,51) para CIN 3/carcinoma in situ. Según estos datos, las diferencias en los hábitos reproductivos han podido contribuir a las diferencias en la incidencia de cáncer de cuello uterino entre los países desarrollados y en vías de desarrollo (38) Papel del epitelio metaplásico El VPH afecta al epitelio de la zona de transformación del cuello del útero. La zona de transformación o unión escamoso-cilíndrica es un área donde el epitelio escamoso se une con el cilíndrico. La localización de la zona de transformación varía respecto al orificio cervical externo. Depende de la edad, del ciclo hormonal, el embarazo y parto, y el uso de anticonceptivos hormonales. La metaplasia es el proceso por el cual el epitelio columnar se transforma en epitelio escamoso. Este proceso se activa en la pubertad por los cambios hormonales. Por algún motivo es esta la zona donde se producen los efectos oncogénicos del virus del papiloma humano Carcinogénesis El virus del papiloma humano infecta el epitelio metaplásico de la zona de transformación del cuello del útero. La mayoría de las infecciones por VPH (es decir, la presencia de ADN, pero sin lesión detectable) y CIN de bajo grado se resuelven como consecuencia de la respuesta inmunitaria. Como se explicó 34

35 anteriormente, una menor parte de las mujeres infectadas no desarrolla una respuesta adecuada y la infección persiste. Este grupo de mujeres, con infección persistente por el HPV de alto riesgo, es el que está en situación de riesgo de desarrollar la enfermedad de alto grado o cáncer. El ciclo vital del VPH está estrechamente vinculado con el programa de diferenciación de la célula huésped infectada, los queratinocitos. Se cree que la infección por el virus del papiloma humano ocurre a través de pequeñas roturas del epitelio, lo que expone las células de la capa basal a la entrada del virus. La infección por VPH de estas células lleva a la activación de una cascada de expresión de genes virales que resulta en la producción de, aproximadamente, 20 a 100 copias de ADN viral por célula. Este bajo número de copias es mantenido de forma estable en las células basales indiferenciadas en el curso de la infección y durante períodos variables de tiempo. Estas células infectadas son todavía competentes y capaces de replicarse. Las proteínas virales E1 y E2 son esenciales en esta fase de replicación basal de ADN. Los VPH se replican en este compartimento y, para su liberación al entorno, aprovechan la desintegración de las células epiteliales que se produce como consecuencia de su recambio natural en las capas superficiales (4, 39). Las proteínas virales E1 son las proteínas originarias, esenciales para la replicación del virus del papiloma. Las proteínas E1 se unen a los elementos específicos del ADN viral en el origen de la replicación y se ensamblan para formar las helicasas con la ayuda de una segunda proteína viral, E2. El complejo helicasa ADN resultante inicia el desdoblamiento para proporcionar la plantilla para la síntesis de ADN posterior de la progenie. Además de la actividad helicasa dependiente de ATP, las proteínas E1 interactúan y reclutan a varias proteínas de la replicación celular de acogida de origen viral (40). Las E2 proteínas del VPH de alto riesgo son factores de transcripción y replicación, regulando de forma negativa la transcripción de E6/E7. Más recientemente, se les ha conferido propiedades intrínsecas que podrían participar en la transformación celular. Estas nuevas propiedades oncogénicas se basan en su capacidad para inducir mitosis anormales, ya sea pérdida o exceso de ADN, junto con roturas en el ADN durante la anafase. También 35

36 podría deberse a la estabilización de los oncogenes como Skp2, lo que lleva a la aceleración de la transición G1 / S. E2 está ausente en la mayoría de los carcinomas de cuello uterino humano, lo que significa que su presencia no es necesaria para el mantenimiento de la carcinogénesis. Una intrigante posibilidad es que la unión de E2 tanto al ADN viral y celular durante el ciclo vegetativo del VPH, podría llevarlos cerca unos de otros y, a través de roturas en el ADN inducido por E2 en la mitosis, podría facilitar la integración del ADN viral en el genoma celular.las proteínas E2 del VPH de bajo riesgo no provocan inestabilidad cromosómica y roturas en el ADN a pesar de que son capaces de unirse tanto al ADN viral y celular. En resumen, para el VPH de alto riesgo, la proteína E2 produce inestabilidad cromosómica seguida por la integración del genoma viral que ha sido documentado como uno de los pasos principales que conducen a la transformación inducida por el VPH. Los resultados de varios estudios han establecido a la proteína E2 como un represor transcripcional de los oncogenes virales (oncoproteínas E6 y E7) para el virus del papiloma humano de alto riesgo. La inducción de la apoptosis es otra propiedad de E2 del VPH de alto riesgo, junto con la represión de E6/E7, lo que podría contribuir a su clasificación como proteína anti-oncogénica viral. Aunque el mecanismo es controvertido, la inducción de apoptosis está bien documentada en las células que sobreexpresan E2. E2 es capaz de activar el puesto de control mitótico y puede inducir poliploidía. La poliploidía inducida por E2 de alto riesgo a través de la generación de mitosis anormales podría ser un paso importante en la carcinogénesis inducida por el VPH, una hipótesis provocativa que aún no se ha demostrado (41). En los cánceres asociados a los VPH de alto riesgo las oncoproteínas E6 y E7 tienen como objetivo los mecanismos críticos de los procesos relacionados con la oncogénesis (proliferación ilimitada, independencia del factor de crecimiento, evasión de la apoptosis, inducción de la capacidad invasora y metastásica y la angiogénesis sostenida). Estos procesos son adquiridos por mutaciones genéticas debido a predisposición y / o la exposición a carcinógenos ambientales (VPH). Además, las oncoproteínas E6 y E7 actúan como inductores potentes de mutaciones mitóticas, aumentando así la probabilidad 36

37 de adquirir mutaciones celulares adicionales que contribuyen a la progresión cancerígena durante cada ronda de la división celular (42). De Sanjosé et al resumen el proceso de la oncogénesis cervical como se muestra en la figura 4. Figura 4. Oncogénesis cervical Papel de las oncoproteínas E6 y E7 en la oncogénesis Uno de los momentos cruciales en la transformación inducida por el VPH de alto riesgo es la expresión de oncoproteínas en las células de la capa basal. Tanto la proteína E6 como E7 son esenciales para inducir y mantener la transformación celular, debido a su interferencia en el control del ciclo celular y la apoptosis. La inestabilidad genómica se piensa que es una parte esencial de la transformación celular y se ha demostrado que la E6 y E7 en conjunto causan poliploidía poco después de que se introducen en las células. Esto parece ser el resultado de la desregulación de p53 a través de E6, y los miembros de la familia prb por E7 (43). 37

38 La inestabilidad genómica causada por el VPH permite a las células adquirir mutaciones adicionales, necesarias para la transformación maligna. La inestabilidad genómica en forma de poliploidía ha sido implicada como papel causal en la carcinogénesis cervical. La poliploidía no sólo se presenta como un evento temprano en la carcinogénesis cervical, sino también predispone a las células del cuello uterino a aneuploidía, una característica importante de los cánceres humanos. La progresión del ciclo celular está regulado en varios puntos de control cuyos defectos contribuyen a la inestabilidad genómica (44).. A. FUNCIONES DE LA PROTEÍNA E6 La proteína producto del gen E6 del VPH de alto riesgo interfiere con varias proteínas reguladoras del ciclo celular, la más estudiada es la unión a la proteína celular E6-AP que regula la transcripción en las células proliferantes, ocasionando una degradación proteolítica mediada por la ubiquitina del producto del gen p53 (45,46). La proteína p53, el guardián del genoma, es un factor de transcripción que juega un papel clave en la prevención del desarrollo del cáncer. En respuesta al estrés oncogénico o de otro tipo, la proteína p53 se activa y se regula la expresión de una serie de genes diana, lo que resulta en el secuestro del ciclo celular, la senescencia o apoptosis (47,48). La evasión de la apoptosis. La iniciación de la apoptosis por parte de la célula autónoma es un importante mecanismo de supresión tumoral, ya que asegura que la proliferación aberrante, y por lo tanto el desarrollo de las células potencialmente premalignas, sea detenida definitivamente. Muchos virus han desarrollado mecanismos para bloquear la inducción de la apoptosis, y esto puede, en algunos casos, permitir el desarrollo de tumores malignos. Para superar la actividad pro-apoptótica de p53 y permitir la progresión del ciclo celular, E6 se une a p53 en un complejo ternario con una ligasa llamada ubiquitina E6AP (46). 38

39 Como consecuencia de la formación de dicho complejo, E6 actúa de manera catalítica conduciendo a una gran disminución de la vida media de p53, de varias horas a menos de 20 minutos en los queratinocitos infectados (49). Dado que p53 regula los puntos de control G 1 / S y G 2 / M del ciclo celular, los resultados de la pérdida de sus funciones dan lugar a la interrupción de una importante respuesta celular al daño del ADN mediada por p53 y puede contribuir a la posterior acumulación de cambios genéticos asociados con la oncogénesis cervical (50). Estudios recientes han identificado funciones de E6 independientes de p53 que son importantes para la inmortalización de las células humanas. Las células normales somáticas humanas, a diferencia de las células cancerosas, se someten a un número limitado de divisiones celulares y, finalmente, dejan de dividirse a través del proceso conocido como senescencia replicativa celular. La senescencia celular puede ser un mecanismo supresor en las células tumorales humanas, y la inmortalización supone un paso límite en la velocidad de las células de las células cancerosas para desarrollarse y crecer. Un importante mecanismo de la senescencia celular consiste en el acortamiento de los telómeros, una estructura especializada en los extremos de los cromosomas. La mayoría de las células normales somáticas humanas no tienen un mecanismo para compensar la pérdida de los telómeros asociada con cada ronda de replicación del ADN. En contraste, las células de cáncer mantienen la longitud de los telómeros, principalmente a través de la activación de la telomerasa.el mantenimiento de los telómeros es esencial para el crecimiento de células cancerosas inmortales. Estos hallazgos han establecido un papel crucial de la regulación de la telomerasa y los telómeros en el envejecimiento celular humano, la inmortalización y la carcinogénesis. La telomerasa transcriptasa inversa humana (htert), es la clave determinante de la actividad enzimática de la telomerasa humana. Los datos recientes también sugieren que la oncogénesis viral implica la activación de la htert transcripción de genes (51). La oncoproteína E6 de los VPH de alto riesgo promueve la inmortalización celular mediante el aumento de los niveles de la telomerasa (52). 39

40 En un reciente estudio se ha podido demostrar que la regulación de la expresión de los genes htert está mediada por las interacciones de E6 y el gen Myc (53). De esta manera, las interacciones con otras proteínas además de p53 parecen ser esenciales para la inmortalización de las células cancerosas. Otra interacción tan importante parece ser la de E6 con la familia de las proteínas PDZ. Las proteínas PDZ contienen un dominio que se asocia con las proteínas PSD-95, DLG, y ZO-1 (de ahí el nombre de PDZ). El dominio PDZ se encuentra a menudo en proteínas localizadas en las áreas de contacto célulacélula, tales como uniones estrechas en las células epiteliales. La unión de los miembros del dominio PDZ al terminal C de la proteína E6 del VPH de alto riesgo produce la degradación de la proteína PDZ (39). En un reciente estudio, se ha podido demostrar que las interacciones de E6 con las proteínas de dominio PDZ se correlacionan con un subconjunto específico de propiedades oncogénicas, incluyendo la capacidad de E6 para inhibir la diferenciación epitelial, la inducción de tumores espontáneos, y contribuir en la carcinogénesis cutánea (54). El gen Notch1 es un factor determinante de la diferenciación de los queratinocitos y funciona como un supresor tumoral en la epidermis de los mamíferos. Se ha informado de que el gen Notch1 es una nueva diana de p53 y que puede ser regulada a la baja por E6 a través de la degradación de p53 en las células epiteliales normales humanos. De este modo, la regulación negativa de Notch 1 por E6 podría contribuir al desarrollo del cáncer cervical (55). B. FUNCIONES DE LA PROTEÍNA E7 Con excepción del complejo E1-E2, los virus del papiloma carecen de enzimas esenciales para la replicación del genoma viral; para este propósito deben utilizar la maquinaria de la célula huésped. En condiciones normales del epitelio, la síntesis de ADN celular ya no ocurre en las células epiteliales diferenciadas, por lo que son intrínsecamente incapaces de soportar la replicación del VPH. Las estrategias, que algunos virus del papiloma humano 40

41 han desarrollado para lograr que las células huésped puedan seguir soportando su replicación, contribuyen a sus actividades transformadoras. Las células infectadas que salen de la capa basal siguen siendo competentes para apoyar la síntesis de ADN en gran parte debido a las acciones de la proteína E7. Se ha demostrado que la capacidad de E7 del VPH16 para permitir que las células suprabasales sigan sintetizando ADN está ligada a su capacidad de unirse a los miembros de la familia de la proteína del retinoblastoma (prb) pero no con su capacidad para inducir su degradación (56). La característica más importante de la proteína E7 es su capacidad para unirse a los genes de la familia de la proteína del retinoblastoma (prb) (57). Junto con la prb, el producto proteico del gen del retinoblastoma (Rb), p107 y p130 representan una familia de proteínas relacionadas que juegan un papel fundamental en la regulación de la proliferación celular. Las funciones de p107, p130 y prb están acopladas a la del ciclo celular mediante la regulación de la transcripción. Los estudios in vivo de p107 y p130 han revelado que sus funciones se solapan ampliamente entre sí y con las de la prb (58). Una función importante de p53 es la activación de la expresión de varios genes reguladores que inducen la detención del ciclo celular en G1 / S y / o apoptosis en respuesta al daño del ADN, mientras que la función de prb y las proteínas relacionadas p107 y p130 es el control de la transición a la fase G1 / S del ciclo celular mediante la unión y la regulación de la actividad de la familia E2F de los factores de transcripción. En situaciones normales el complejo específico G1-pRb/E2F actúa como un represor transcripcional. En consecuencia, a través de estas interacciones, E7 libera los factores de transcripción E2F que estimulan a las células en reposo para volver a entrar en la fase S y replicarse, mientras que E6 impide la detención del crecimiento celular o el daño en el ADN inducido por apoptosis (59)(60). En conjunto, producen una proliferación ilimitada. Otro aspecto importante de las actividades oncogénicas de E7 del HPV16 es la desestabilización del supresor tumoral prb a través de un mecanismo ubiquitina-proteosoma dependiente (61). La inducción de la gradación aberrante de prb por la proteína E7 del VPH de alto riesgo y la consiguiente activación de la transcripción mediada por E2F representan un importante 41

42 mecanismo por el cual estos virus logran mantener la competencia de la fase S en las células epiteliales diferenciadas. Muchas otras actividades de la proteína E7 han sido propuestas en los estudios in vitro. Sin embargo, estudios recientes demuestran que la inactivación de la prb se requiere para casi todos los efectos agudos in vivo de E7 y que los mecanismos de acción de E7 independientes de prb tienen pocos efectos agudos in vivo cuando se mantiene la función de prb (62). Inducción de la inestabilidad genética. La estabilidad genética se mantiene, en parte, por el estricto control de la duplicación de los centríolos del centrosoma. Los centríolos son las unidades básicas de formación de centrosomas, orgánulos celulares que desempeñan un papel fundamental en la formación de los cilios y los polos del huso mitótico. El centrosoma se duplica exactamente sólo una vez antes de la mitosis para formar dos polos del huso. La desviación de esta norma tiene consecuencias potencialmente catastróficas, ya que puede dar lugar a los polos supernumerarios del huso y a una división celular defectuosa (63). La oncoproteína E7 del VPH de alto riesgo que degrada prb induce un aumento de la síntesis del centriolo, dando lugar a un número anormal de centrosomas antes de la aparición de extensas anomalías nucleares. En las células que expresan E6 del VPH de alto riesgo que inactiva p53, se observó la acumulación de un número anormal de centrosomas en paralelo con atipia nuclear, principalmente multinucleación. Debido a que los cánceres de cuello expresan tanto E6 como E7, ambos procesos, la duplicación anormal del centrosoma y la acumulación de un número anormal de centrosomas, son activados durante la carcinogénesis asociada al VPH de alto riesgo. La oncoproteína E7 del VPH de alto riesgo actúa como fuerza motriz de los defectos mitóticos del centrosoma relacionados con la inestabilidad genómica y mediante la inducción de la síntesis de centríolos anormales, mientras que la expresión de E6 aumenta la probabilidad de que estas células anormales mantengan actividad proliferativa y por lo tanto de que se acumulen anomalías nucleares. Estos hallazgos tienen implicaciones generales para la inducción y la propagación de la inestabilidad genómica en la carcinogénesis humana (64). 42

43 Durante la progresión carcinogénica, el genoma del VPH con frecuencia se integra en un cromosoma de la célula huésped y, como resultado, las oncoproteínas virales E6 y E7, son las únicas proteínas virales que son constantemente expresadas en los carcinomas cervicales HPV positivos (65). De esta manera, la infección persistente por el VPH de alto riesgo y la integración del genoma viral en el cromosoma de la célula huésped, seguida por una sobreexpresión de las oncoproteínas E6 y E7 del VPH, aumenta el riesgo de acumulación de de cambios genéticos que en última instancia, pueden llegar a un umbral crítico necesario para la conversión maligna (66). Las investigaciones realizadas durante los últimos años han demostrado que la proliferación aberrante puede sentar las bases para la inestabilidad genómica y el control de la progresión maligna, mediante la alteración de la duplicación del centrosoma y de la dinámica normal de la replicación del ADN (67). La angiogénesis. La angiogénesis es un proceso crítico en la progresión tumoral que asegura que el crecimiento rápido de los tumores pueda ser sostenido por un suministro adecuado de oxígeno y nutrientes. El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es conocido por ser uno de los inductores más importantes de la angiogénesis. E6 regula al alza la actividad del promotor de VEGF, y lo hace de una manera independiente de p53 (68). Datos recientes sugieren que la oncoproteína E7 del VPH de alto riesgo también produce mayores niveles de VEGF, y que es independiente de la prb (69). FGF-BP (Fibroblast growth factor binding protein) puede ser un factor regulador de la velocidad del crecimiento tumoral y de la angiogénesis. Recientes estudios han demostrado que la expresión de FGF-BP es regulada en las fases tempranas de oncogénesis, lo que indica que la función de FGF-BP en la angiogénesis es un paso crítico temprano en el desarrollo y progresión de tumores. La expresión estable del oncogén E6 del VPH 16 conduce a una activación del promotor de FGF-BP en los queratinocitos primarios (70). 43

44 1.4. CLASIFICACIÓN ANATOMOPATOLÓGICA DE CIN El concepto de precursores del cáncer cervical se remonta al final del siglo XIX, cuando se reconocieron zonas de cambios epiteliales atípicos no invasores en muestras de tejidos adyacentes a cánceres invasores (William, 1888). El término carcinoma in situ (CIS) se introdujo en 1932 para denotar las lesiones en las cuales las células carcinomatosas indiferenciadas abarcaban todo el espesor del epitelio, sin interrumpir la membrana basal (Broders, 1932). Ulteriormente se comunicó la asociación entre CIS y cáncer invasor del cuello uterino. El término displasia se introdujo a finales de los años cincuenta para designar la atipia epitelial cervical intermedia entre el epitelio normal y el CIS (Reagan et al., 1953). La displasia se categorizó en tres grupos leve, moderada y pronunciada según el grado de afectación de la capa epitelial por las células atípicas. En estudios de seguimiento de pacientes con displasias, se observó que algunos casos de displasia retrocedían, algunos persistían y otros progresaban a CIS. Se observó una correlación directa entre la progresión y el grado histológico. Estas observaciones condujeron al concepto de un solo proceso mórbido continuo en el que el epitelio normal evoluciona a lesiones epiteliales precursoras y a cáncer invasor. Sobre la base de dichas observaciones, en 1968 se introdujo el término de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) para denotar las múltiples posibilidades de atipia celular confinada al epitelio. En 1968, Richart MC dividió la neoplasia intraepitelial cervical en los grados 1, 2 y 3. CIN 1 correspondía a la displasia leve, CIN 2 a la displasia moderada y CIN 3 a la displasia grave y al CIS. En los años ochenta fueron reconociéndose cada vez más alteraciones anatomopatológicas como la atipia coilocítica o condilomatosa asociada con la infección por virus del papiloma humano (VPH). Los coilocitos son células atípicas con una cavitación o halo perinuclear en el citoplasma, que indica cambios citopáticos debidos a la infección por el VPH. Esto condujo al desarrollo de un sistema histológico simplificado en dos grados. En 1990 se propuso una terminología histopatológica basada en dos grados de la enfermedad: CIN de bajo grado, que comprendía las anomalías compatibles 44

45 con atipia coilocítica y las lesiones CIN 1, y CIN de alto grado que comprendía CIN 2 y CIN 3. Se consideró que las lesiones de alto grado eran precursoras reales del cáncer invasor(1). En 1988, el Instituto Nacional del Cáncer de los EE.UU. convocó un seminario para proponer un nuevo esquema de presentación de los resultados de la citología cervical (informe del seminario del Instituto Nacional del Cáncer). Las recomendaciones hechas entonces y su revisión en un segundo seminario celebrado en 1991 fueron denominadas Sistema Bethesda (TBS) (informe del taller del Instituto Nacional del Cáncer, 1992). La característica principal del TBS fue la creación del término squamos intraepitelial lesion (SIL) (lesión intraepitelial escamosa), con dos grados: lesiones de bajo grado (L-SIL) y lesiones de alto grado (H-SIL). La clasificación TBS combina los cambios condilomatosos planos (VPH) y la CIN de bajo grado (CIN 1) en L-SIL, mientras que el H-SIL abarca CIN 2 y CIN 3. Se empleó el término lesión para recalcar que los cambios morfológicos en los cuales se basa un diagnóstico no necesariamente significan proceso neoplásico. El TBS fue diseñado para la notificación citológica, pero sirve también para comunicar resultados histopatológicos. Se utiliza sobre todo en América del Norte (71) El sistema Bethesda 2001 El Sistema Bethesda para informar los resultados de la citología cervical fue desarrollado como un sistema uniforme de la terminología para proporcionar una orientación clara del manejo clínico. Con el aumento de la utilización de nuevas tecnologías y los resultados recientes de estudios de investigación, en 2001 se consideró un momento oportuno para reevaluar el sistema Bethesda (2). En el sistema Bethesda de 2001, las lesiones escamosas potencialmente premalignas se dividen en 3 categorías: células escamosas atípicas (ASC), 45

46 lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL) y lesión intraepitelial alto grado (HSIL).La categoría ASC se divide en 2 categorías: las de significado incierto (ASCUS) y aquellas en las que deben ser excluidas las lesiones de alto grado (ASC-H). En la revisión se elimina la categoría "cambios celulares benignos", que ahora se conoce como "negativos para lesión intraepitelial o malignidad". La revisión también perfeccionó los criterios de epitelio glandular anormal, incluyendo células glandulares atípicas (AGC). La principal modificación en la actualización del sistema es la revisión de la categoría ASC, que se hizo para promover la vigilancia más intensa de las mujeres y la detección cuando existe una sospecha real de una lesión de alto grado (72). La clasificación Bethesda de 2001 incluye dos categorías de células escamosas atípicas (ASC): las de significado indeterminado (ASCUS) y en las que no se puede excluir una lesión de alto grado (ASC-H). Células escamosas atípicas (ASC) engloba todas aquellas anomalías celulares más importantes que las atribuibles a cambios reactivos, pero que cuantitativa o cualitativamente no cumplen los criterios para el diagnóstico de un SIL. Los cambios celulares en la categoría ASC pueden reflejar, bien un cambio benigno exuberante, o una lesión neoplásica que no es posible clasificar con seguridad. También incluye alteraciones morfológicas de gravedad, pero que son cuantitativamente insuficientes para hacer un diagnóstico de HSIL, ya que solo existen una o dos células diagnósticas (73). ASCUS. Atipia escamosa de significado indeterminado. Alteración citológica consistente en el agrandamiento del núcleo de la célula escamosa, con ligero aumento de la relación nucleo-citoplasma, con ligera hipercromasia. Puede haber binucleación. La versión 2001 del Sistema Bethesda define ASCUS como alteraciones citológicas sugestivas de una lesión intraepitelial, pero cuantitativa y/o cualitativamente insuficientes para una interpretación definitiva. ASC-H. Alteraciones catalogadas como ASCUS que son muy sugestivas de HSIL pero no concluyentes (mayor hipercromasía, afectación de células en capas bajas, etc). Los estudios sugieren que ASC-H tiene un valor predictivo 46

47 positivo para el diagnóstico histológico CIN 2 ó 3 intermedio entre ASC-US y SIL de alto grado (2). Lesiones intraepiteliales escamosas. Una de las mejores aportaciones del Sistema Bethesda ha sido englobar las lesiones intraepiteliales en dos categorías. La división dicotómica de SIL refleja la importante evidencia virológica, molecular y clínica de que LSIL es generalmente una infección transitoria por el VPH, mientras que HSIL está más a menudo asociado con la persistencia viral y un mayor riesgo de progresión. LSILy HSIL tienen un punto de corte en el diagnóstico bastante reproducible (2). Lesiones glandulares. El término " células glandulares atípicas de significado indeterminado " ( AGUS ) ha sido cambiado por células glandulares atípicas (AGC) para evitar confusiones con ASC-US (72). AGC son aquellas células con atipia nuclear que sugieren un adenocarcinoma in situ pero no cumplen todos los criterios de éste. El hallazgo de células glandulares atípicas de significado indeterminado en la prueba de Papanicolaou se ha correlacionado con lesiones preinvasoras o invasoras en el 32% de los casos (74) Características histológicas de las lesiones escamosas Tradicionalmente, las anomalías cervicales intraepiteliales se han clasificado en CIN 1, CIN 2 y CIN 3, dependiendo del grado de diferenciación. Desde el punto de vista clínico es muy importante tener una visión clara de lo que constituye CIN1 y de los criterios para el diagnóstico de una lesión de mayor grado (CIN 2-3), puesto que, el abordaje terapéutico es distinto en cada caso. El diagnóstico de CIN está basado en rasgos histológicos, incluyendo la diferenciación, la maduración y la estratificación de las células y las anomalías nucleares. Dentro de las anomalías nucleares encontramos los núcleos grandes y la hipercromasia. En el CIN 1, las células indiferenciadas se limitan a la capa inferior del epitelio. Se deben observar correlaciones morfológicas de la estabilidad genómica, 47

48 incluyendo el crecimiento uniforme con una separación nuclear regular, distribución uniforme de la cromatina y bajo índice mitótico. El diagnóstico de CIN 2-3 debe basarse en la presencia de cualquier atipia nuclear en las capas celulares más bajas, suficiente para justificar un diagnóstico de HSIL en la citología o en la presencia de mitosis anormales. La superposición nuclear, la pérdida de la polaridad, el índice mitótico alto, y la mitosis en capas epiteliales superiores también reflejan el impacto de la expresión de los oncogenes del HPV en la replicación de la población de las células, que por definición debe estar alterada para colocar a la paciente en una situación de riesgo de progresión de la lesión (75, 76). Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, actualmente, se puede hablar de sólo dos categorías biológicamente diferentes: neoplasia intraepitelial cervical de bajo grado (L-CIN) y neoplasia intraepitelial cervical de alto grado (H-CIN). Esta modificación está incluida en el sistema Bethesda de los diagnósticos citológicos de lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (L-SIL) y de lesión intraepitelial escamosa de alto grado (H-SIL) (77). En el apartado L- SIL se incluye la displasia leve o CIN1 y los cambios inducidos por la infección del VPH, HSIL incluye la displasia moderada o CIN 2 y la displasia grave/carcinoma in situ o CIN 3 (Figura 5). Figura 5. (a) Epitelio normal; (b) CIN 1; (c) CIN 2 y (d) CIN 3. En Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, Vinay Kumar, Abul Abbas, Nelson Fausto, and Jon Aster, Chapter 22 The Female Genital Tract, Figure Spectrum of cervical intraepithelial neoplasia, p

49 1.5. MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Las manifestaciones clínicas de la neoplasia intraepitelial cervical son escasas. El sangrado espontáneo fuera de la regla y el sangrado postcoital pueden estar relacionados con la neoplasia intraepitelial cervical. El sangrado después del coito puede surgir a partir del cuello del útero u otra parte del área genital, puede ser de etiología benigna o maligna. El epitelio cervical asociado con la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) y el cáncer invasivo (más comúnmente del tipo escamoso) es delgado y friable, se desprenden fácilmente del cuello del útero. En las mujeres con sangrado después del coito, se encuentra CIN en el 7% a 10% y cáncer de cuello uterino, vaginal o de endometrio en menos del 1%. Las mujeres con sangrado postcoital sin explicación deben ser remitidas a un ginecólogo para un examen colposcópico (78) DIAGNÓSTICO Las manifestaciones de la neoplasia intraepitelial cervical son subclínicas y, normalmente, son evidenciadas a través de medios químicos, estudios citológicos o aumento óptico. La confirmación requiere de estudio histológico Cribado del cáncer de cuello de útero El cáncer de cuello de útero es de las pocas enfermedades cancerígenas que cumple con los requisitos para ser objeto de un programa de cribado: tiene graves repercusiones en la salud pública, tiene un estadio presintomático capaz de ser detectado, las pruebas de detección son sencillas, baratas, inocuas, sensibles, específicas, bien aceptadas por la población destinataria; el tratamiento de la enfermedad presintomática es favorable, las pruebas adicionales y el tratamiento que se necesitan están disponibles, son accesibles y económicas para las personas con resultados positivos. 49

50 Los programas de cribado solo tendrán éxito si existen los siguientes elementos: Elevada cobertura (80 %) de la población expuesta a la enfermedad; Adecuado seguimiento y tratamiento de las personas con cribado positivo. Los esfuerzos por aumentar la cobertura serán en vano si estas personas no reciben el seguimiento necesario. Vinculación eficaz entre los componentes de los programas (p. ej: desde el cribado hasta el diagnóstico y el tratamiento); Cobertura, pruebas de detección, diagnóstico, tratamiento y seguimiento de calidad óptima; Recursos adecuados La citología La citología cervical es un método utilizado para la prevención secundaria del cáncer de cuello de útero. Las iniciativas de prevención del cáncer de cuello uterino han tenido un gran éxito en muchos países desarrollados. En algunos países, como los EE.UU., la aplicación generalizada de la prueba de Papanicolaou ha reducido las tasas de cáncer cervical en casi un 80% en los últimos 50 años. En Inglaterra las mejoras en el programa de detección precoz del cáncer de cuello de útero han llevado a una disminución del 35% en la incidencia de enfermedad invasiva (79). La implantación de programas de citología de amplia cobertura ha tenido un efecto en la disminución de las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer de cuello de útero gracias a la detección y tratamiento de las lesiones precancerosas y los cánceres en estadio incipiente. Desafortunadamente, los países en vías de desarrollo no han podido beneficiarse de las ventajas del cribado por falta de recursos (80). 50

51 A. Rendimiento clínico de la citología La citología cervical es relativamente insensible para la detección de lesiones precancerígenas y del cáncer cervical y debe repetirse con frecuencia para alcanzar efectividad (80). Según un metanálisis que incluyo 94 estudios que compararon la prueba de Papanicolaou convencional con un patrón de referencia (histología) para las pruebas de Papanicolau convencionales, las estimaciones de sensibilidad y especificidad fueron muy variable en los estudios individuales. La calidad metodológica y la frecuencia de anormalidades histológicas vario mucho entre los estudios. En 12 estudios con las estimaciones menos sesgadas, la sensibilidad fue del 30% al 87% y la especificidad varió del 86% al 100%.Las mejores estimaciones sugieren que la citología convencional sólo es moderadamente exacta y no alcanza una sensibilidad y especificidad elevadas al mismo tiempo (81). En otra revisión de estudios europeos y norteamericanos que incluyó a más de mujeres, la sensibilidad en las mujeres mayores de 50 años fue del 79,3%, mientras que la sensibilidad en mujeres más jóvenes se situó en el 59,6% (82). Las importantes diferencias en la sensibilidad de la citología para la detección de de cáncer y pre-cáncer es atribuida, por la mayoría de los autores, al carácter subjetivo de la interpretación de la citología. En cualquier caso, la sensibilidad de la citología es limitada y para la detección de lesiones premalignas se ha recurrido a la repetición periódica de la prueba. Otra de las limitaciones de la citología es su falta de reproducibilidad. En un estudio con la finalidad de determinar la reproducibilidad de los procedimientos citológicos, histológicos colposcópicos, y de escisión electroquirúrgica (LEEP) se compararon las interpretaciones de muestras cervicales entre varios observadores bien entrenados. La variabilidad interpretativa fue importante para todo tipo de muestras cérvico-uterinas. La histopatología de las biopsias de cuello uterino no fue más reproducible que la citología de monocapa, e incluso la interpretación de los resultados de LEEP fue variable (83). 51

52 B. Citología en base líquida. En este tipo de procedimiento la muestra es depositada directamente en un recipiente que contiene un conservante. Las células son posteriormente aspiradas a través de un filtro y teñidas. En un reciente estudio donde se comparó el rendimiento de la citología convencional con la citología en base líquida en un grupo de mujeres la tasa de muestras insatisfactorias fue significativamente menor con la citología en base líquida (0,13% vs 0,89%, p <0,0001). La detección de ASCUS fue significativamente mayor con citología en base líquida (2,97% vs 1,64%, p <0,0001). El porcentaje de anomalías histológicas en las muestras con ASCUS fue aproximadamente igual en ambos grupos, lo que indica que se detectaron más casos reales de anomalía mediante la citología en base líquida. La sensibilidad de la detección de una lesión histológica probada es significativamente mayor en la cohorte de base líquida en comparación con la cohorte convencional (96,2% frente a 92,0%), con sólo una ligera diferencia en la especificidad (97,8% frente a 98,2%) (84). Sin embargo, en un meta-análisis publicado en 2008 donde se compara el rendimiento de las pruebas de citología cervical convencional y en base líquida llegan a la conclusión de que la citología cérvico-vaginal en base líquida no es ni más sensible ni más específica para la detección neoplasia intraepitelial cervical de alto grado en comparación con la prueba de Papanicolaou convencional (85). Una de las ventajas establecidas de la citología en base líquida es la posibilidad de utilizar el líquido residual para pruebas adicionales, como la prueba de detección del VPH en aquellas pacientes con resultado de ASCUS. Respecto a la relación coste-efectividad de la CBL en comparación con la citología convencional, existen argumentos sólidos a favor de la CBL (86). Otro de los avances tecnológicos es la automatización de la lectura de las citologías. En el estudio MAVARIC que comparan el cribado cervical con automatización asistida y el manual, el principal hallazgo fue que la lectura automatizada era un 6,3% menos sensible en términos absolutos. Las lecturas automática y manual fueron muy similares en términos de coste-eficacia. Los autores llegan a la conclusión de que la sensibilidad significativamente reducida de lectura automatizada, combinado con la incertidumbre sobre el coste- 52

53 efectividad, sugiere que no hay justificación para recomendar su introducción para el cribado cervical primario (87) Pruebas de detección de ADN del VPH Desde el reconocimiento de la infección por el VPH como causa necesaria para el desarrollo del cáncer de cuello de útero, se han abierto nuevas posibilidades en el cribado mediante pruebas de detección del VPH. Como ya se ha comentado anteriormente, el cribado citológico tiene una sensibilidad limitada. Varios estudios han demostrado que la prueba del VPH es más sensible que la citología en el cribado cervical primario. En un estudio que incluyó más de mujeres, se compararon la sensibilidad y la especificidad de la prueba de VPH con la citología de rutina, tanto en general como para las edades de <35 años, años y >50 años. La prueba del VPH fue sustancialmente más sensible en la detección de CIN 2+ que la citología (96,1% vs 53,0%) pero menos específica (90,7% vs 96,3%). La sensibilidad del VPH fue uniformemente alta en todas las edades, mientras que la sensibilidad de la citología fue sustancialmente mejor en las mujeres mayores de 50 años que en mujeres más jóvenes (79,3% vs 59,6%). La especificidad de ambas pruebas aumentó con la edad. La baja especificidad de la prueba del VPH en mujeres jóvenes se debe a una mayor prevalencia de infecciones transitorias. Estos resultados apoyan el uso de la prueba del VPH como la única prueba de selección primaria, con la citología reservada para las mujeres que dan HPV positivo (88). Como podemos ver, la especificidad de la prueba de VPH es menor que la citología, y esto puede ocasionar problemas: mayor ansiedad de las pacientes, mayor número de pruebas que hay que repetir, mayor derivación para pruebas confirmatorias y tratamientos innecesarios. Con la idea de mitigar este problema se han ideado opciones de cribado. 53

54 Cribado citológico y detección del ADN del VPH En un análisis de cohorte de 10 años se evaluó si la realización de una prueba de Papanicolaou con una determinación simultánea del VPH es útil para evaluar el riesgo de neoplasia intraepitelial cervical grado 3 o cáncer cervical. El tiempo de seguimiento fue dividido en un período inicial de 9 meses seguidos de intervalos de un año para un tiempo total de 122 meses. Entre las mujeres con un resultado inicial de la prueba de Papanicolau ASC o peor, la incidencia de CIN3 o cáncer fue de 7,82% (IC 95%: 5,76% - 9,88%) en el primer intervalo de tiempo y la incidencia acumulada fue de 10,22% (IC 95%: 7,56% - 12,88%) para todo el período de seguimiento. Entre las mujeres con una prueba de HPV positiva, la incidencia de CIN 3 o cáncer fue de 1,73% (IC 95%: 1,26% - 2,20%) para el primer intervalo de tiempo y el 6,92% (IC 95%: 5,49% - 8,35%) para todo el período de seguimiento. En las mujeres de 29 años o menores, la tasa de incidencia acumulada fue de 4,07%(IC 95%: 2,37-6,99) en comparación con el 10,93% (IC 95%: 5,84-20,43) de las mujeres de años de edad y el 8,77 (IC del 95%: 4,20-18,34) de las mujeres mayores de 40 años. Entre las mujeres positivas para las dos pruebas, la incidencia acumulada de CIN 3 o cáncer fue de 4,54% (IC 95%: 3,61% - 5,46%) a los 45 meses, en comparación con el 0,16% (IC 95%: 0,08% - 0,24%) de las mujeres con ambas pruebas negativas. La incidencia acumulada a los 122 meses para las mujeres consideradas positivas para la prueba combinada fue del 6,83% (IC 95%: 5,50% - 8,16%) en comparación con el 0,79% (IC 95%: 0,54% - 1,04%) para las que se consideran negativas. El valor predictivo negativo para la prueba combinada fue de 99,21% (89). Este resultado supone que de mujeres con citología y test de VPH negativos, sólo 9 desarrollarán CIN 3+ a lo largo de 5 años. Basados en estos datos, la FDA ha aprobado el uso del test de VPH de alto riesgo como complemento del cribado cervical citológico en mujeres mayores de 30 años. En los Estados Unidos se ha llegado a un consenso basado en la revisión de la literatura y la opinión de expertos. Las conclusiones fueron que las pruebas 54

55 de ADN del VPH se pueden añadir a la citología cervical en mujeres de 30 años o mayores. Las mujeres cuyos resultados son negativos tanto para las pruebas de ADN del VPH, como para la citología, no deben ser controladas de nuevo antes de los 3 años. Las mujeres cuyos resultados son negativos para la citología, pero positivas para ADN del VPH de alto riesgo, tienen un riesgo relativamente bajo de tener neoplasia cervical de alto grado y la colposcopia no se debe realizar de forma rutinaria en este contexto. En cambio, aconsejan repetir la citología y la detección de VPH entre 6 y 12 meses (90). De este modo, el aumento de la sensibilidad de la prueba del VPH ha llevado a varios grupos en los Estados Unidos a recomendar su uso en combinación con la citología como una forma de extender los intervalos de cribado con seguridad La detección del ADN del VPH como prueba de cribado primario La prueba del HPV es más sensible que la citología para la detección de CIN de alto grado. Sin embargo, es menos específica que la citología. Los principios básicos sugieren que el uso más apropiado de las dos pruebas es realizar primero la prueba más sensible y seguir con la prueba más específica para las personas que dan positivo con la primera (88). En el ensayo aleatorio llevado a cabo en Suecia para evaluar la eficacia de 11 posibles estrategias de cribado de cuello uterino que se basan en las pruebas de ADN del VPH, las pruebas de citología sola, y el ADN del VPH junto con la citología en mujeres entre años, se observó un incremento del 30% de la sensibilidad para la detección de CIN 3 o peor con la prueba de ADN del VPH seguido de cribado citológico y repetición de la prueba del VPH en aquellas mujeres con la prueba de ADN del HPV positivas y citología normal, en comparación con la citología. Se mantuvo un alto VPP con un aumento del 12% del número de pruebas de detección. Los autores concluyen que el cribado primario basado en la detección del AND del VPH con selección citológica posterior y la repetición del test de ADN del VPH en las mujeres con citología negativa parece ser la estrategia de cribado más factible (91,92). 55

56 Cuzick y colaboradores describen las ventajas de la detección del VPH como única modalidad de cribado primario: A. Son pruebas automatizadas, objetivas y sensibles. B. La citología se reserva para las pacientes VPH positivas. Esto supone citologías de alta calidad y menor número de personal especializado. C. Evita el cribado innecesario de pacientes con ASCUS/LSIL negativas para VPH. D. Posibilidad de alargar los intervalos entre las pruebas Manejo de los resultados positivos del cribado Existe el acuerdo generalizado respecto al manejo de las pacientes con diagnóstico de HSIL. Se tratará más adelante. No existe un acuerdo universal para la gestión de LSIL o ASCUS. La mayoría de las lesiones de bajo grado regresan espontáneamente. Sin embargo, una pequeña, pero importante parte, pueden tener CIN 2-3, o incluso carcinoma Pacientes con ASCUS en la citología Con la idea de mejorar la correcta evaluación y manejo de estas pacientes, el Instituto Nacional del Cáncer de Los Estados Unidos llevó a cabo el estudio ALTS (ASCUS-L-SIL Triage Study). ALTS es un estudio multicéntrico, ensayo clínico aleatorio diseñado para evaluar 3 métodos alternativos de gestión, a saber, la colposcopia inmediata, citología de seguimiento, y de selección de pacientes con pruebas de ADN del VPH. Las pacientes con ASCUS (n = 3488) o LSIL (n = 1572) fueron asignados al azar a los brazos de investigación entre noviembre de 1996 y diciembre de 1998, y fueron controlados durante 2 años. Para las mujeres con ASCUS el cribado del VPH resultó útil, con una sensibilidad equivalente a una colposcopia inmediata y redujo a la mitad las derivaciones colposcópicas (93). 56

57 En el caso de las mujeres con LSIL, la mayoría son VPH positivas y, por lo tanto, esta prueba no permite hacer ningún tipo de selección. Estos datos han sido confirmados en un metanálisis que incluyó 16 estudios de mujeres con ASCUS. No se ha encontrado CIN 2 ó más en mujeres con ASCUS y test de VPH negativo (94). En un reciente meta-análisis donde se valoró la precisión del test Hybrid Capture 2 para la clasificación de las mujeres con ASCUS, se informó de una sensibilidad del 93,1% para CIN 2 y del 95,5% para CIN 3. La especificidad fue del 62,3% cuando el resultado fue CIN 2 y del 60% para CIN 3 (82) Pacientes con LSIL en la citología LSIL suele ser una manifestación de la infección por VPH con bajo potencial de transformación maligna. Como se comentó anteriormente, la prueba de detección del ADN de VPH es casi siempre positiva. En el estudio ALTS la especificidad para CIN 2+ fue del 16% para mujeres menores de 29 años y del 30% para mayores de 29 años. En el citado meta-análisis (82) la positividad del VPH en pacientes con LSIL es muy alta en mujeres jóvenes, ofreciendo el test de VPH pocos beneficios adicionales. Sin embargo, para mujeres de 35 años o mayores, las pruebas de ADN de VPH son más específicas con el potencial de evitar el 50% de las colposcopias y podrían convertirse en una opción atractiva. La Sociedad Americana de Colposcopia y Patología Cervical propone la derivación a colposcopia de las pacientes con LSIL Otras alternativas de cribado Cribado primario con test de detección de ADN del VPH Como se ha comentado anteriormente, otra posibilidad de cribado primario es la utilización del test de VPH como prueba única. Los autores que propugnan esta idea sugieren un posible algoritmo. Realizar el test de VPH a mujeres 57

58 entre 25 y 64 años, control en 5 años a las pacientes con test negativo y hacer citología en pacientes con el test de VPH positivos (92) Auto-toma de muestra para el test de ADN del VPH Una de las nuevas alternativas en el cribado del cáncer de cuello de útero que se están estudiando en la actualidad es el análisis del ADN del HPV en muestras que son recogidas por la propia paciente. En una revisión de los estudios publicados hasta 2005 los autores encuentran una sensibilidad del 74% y una especificidad del 88% (95). Aunque, la sensibilidad referida es superior a la de la citología, es inferior a la de la detección del ADN del VPH por un especialista. Estos datos han sido confirmados en un estudio publicado en 2010, en donde también encuentran una menor especificidad de las auto-tomas frente a la del especialista (96). A pesar de todo lo expuesto anteriormente, se considera que la auto-toma de muestras para el análisis del ADN del VPH podría suponer un método valioso para aquellas mujeres que rechazan en cribado médico o para el cribado en regiones con bajos recursos Auto-toma de muestras y posterior clasificación con citología Otra opción que se está estudiando es el cribado con auto-toma de muestras y posterior clasificación con citología en caso de que el test de VPH sea positivo. En una población de mujeres jóvenes y sexualmente activas en los EE.UU., una estrategia combinada de auto-toma de muestras de vagina para la detección del ADN del VPH de alto riesgo con la clasificación citológica de las mujeres VPH positivas tuvo una sensibilidad y especificidad comparable a la citología basada en el cribado. Esta estrategia combinada era potencialmente rentable cuando se realiza cada tres años o cada dos años y puede ser considerada como una alternativa de detección rentable para aumentar la comodidad y la accesibilidad de los actuales programas de cribado basados en la citología (97). 58

59 Detección del ARNm de E6 y E7 en cribado primario Como ya se ha comentado en otros apartados, la sobreexpresión de las oncoproteínas virales E6 y E7 constituye un evento necesario para el desarrollo del cáncer. Las pruebas que detectan la presencia de E6 y E7 son indicadores de progresión y, por tanto, son más específicas que la simple detección del ADN del VPH. En la actualidad existen tres tipos de pruebas para la detección de la expresión de E6 y E7 del VPH: Pre Tect HPV-proofer, Aptima HPV test y Onco-tect. PreTect HPV-proofer es una prueba de tipo específico que detecta el ARNm de E6 y E7 de los cinco tipos más frecuentes del VPH de alto riesgo oncogénico (16, 18, 31, 33 y 45). En un estudio reciente en el que comparan el rendimiento clínico de PreTect VPH-Proofer como una prueba de cribado, la prueba de ADN del VPH y la citología para detectar CIN 2 o más los autores llegan a las siguientes conclusiones: La detección del ARNm de E6/E7 del VPH presenta una mayor especificidad pero menor sensibilidad que la prueba del ADN del VPH para la detección de CIN2 o más. Cuando se utiliza como prueba de clasificación, la prueba reduce drásticamente las colposcopias, tanto en ASC-US como en L-SIL, mientras que el ADN del VPH puede ser utilizado sólo para la clasificación de ASC- US. Además, la prueba de ARNm, cuando se aplica en la clasificación de pacientes con test de ADN de VPH positivas, reduce la remisión a colposcopia más que la citología. Sin embargo, la baja sensibilidad para lesiones CIN 2 o más requiere un seguimiento estricto cercano de las mujeres ADN positivas/ ARNm negativas (98). Aptima (Gen-Probe Inc) detecta el ARNm de E6 y E7 de 14 tipos de VPH de alto riesgo oncogénico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y68) de manera colectiva a partir de muestras cérvico-uterinas líquidas. En un estudio llevado a cabo con mujeres remitidas para cribado se comparó el rendimiento clínico de Aptima con la de de la prueba de ADN Hybrid Capture 2 59

60 (HC2, Qiagen). Tanto Aptima como HC2 tuvieron una sensibilidad del 100%. La especificidad fue del 88,3 (IC del 95%: 86,6-90,0) y 85,3 % (IC del 95%: 83,5-87,3), respectivamente. En el grupo de mujeres mayores de 30 años (n = 835) Aptima mostró una especificidad del 93,9% (IC del 95%: el 92,3-95,5), mientras que HC2 mostró una especificidad del 92,1% (IC del 95%: ) (p <0,05). Las cifras correspondientes a mujeres menores de 30 años de edad (n = 521) fueron 79,5% (IC del 95%: 75,8-82,8) y 74,1% (IC del 95%: 70,3-77,9), respectivamente (P <0,05). En conclusión, la prueba Aptima es tan sensible como HC2, pero más específica para la detección de CIN 2 o más y puede servir como una prueba confiable para el cribado primario del cáncer de cuello uterino (99). HPV OncoTect es un método de diagnóstico para la detección del ARNm de las oncoproteínas E6 y E7 del VPH. Emplea la técnica de hibridación in situ para detectar la expresión de los oncogenes E6 y E7 del virus del papiloma humano. Las oncoproteínas E6 y E7 son un factor común para el desarrollo del cáncer de cérvix, independientemente del tipo viral que lo cause, por lo que su detección permite obtener valores superiores de especificidad y de valor predictivo positivo. La lectura de muestras es automatizada mediante citometría de flujo, técnica que permite el análisis célula a célula para la obtención de resultados más precisos de manera rápida y fiable. En un estudio reciente donde se comparó el rendimiento de la citología, la detección del ADN del VPH (HC2) y la cuantificación de ARNm de E6 y E7 del VPH HPV (Onco Tect) en muestras, la sensibilidad de HC2 para CIN 2 o más fue de 89% y la sensibilidad de la cuantificación del mrna de E6 y E7 fue de aproximadamente el 84%. El valor predictivo positivo de la cuantificación de ARNm de E6 y E7 en las células para CIN2 o más fue del 78% que era mayor que el del ADN del VPH sola (43%). La especificidad de la cuantificación ARNm de E6 y E7 para CIN 2 histológico fue del 85% frente al 35% de HC2. Según los autores de este estudio esta nueva tecnología cuantitativa aumenta la especificidad y valor predictivo positivo del cribado del cáncer de cuello uterino con poca o ninguna pérdida de sensibilidad (100). 60

61 Detección de p16 La proteína p16ink4a (p16) es un inhibidor de la cinasa dependiente de G1 ciclina cuya expresión es regulada negativamente por prb. La proteína p16 se expresa en líneas celulares de cáncer cervical en la que el gen Rb, no es funcional, ya sea como una consecuencia de la mutación de Rb o expresión de la proteína E7 del virus del papiloma humano (101). La p16 podría resultar especialmente útil en mujeres con resultados de LSIL, donde el cribado por VPH es menos eficiente y en el cribado de mujeres VPH positivas (92). En un reciente meta-análisis de todos los estudios que evaluaron el uso de p16 en muestras citológicas o histológicas del cuello uterino, la proporción de los extendidos cervicales que sobre-expresan p16 aumentó con la gravedad de la anomalía citológica. Entre las citologías normales, sólo el 12% fueron positivas para el marcador en comparación con el 45% en los ASCUS y LSIL y el 89% en los HSIL. Del mismo modo, en la histología sólo el 2% de las biopsias normales y el 38% de CIN 1 mostraron una tinción difusa para p16 comparado con el 68% de CIN2 y el 82% de CIN3. Los autores llegan a la conclusión de que, aunque hay buena evidencia de que la inmunotinción de p16 se correlaciona con la severidad de las anomalías citológicas o histológicas, la reproducibilidad es limitada debido a la interpretación insuficientemente estandarizada (102) Cribado en mujeres vacunadas En la era post-vacunación, la reducción de la prevalencia de anomalías escamosas llevará a una disminución del valor predictivo positivo (VPP) de la citología, un parámetro que indica hasta qué punto un resultado positivo acertaría al activar el tratamiento. Este hecho podría dar lugar a preocupaciones e intervenciones médicas innecesarias. La detección del ADN del VPH tiene una sensibilidad mayor a la de la citología, no depende de una interpretación subjetiva, por lo que mantendrá sus características de rendimiento en condiciones de baja prevalencia de lesiones (103). 61

62 De este modo, la prueba del ADN del VPH ha surgido como el candidato más probable para sustituir a la citología para la detección primaria. La incorporación de esta prueba podría mejorar la calidad global de los programas de detección y permitir el espaciamiento de las pruebas, manteniendo la seguridad y reduciendo los costos. Aunque la prueba del VPH es menos específica que la citología de Papanicolau, este problema podría resolverse reservando la citología para el estudio de los casos VPH-positivos (104) La colposcopia La colposcopia es una técnica de diagnóstico que permite la observación del cérvix, la vagina y la vulva con una visión iluminada y aumentada. Permite identificar ciertos cambios no visibles por inspección visual directa (Figura 6) y permite tomar una biopsia dirigida de cualquier área sospechosa, siendo así de ayuda para diagnosticar el cáncer de cérvix en sus primeras etapas (lesiones precancerosas o preclínicas no invasoras) cuya capacidad de progresión hacia el cáncer es conocida (105). Figura 6. Imágenes colposcópicas desde la normalidad hasta el cáncer. En The digene HPV test 62

63 Para su realización se utiliza el colposcopio que es un microscopio de campo estereoscópico, binocular, de baja resolución, con una fuente de iluminación potente. La colposcopia está indicada en: 1) Diagnóstico de la citología anormal 2) Mujeres VPH-AR positivas mayores de 30 años 3) Exploración ginecológica en cribado a la demanda 4) Cuello clínicamente sospechoso, incluso si la citología es normal 5) Evaluación de lesiones de vagina, vulva y ano 6) Seguimiento sin tratamiento, de mujeres seleccionadas con un diagnóstico de LSIL 7) Seguimiento después del tratamiento de displasia cervical o cáncer La colposcopia no tiene indicación en el cribado poblacional (106), pero permite diferenciar los cambios epiteliales que surgen con la evolución de la enfermedad. En la primera o fase intraepitelial, las células neoplásicas muestran un aumento de densidad nuclear lo que se traduce en lesiones de color blanco en la colposcopia e imágenes de punteado y/o mosaico, también llamados cambios menores. La segunda fase o angiogénica se origina por un aumento de factores de crecimiento del endotelio vascular y en la colposcopia se visualiza una vascularización irregular o atípica con un agravamiento de las lesiones epiteliales referidas como cambios mayores. La correspondencia histológica suele ser la siguiente: Cambios menores, grado I, se corresponde con frecuencia con epitelios metaplásicos e infección subclínica por VPH o CIN 1. Cambios mayores, grado II con signos de agravamiento de la lesión, peor pronóstico, CIN2-3, cuando se acompaña de vasos atípicos se debe sospechar invasión precoz del estroma. La sensibilidad de la colposcopia para diferenciar el epitelio normal de aquel que presenta cualquier lesión es del 96% y la especificidad del 48% (107). En un amplio estudio reciente donde se evaluó la precisión diagnóstica de la colposcopia en pacientes con alteraciones en la citología, la sensibilidad para la detección de LSIL fue del 98% y la especificidad del 45% y del 71 y 81% respectivamente para la detección de HSIL. En este mismo estudio en un grupo 63

64 de cribado la sensibilidad para la detección de LSIL fue del 28% con una especificidad del 87%. La sensibilidad para la detección de HSIL fue del 19% y la especificidad del 96%. Los autores concluyen en que la colposcopia no debe utilizarse para el cribado de la neoplasia intraepitelial cervical (108) TRATAMIENTO DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Introducción Un aspecto importante en la prevención del cáncer de cuello de útero es el tratamiento adecuado de la neoplasia intraepitelial cervical. Un tratamiento bien planificado reduce en gran medida el riesgo de cáncer de cuello invasor. Habitualmente el tratamiento consiste en la ablación o extirpación de la zona de transformación del cuello de útero. Teniendo en cuenta que el pico de incidencia de la CIN ocurre en mujeres jóvenes y el retraso de la edad del primer embarazo, la escisión excesiva de una parte del cuello uterino podría tener algún efecto adverso en el resultado del embarazo. Por otro lado, un tratamiento insuficiente podría influir negativamente en el curso de la enfermedad Evaluación pretratamiento Las condiciones a tener en cuenta para la elección del tratamiento adecuado dependen del ginecólogo, de la paciente y de la lesión. Según los documentos de consenso de la SEGO es necesario que el mismo equipo lleve a cabo el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento. Se deberá disponer de una unidad o sección multidisciplinar destinada a la patología del tracto genital inferior. 64

65 Condiciones de la paciente Se tendrá en cuenta: la edad, los antecedentes reproductivos y el deseo de gestación, la existencia de otras enfermedades y factores de riesgo (relaciones sexuales precoces, promiscuidad, infecciones de repetición, inmunosupresión) y factores socioculturales que puedan interferir con los controles posttratamiento (109) Características de la lesión Son los factores que más influyen en la elección del tratamiento. El tamaño de la lesión. En un estudio donde se analizaron la extensión lineal, la profundidad y la localización de 319 muestras se llego a las siguientes conclusiones: Las profundidades medias de CIN 1, 2 y 3 fueron 0,42 + / - 0,28, 0,93 + / - 0,71, y 1,35 + / - 1,15 mm, respectivamente. La extensión lineal media de CIN 1, 2 y 3 fueron 4,10 + / - 2,84, 5,84 + / - 4,13 y 7,60 + / - 4,32 mm, respectivamente. Aunque la mayoría de las lesiones (87,2%) afectaban a la zona de transformación, el 9,7% fue mayor en el canal cervical y el 3,1% se encontró en el exocérvix (110). En otro estudio cuantitativo de 84 conos extirpadas con láser también encontró una correlación altamente significativa entre la gravedad y el tamaño de la lesión para todos los grados de neoplasia intraepitelial cervical (111). Así pues, uno de los predictores más importantes de fracaso terapéutico es el tamaño de la lesión (112). Otro de los aspectos importantes es la profundidad de la afectación glandular. La neoplasia intraepitelial cervical afecta las criptas glandulares en el 88% de los casos siendo la profundidad media de 1,24mm y la máxima de 5,22 mm. La destrucción del tejido a una profundidad de 2,92 mm (media + 1,96 DE) conseguiría erradicar las criptas implicadas en el 95% de los casos, mientras que la destrucción a una profundidad de 3,80mm erradicaría el 99,7% (media + 3 DE) (113). El grado de atipia histológica es, sin lugar a dudas, el factor más importante a la hora de tomar decisiones en el manejo de la CIN. 65

66 Tipos de tratamiento Disponemos de tratamientos conservadores o mínimamente invasivos y de tratamientos radicales. Los tratamientos conservadores o mínimamente invasivos se dividen en destructivos y escisionales Tratamientos destructivos Producen una destrucción del tejido. Una vez finalizado el tratamiento no se dispone de tejido alguno para su estudio anatomopatológico A. Criocoagulación La criocoagulación consiste en la destrucción de los tejidos sometidos a un descenso de temperatura hasta -120 grados centígrados con oxido nitroso. Produce una necrosis poco hemorrágica. Según un metanálisis reciente, la crioterapia es un tratamiento ambulatorio eficaz, aceptable y seguro. Se ha demostrado que puede tener éxito en entornos de bajos recursos, ya que tiene un bajo coste (114). Cuando no se disponga de LEEP, la crioterapia está recomendada. No estará aconsejada cuando la lesión cubra más del 75% del exocérvix. En mujeres con lesiones que se extienden en el canal endocervical, se recomiendan antes los procedimientos de escisión que la crioterapia (115). B. Electrocoagulación diatérmica Consiste en la destrucción del tejido afectado con un electrodo. Tiene un bajo coste y pueden tratarse lesiones extensas. El mayor inconveniente es que, la 66

67 mayoría de las veces, requiere anestesia y la profundidad de la destrucción es imprecisa. C. Coagulación con láser Consiste en la destrucción del tejido con un haz de láser bajo control colposcópico. Permite un control más exacto de la profundidad. Se puede utilizar cuando también hay lesión en vagina. Tiene un elevado coste. Los criterios de selección para un tratamiento destructivo son similares en todos los casos: se debe descartar lesión endocervical, se debe tener garantía de control tras el tratamiento, las lesiones de alto grado son, generalmente, subsidiarias de tratamiento escisional Tratamientos escisionales Consisten en la extirpación completa de la lesión. Permite el estudio histológico de la pieza y confirmar la extirpación completa de la lesión. A. Conización Consiste en la extirpación de un cono de cuello de útero que incluye la zona de transformación. Permite el estudio de la lesión y conservar el útero. Existen variantes técnicas a la hora de realizar una conización: - Conización con bisturí frío La conización quirúrgica con bisturí frío ha sido inicialmente la única técnica que conservaba el útero. Requiere anestesia general, tiene un elevado coste sanitario y mayor riesgo de complicaciones. Se sigue utilizando en ciertas circunstancias: pacientes postmenopáusicas cuando la porción vaginal del cuello uterino es demasiada estrecha e impide la realización de conización con 67

68 asa de diatermia, o cuando los resultados de la citología indican adenocarcinoma in situ (117). La conización con bisturí se prefiere en los casos en que el estado de los márgenes es crítico, tales como lesiones glandulares y sospecha de microinvasión (118). La ventaja depende en estos casos de la ausencia de artefactos térmicos. - Conización con láser Consiste en la extirpación del cono cervical con un haz de láser de CO2 bajo control colposcópico. Tiene pocas complicaciones, se hace de manera ambulatoria con anestesia local y preserva la integridad reproductora. Requiere mayor tiempo quirúrgico y produce daño térmico. - Conización con asa de diatermia Consiste en la extirpación de la zona de transformación con un asa de alambre conectada a un generador de corriente (Figura 7). Figura 7. Representación de la conización con asa. LLETZ del inglés Large Loop Excisión transformation Zone (escisión con asa grande de la zona de transformación) o LEEP del inglés Loop Electrosurgical 68

69 Excisional Procederes (escisión con asa electroquirúrgica). Es un método que ofrece las ventajas de la conización con los de la destrucción local. El electrodo consiste en un asa grande de alambre fino que permite una escisión profunda de la zona de transformación con el mínimo daño tisular. Esta técnica permite a la vez el diagnóstico y el tratamiento de la CIN. Entre sus ventajas está la obtención de material para estudio; se puede hacer de manera ambulatoria y bajo anestesia local; es económica y tiene una alta tasa de curación; conlleva un bajo riesgo de afectar la función reproductora. La aceptación del procedimiento por parte de la paciente es alta. Las tasas de complicaciones son comparables a las de la crioterapia o a las del tratamiento con láser e incluyen sangrado, la eliminación incompleta de la lesión, y la estenosis cervical (119, 120). En una revisión sistemática de 23 ensayos aleatorizados que comparó los tres métodos de conización (con bisturí frío, láser y LEEP) no se han encontrado diferencias significativas en las tasas de hemorragia o de recurrencia. No hay diferencia significativa en la erradicación de la enfermedad, excepto entre la ablación por láser y la escisión con asa. La escisión con asa grande pareció proporcionar las muestras más confiables para la histología (121). B. Histerectomía No es el tratamiento de elección de la CIN. Las indicaciones para la histerectomía en las lesiones cervicales precancerosas deben ser estrictamente individualizadas y limitada a los pacientes sin deseo reproductivo y pacientes en los que se excluye el carcinoma invasivo oculto (116). Está indicado en algunos casos por imposibilidad técnica para realizar conización o cuando existen márgenes de conización afectados en mujeres con deseo genésico completo o imposibilidad de seguimiento. También puede ser considerada en una paciente con HSIL en la postmenopausia y cuando coexiste alguna patología que requiera histerectomía como tratamiento (117). 69

70 Porcentaje (%) 1.8. SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES TRATADAS POR CIN Importancia del seguimiento La importancia del seguimiento tras el tratamiento por CIN de alto grado radica en el hecho de que estas pacientes tienen un riesgo elevado (entre el 5 y el 30%) de presentar persistencia (enfermedad residual) o de sufrir una recurrencia (enfermedad de novo) y, por lo tanto, de padecer cáncer invasivo (3). En un estudio de seguimiento a largo plazo (122), que incluyó a mujeres tratadas por CIN, el 8,5% tuvo un nuevo episodio de CIN de alto grado. El 80% de las lesiones aparecieron en los dos primeros años y se consideró como persistencia, el restante 20% se consideró como recidiva. Hubo tres casos de carcinoma invasor (Gráfico 1) <4meses 5-8 meses 9-12 meses 2 años 3 años 4 años 5 años > 5 años Seguimiento Gráfico 1. Detección de persistencia/recidiva de CIN de alto grado en el seguimiento. Adaptado de (122) Se considera enfermedad residual aquella lesión que se pone de manifiesto en cualquiera de los controles realizados en el curso de los primeros doce meses tras el tratamiento y, enfermedad recidivante la que se presenta después del 70

71 primer año de seguimiento, durante el cual se ha seguido un control sin detectarse enfermedad residual Según una revisión sistemática la tasa de fracasos está en el 5-15% para las diferentes modalidades de tratamiento (cono con bisturí, crioterapia, ablación por láser o procedimiento electroquirúrgico con asa) sin diferencias significativas entre las distintas modalidades (123). Las tasas de fracaso de tratamiento son mayores en los dos primeros años tras el tratamiento (124). En un estudio de más de pacientes tratadas por neoplasia intraepitelial cervical las tasas acumulativas de CIN 2-3 en los 6 primeros años después del tratamiento fue de 14,0% (IC 95%, 13,8-14,1) para las mujeres tratadas por CIN 3, el 9,3% (IC 95%, 9,0-9,4) para pacientes tratadas por CIN 2, y el 5,6% (IC95%, 4,9-5,2) para pacientes tratadas por CIN 1. Las tasas anuales de CIN 2-3 eran menos del 1% a los 6 años (125). En este mismo estudio la incidencia general de cáncer invasivo (por mujeres-año) fue mayor en el grupo con CIN (37 cánceres invasivos, IC95%: 30,6-42,5) que en la cohorte de comparación (seis casos de cáncer, IC95%: 4,3-7,7) (125) Protocolos de seguimiento Respecto al seguimiento de las pacientes tratadas por CIN, la Sociedad Española de Ginecología y obstetricia recomienda controles cada 6 meses con citología y colposcopia. En el sexto mes se aconseja realizar un test de detección del VPH. Las guías de consenso de 2012 de la Sociedad Americana de Colposcopia y Patología cervical recomiendan el siguiente enfoque: Citología y test de VPH a los 12 y 24 meses tras el tratamiento. Si ambas pruebas son normales, se repiten las dos pruebas a los tres años. Si estas dos pruebas son negativas, la paciente vuelve al programa de cribado rutinario. Si una de las pruebas es positiva durante el seguimiento, se debe realizar colposcopia con legrado endocervical (Figura 8) (126). 71

72 Figura 8. Propuesta para el tratamiento y seguimiento de CIN de alto grado. ASCCP Medios para el seguimiento Dentro de los medios para el seguimiento de las pacientes tratadas por neoplasia intraepitelial, tenemos la citología, la colposcopia y el test de detección de ADN del VPH La citología La citología realizada en revisiones periódicas es el método diagnóstico más utilizado para el seguimiento de las pacientes tratadas por neoplasia intraepitelial cervical. Sus ventajas son un bajo coste y que es, relativamente, fácil de realizar. Sin embargo, como recordaremos, en los programas de cribado es una prueba poco sensible y para la detección de alteraciones significativas debe repetirse con frecuencia (80). En el contexto del seguimiento tras la conización, la sensibilidad y la especificidad de la citología es todavía menor que la observada en los programas de cribado (127). 72

73 En un estudio donde se valoró la detección de enfermedad residual tras tratamiento quirúrgico (LLETZ) por CIN de alto grado mediante citología, la sensibilidad fue del 28,3%. Este valor es mucho menor que el de citología en los programas de cribado y que limita, de manera importante, su precisión en la detección de enfermedad residual tras conización (128). Por otro lado, la citología es una prueba poco reproducible (83) La colposcopia Es un examen difícil tras la conización debido al proceso de cicatrización que produce imágenes que simulan la infección por el VPH (paraqueratosis), o transformaciones atípicas de grado 2 inducidas por el VPH (Figura 9). Además la estenosis cervical dificulta la visualización de la zona de transformación (127). Figura 9. Aspecto del cuello uterino tres meses después de la conización. En La colposcopia y el tratamiento de la neoplasia cervical. IARC La colposcopia en el seguimiento de las pacientes tratadas por neoplasia intraepitelial cervical es una prueba que mejora la sensibilidad de la citología pero, a expensas de reducir la especificidad (Figura 10). En una revisión retrospectiva se vio como la colposcopia detectaba 8 casos adicionales por 73

74 cada pacientes pero también daba lugar a 88 falsas alarmas de más (129). Citología Citología + colposcopia Sensibilidad (%) Especificidad (%) Figura 10. La colposcopia en el seguimiento de las pacientes tratadas por CIN. Adaptado de (129). Dentro de las limitaciones de la colposcopia tenemos la variabilidad intraobservador e inter-observador. En un estudio diseñado para estudiar la variación intra-observador e inter-observador en la interpretación de imágenes colposcópicas, la concordancia intra-observador fue del 66,7% y llegan a la conclusión de que la variabilidad entre observadores en la interpretación de imágenes colposcópicas y selección de los sitios de biopsia se encuentra en el mismo rango que la variación del observador en otras pruebas subjetivas de diagnóstico tales como la citología o la histología (130) Detección del ADN del VPH Si bien, las distintas modalidades de tratamiento de la neoplasia intraepitelial cervical tienen el objetivo de eliminar la lesión, y no de tratar la infección por el VPH, actualmente se ha reunido evidencia que indica que el VPH de alto riesgo se negativiza tras la extirpación completa de la lesión, mientras que sigue presente si la lesión persiste o recidiva (131). Así pues, la realización de las pruebas de detección del ADN del VPH de alto riesgo en el seguimiento de las pacientes tratadas por CIN es de gran utilidad para confirmar la presencia de posibles lesiones residuales o recurrentes, de hecho, el reciente documento de consenso de la SEGO recomienda la realización de un test de ADN en el sexto mes de seguimiento. Varias revisiones sistemáticas han analizado el valor de las pruebas de detección del ADN del VPH en el seguimiento de las pacientes tratadas por 74

75 CIN. Todos estos estudios hacen referencia a la mayor sensibilidad para las pruebas de detección del ADN de los VPH de alto riesgo en comparación con la citología(3, 132-4). En un resumen de los meta-análisis publicado en 2006 (3), la sensibilidad de la prueba de detección de ADN de HPV para predecir fracasos terapéuticos osciló entre el 67 y el 100%, con una media de 94,4%. Por su parte, la especificidad de la prueba para predecir buenos resultados de tratamiento osciló entre el 44 y 100%. En general, la detección de ADN del HPV tras el tratamiento predijo la CIN residual o recurrente con una sensibilidad significativamente mayor y una especificidad no significativamente menor en comparación con el uso de la citología de seguimiento. Estos resultados han sido recientemente avalados por otra revisión sistemática publicada en 2012 (135). La sensibilidad de la citología y la detección del ADN del VPH utilizadas conjuntamente, es mayor que la de las dos pruebas por separado (135, 136). 75

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77 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 77

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79 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La expresión del ARNm de las oncoproteínas E6 y E7 del VPH de alto riesgo es un indicador de progresión hacia el cáncer. Su detección en pacientes tratadas por CIN 2-3 podría servir para predecir recurrencia o recidiva OBJETIVO PRINCIPAL Valorar la utilidad clínica (marcador de riesgo de fracaso terapéutico) de la determinación del ARNm de las oncoproteínas E6 ye7 del virus del papiloma humano en el seguimiento de las pacientes tratadas en la Unidad de Patología Cervical del Hospital universitario La Paz por neoplasia intraepitelial cervical de grado 2-3 mediante conización OBJETIVOS SECUNDARIOS 1. Comparar la utilidad de la prueba de detección del ARNm del VPH frente a la de la detección del ADN para identificar a aquellas pacientes que tienen mayores posibilidades de persistencia o recurrencia de CIN 2-3 tras conización. 2. Estudiar la tasa de recidivas tras conización por CIN de alto grado 79

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81 3. MATERIAL Y MÉTODOS 81

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83 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Estudio observacional con recogida de datos prospectiva de valoración de pruebas diagnósticas. Las pacientes para el estudio han sido reclutadas en la Unidad de Patología Cervical del Hospital Universitario La Paz de Madrid. El estudio fue evaluado y aceptado por la Comisión de Investigación del Instituto de Investigación Sanitaria IdiPAZ y por el Comité de Ética del Hospital Universitario La Paz de Madrid con número de registro PI SELECCIÓN DE LAS PACIENTES Todas las participantes del estudio son mujeres tratadas por neoplasia cervical intraepitelial de alto grado (CIN2-3) mediante conización en el Departamento de Ginecología y Obstetricia del Hospital Universitario de La Paz (HULP) de Madrid entre diciembre de 2009 y abril de Durante el periodo de estudio, a todas las pacientes que acudieron a su primera revisión tras la conización se les ofreció participar en el estudio, siempre y cuando, cumplían con todos los criterios de inclusión. 84 pacientes aceptaron participar en el estudio. Los datos de estas pacientes fueron incluidos en ficheros electrónicos y en sus correspondientes historias clínicas y siempre cumpliendo con la ley de protección de datos. El procedimiento quirúrgico (conización) fue realizado en uno de los quirófanos del departamento de Obstetricia y Ginecología del hospital Universitario La Paz de Madrid, y siempre por el mismo grupo de cirujanos. 83

84 Tamaño de la muestra y periodo de reclutamiento Entre diciembre de 2009 y abril de 2011 se reclutaron 84 pacientes para participar en el estudio. Tres de ellas fueron, finalmente, excluidas del estudio. Dos de ellas fueron excluidas por presentar adenocarcinoma in situ y una tercera por presentar un carcinoma epidermoide microinfiltrante en la pieza de la conización. Por lo que el total de pacientes analizadas en el estudio fueron Criterios de inclusión - Confirmación histológica de neoplasia intraepitelial cervical de grado 2-3 en la pieza de anatomía patológica. - Ausencia de enfermedad residual. - Existencia de consentimiento por parte de la paciente para la realización de las pruebas del estudio SEGUIMIENTO DE LAS PACIENTES Hasta finales de 2010, las revisiones rutinarias en la Unidad de Patología Cervical del Hospital Universitario La Paz se han llevado a cabo cada 6 meses, siendo la primera revisión a los tres meses tras la intervención. Dicha revisión incluye la realización de tomas para la citología y una colposcopia. Desde aquel momento, y siguiendo las recomendaciones de las principales organizaciones científicas, se produjo un cambio en el protocolo de seguimiento de las pacientes tratadas por neoplasia intraepitelial cervical en dicha unidad, de forma que, la primera revisión pasa de tres a los seis meses de la intervención quirúrgica. El día de la primera revisión tras el tratamiento quirúrgico, a las pacientes que hayan sido seleccionadas para nuestro estudio se les hizo, además de la revisión rutinaria (colposcopia y citología), las tomas para la detección del ADN y ARNm del virus del papiloma humano. 84

85 Tras la primera revisión y coincidiendo con las revisiones rutinarias (cada seis meses) de las pacientes se ha hecho un seguimiento observacional. Se han anotado los resultados de la citología y la colposcopia de cada revisión. Se han registrado los resultados de aquellas pacientes que han requerido toma de biopsias PROCEDIMIENTOS DEL ESTUDIO Y EVALUACIONES A las pacientes que han sido consideradas aptas para el estudio se les ha entregado un documento de información sobre el estudio y una hoja de consentimiento informado Conización La conización se lleva a cabo en uno de los quirófanos del departamento de Obstetricia y ginecología del HULP. El responsable de la intervención es un especialista con experiencia en este tipo de tratamientos. La paciente está dormida y en muchas ocasiones se procede a la infiltración local del cuello con epinefrina y lidocaína al 2% a las 12, 3, 6 y 9 horarias. La mayoría de los procedimientos se hace con asa de diatermia. Se delimita el epitelio anómalo con solución yodada de lugol al 5%. La pieza es referenciada con un hilo a las doce horarias. El estudio de la pieza se lleva a cabo en el departamento de Anatomía Patológica del HULP Recogida de la muestra para la citología y pruebas moleculares La obtención de la muestra para citología en la unidad de Patología Cervical del HULP se hace en base líquida, estas muestras son adecuadas para otros tipos de estudios moleculares. En este tipo de procedimiento, la toma de la 85

86 muestra se hace antes de cualquier otra exploración genital y se utiliza un espéculo no lubricado. La muestra del endocérvix se toma con el cepillo endocervical Cytobrush introduciéndolo en el canal cervical y haciéndolo girar varias veces. La toma de exocérvix se hace con la espátula de Ayre, colocando la espátula contra el cuello uterino con la parte más larga hacia el orificio cervical y girándola unos 360º con firmeza. Los botes con los medios líquidos están previamente identificados con etiquetas de la paciente La citología en base líquida En este tipo de procedimiento, se introducen el cepillo endocervical y la espátula de Ayre, con la muestra recogida en su totalidad, en la solución conservadora. Con esto se consigue la fijación de las células y se evita la degeneración por contacto con el aire; a continuación se procede a realizar una mezcla que produce una muestra homogénea. En nuestro centro se procesa la muestra según la tecnología automatizada ThinPrep que utiliza el principio de filtración. Se mezcla la muestra en un cilindro que posee una membrana en un extremo, por donde se aspira el medio líquido y los elementos perturbadores, basados en el tamaño de los poros; luego se transfieren las células obtenidas en la membrana a un portaobjetos. Finalmente, se obtienen muestras con células, en zonas circulares. Las muestras citológicas son valoradas según la clasificación Bethesda de 2001 en los laboratorios de Anatomía Patológica del HULP La colposcopia Es una prueba rutinaria en el seguimiento de pacientes tratadas por CIN2-3 en el HULP y consiste en la localización y descripción topográfica de las lesiones del tracto genital inferior con la ayuda de un dispositivo óptico, el colposcopio, como ha sido explicado en la introducción de esta tesis. Se realiza en consulta de la unidad de la Patología del Tracto Genital inferior del HULP. 86

87 3.4.5 Detección de ADN del HPV CLART Papillomavirus humano 2 detecta la presencia de los 35 virus de PVH (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) con mayor importancia clínica en distintos tipos de muestras humanas. La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus por tratarse de una secuencia que está altamente conservada entre los distintos tipos de PVH. La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante microarrays de baja densidad (Figura 11). El procedimiento es llevado a cabo en el laboratorio de Virología del HULP. Figura 11. Esquema del método de visualización Detección del ARNm del VPH-Nuclisens NucliSENS EasyQ HPV es una prueba basada en mrna que detecta directamente los oncogenes activos HPV (E6/E7 mrna). La amplificación de la diana de ARN se produce mediante la utilización de la tecnología de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (NASBA), detecta la presencia del 87

88 ARN mensajero de los genes de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV. Emplea sondas específicas (molecular beacons) determinando 5 genotipos diferentes: 16,18,31,33 y 45. El procedimiento es llevado a cabo en el laboratorio de Virología del HULP Detección del ARNm del VPH- OncoTect Es un método de diagnóstico para la detección del ARNm de E6 y E7 del VPH. Emplea la técnica de hibridación in situ para detectar la expresión de los oncogenes E6 y E7 del virus del papiloma humano. El procedimiento consiste de varias etapas que se describan a continuación. Tras la recogida de la muestra en la consulta, el material es remitido al laboratorio en un recipiente para transporte (ThinPrep). Antes de la lectura, la muestra pasa por una serie de tratamientos que son (Figura 12): preparación celular, fijación celular y permeabilización, hibridación del ARNm de E6 y E7 y lavado celular. El paso siguiente es la lectura, que se realiza de modo automatizado mediante citometría de flujo, técnica que permite el análisis célula a célula para la obtención de resultados más precisos de manera rápida y fiable. El análisis de las muestras mediante esta técnica se realiza en los Laboratorios de Labec Pharma de Madrid y Figura 12. Procesamiento de la muestra para su análisis. OncoTect HPV 88

89 3.5. CRITERIO DE FRACASO TERAPEÚTICO Si definimos como el estándar de referencia a la mejor alternativa diagnóstica existente para estudiar una determinada enfermedad o evento de interés en términos de sensibilidad, especificidad y valores predictivos; podríamos considerar, en nuestro caso, la citología como el estándar de referencia. Así pues, consideramos la presencia de una citología patológica como un evento adverso en la evolución de la enfermedad ANÁLISIS ESTADÍSTICO La descripción de los datos cualitativos se realiza en forma de frecuencias absolutas y porcentajes y los datos cuantitativos mediante media ± desviación estándar, mediana, mínimo y máximo. La concordancia entre métodos se ha estudiado mediante el índice Kappa de Concordancia. El test de simetría de McNemar se usó para determinar si las discrepancias podrían explicarse por azar. Se estimó el tiempo hasta recidiva (de cualquier grado) por el método de Kapplan-Meier. La comparación entre resultados de cada test (OncoTect, NucliSENS y ADN) se ha realizado mediante el test log-rank. Se ha estimado la utilidad de cada test (OncoTect, NucliSENS y ADN) mediante el cálculo de la sensibilidad, especificidad y valores predictivos con sus correspondientes intervalos de confianza del 95%. Con carácter general, se han considerado significativos aquellos valores p<0.05. Los análisis estadísticos se han realizado con el programa SAS 9.3, (SAS Institute, Cary, NC, USA). 89

90 3.7. ÉTICA Y LEGISLACIÓN La información a la paciente y el consentimiento informado Según la vigente Ley Básica de Autonomía de los Pacientes, aquellas que acepten participar en el estudio tienen derecho a ser advertidas de si los procedimientos de pronóstico, diagnóstico y terapéuticos que se le apliquen pueden ser utilizados en función de un proyecto docente o de investigación que, en ningún caso, podrá comportar peligro adicional para su salud y que, en todo caso, será imprescindible la previa autorización y por escrito del paciente. La autorización de la paciente se hace por escrito en forma de un consentimiento informado (anexo I). El consentimiento informado ha sido otorgado libremente por parte de las pacientes. En la hoja de información cada paciente ha sido informada de los objetivos, beneficios (temas tratados con anterioridad), incomodidades y riesgos previstos (anexo II). En cuanto a las incomodidades diremos que son las mismas que de una revisión rutinaria tras una conización por CIN 2-3. Las tomas para la detección de ADN y ARNm se hacen en el mismo acto de la citología y colposcopia de la primera revisión tras el tratamiento quirúrgico. No existe ningún riesgo añadido al de la citología-colposcopia. Las participantes tienen el derecho de revocar su consentimiento en cualquier momento, sin expresión de causa y sin que por ello se derive para ella responsabilidad ni perjuicio alguno. En cumplimiento de la normativa legal vigente, el tratamiento de los datos de carácter personal de este fichero es confidencial y sólo con fines científicos De esta manera, las pacientes participantes en el estudio han recibido una hoja de información y han firmado un documento de consentimiento informado por escrito. 90

91 4. RESULTADOS 91

92 92

93 4. RESULTADOS 4.1. ESTUDIO DESCRIPTIVO Tamaño de la muestra y tiempo de seguimiento De las 81 pacientes que, finalmente, entraron en el estudio, 46(57%) han sido diagnosticadas de CIN II y 35 (43%) de CIN III (Gráfico 2). 43% 57% CIN 2 CIN 3 Gráfico 2. Se muestra la distribución de las pacientes reclutadas para el estudio según el diagnóstico. El tiempo de seguimiento medio de las pacientes fue de 22,5 ± 8,6 meses. El rango de seguimiento ha estado entre los 6 y 40 meses Edad de las pacientes La edad media de las pacientes en el momento del diagnóstico de la enfermedad fue de 38,6 ± 8,3 años con un rango entre los 22 y 62 años. La edad media de las pacientes diagnosticadas de CIN 2 fue de 37,4 ± 6,1 con un rango entre los 22 y los 55 años y la edad media de las pacientes 93

94 diagnosticadas de CIN 3 fue de 40,05 ± 6,3 años con un rango entre los 30 y los 62 años Diagnóstico citológico previo a la conización En 10(12,5 %) de los casos el resultado de la citología se informó como normal; en 19(23,8%), el diagnóstico fue de SIL de bajo grado; en 45(56,3 %) de los casos el diagnóstico fue de SIL de alto grado. Hubo 4(5%) casos de ASCUS y en 2(2,5%) casos el diagnóstico fue de ASC-H. Hubo una paciente (1,2%) que no aportó el informe de citología por haber sido estudiad previamente en otro centro (Gráfico 3). Citología previa a la conización Normal L-SIL H-SIL ASCUS ASC-H Gráfico 3. Distribución de las pacientes según el diagnóstico citológico previo a la conización Resultado de la biopsia previa a la conización En 4(5,3%) pacientes el diagnóstico de la biopsia previa a la conización fue de normalidad, en 3(3,9%) de ellas el diagnóstico fue de CIN 1, en 45 casos (59,2%) fue de CIN 2 y en 24(31,6%) fue de CIN 3 (Gráfico 4). 94

95 Biopsia previa a la conización Normal CIN 1 CIN 2 CIN 3 Gráfico 4. Distribución de las pacientes según el diagnóstico histológico previo a la conización Resultado de la pieza de conización En 14(17,3%) de los casos el estudio histológico de la pieza de la conización no encontró lesión intraepitelial residual. En 40(49,4%) de los casos el diagnóstico fue de CIN 2 y, en 27(33,3%) de los casos el resultado fue de CIN 3. Los casos en donde no se encontró lesión intraepitelial residual tenían una biopsia previa de CIN 2 ó 3 (Gráfico 5). Resultado de la pieza de conización Sin lesión residual CIN 2 CIN 3 0 Gráfico 5. Se muestra el diagnóstico histológico de las piezas de conización. 95

96 Resultados de la citología en la primera revisión tras la conización En el primer control tras el tratamiento, 75(92,7%) citologías fueron informadas como normales, 2(2,4%) dieron L-SIL, 1(1,2%) dio H-SIL y 3(3,7%) dieron ASCUS (Gráfico 6). Citología en la primera revisión tras conización Normal L-SIL H-SIL ASCUS Gráfico 6. Se muestra la distribución de los resultados de la citología en la primera revisión tras la conización Test de detección de ARNm OncoTect HPV De las 81 pacientes válidas para el estudio, tres muestras para la determinación de ARNm OncoTect HPV no fueron entregadas para su análisis. Creemos que se han podido perder en algún momento, entre su obtención, la conservación o el traslado de la muestra. Las cinco primeras muestras fueron conservadas a -20º C y no se consideraron válidas para su análisis, según criterios del laboratorio. Otras seis muestras presentaron una distribución no apta para el análisis mediante citometría de flujo. Así pues, se han podido analizar 67 muestras para la detección de ARNm OncoTect HPV. De estos, en 62(92,5%) el resultado fue negativo, y en 5(7,5%) el resultado fue positivo (Gráfico 7). 96

97 Resultados del test de detección de ARNm OncoTect HPV perdidos 40 no válidos positivos negativos Gráfico 7. Se muestra la distribución de los resultados del test de detección de ARNm de E6 y E7 del VPH de alto riesgo OncoTect HPV Test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ Respecto al test de detección de ARNm NucliSENS EasyQ, 80 muestras fueron válidas para el estudio. En 76(95%) casos el test de detección de ARNm el resultado fue negativo y en 4(5%), fue positivo. Hubo una muestra que no se pudo estudiar por problemas técnicos (Gráfico 8). Resultados del test de detcción de ARNm NucliSENS EasyQ no válidas negativas positivas Gráfico 8. Se muestra la distribución de los resultados del test de detección de ARNm de E6 y E7 del VPH de alto riesgo NucliSENS EasyQ. 97

98 Test de detección de ADN del VPH Se ha podido realizar el test de detección de ADN en un total de 80 pacientes. De estas, en 60(75%) la prueba fue negativa y en 20(25%) fue positiva (Gráfico 9). Resultados del test de dedetección de ADN No válidos Negativos Positivos Gráfico 9. Se muestran los resultados del test de detección de ADN del VPH Seguimiento citológico A lo largo del periodo de seguimiento, comprendido entre marzo de 2010 y julio de 2013, la citología resultó patológica, en algún momento, en 10(12,0%) de las pacientes (Gráfico 10). Resultado de la citología de seguimiento Positivas Negativas Gráfico 10. Resultado de la citología durante el periodo de seguimiento. 98