CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 1

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1 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 1 Capítulo 12. Terapia Génica. Componentes de un sistema de terapia génica y vías de administración. Naturaleza del ácido nucleico terapéutico. Tipos de vectores y su utilización en distintas estrategias de transferencia génica. Aplicaciones clínicas actuales de la terapia génica. Componentes de un sistema de terapia génica y vías de administración El desarrollo de la genética molecular durante los últimos años, y especialmente toda la información derivada del Proyecto Genoma Humano, han propiciado que podamos afrontar la modificación directa de las alteraciones genéticas o la utilización de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos. La terapia génica es una nueva modalidad terapéutica surgida a finales de los años 80, y que puede definirse como la transferencia de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) con fines terapéuticos. Toda estrategia de terapia génica se basa, por tanto, en la transferencia de ácidos nucleicos (transferencia génica) al interior de un grupo de células. Estas células pueden ser las células enfermas cuyo daño se pretende reparar, o bien un grupo de células normales que se modifican genéticamente para que sean las efectoras de una acción terapéutica, por ejemplo sintetizando una proteína concreta. Por lo tanto, todo sistema de terapia génica es análogo a un sistema de transporte, en el que hay un agente que es transportado y un vehículo de transporte. En nuestro caso, el agente transportado es un ácido nucleico y el vehículo encargado de llevarlo al interior de las células diana se denomina vector. Según el modo de hacer llegar el vector (conteniendo el agente terapéutico) a las células diana, es ya clásica la distinción entre terapia génica ex vivo y terapia génica in vivo. En el primer caso, la administración del vector se realiza fuera del cuerpo: se obtiene una biopsia del órgano de interés, se expanden las células mediante cultivo celular y se ponen en contacto con el vector mientras están siendo cultivadas. Esto hace posible seleccionar las células que hayan sido modificadas genéticamente y reintroducirlas en el paciente. En la administración in vivo, el vector terapéutico se administra directamente al individuo enfermo por cualquiera de las vías habituales (intramuscular, oral, intravenosa, intraportal, subcutánea), escogiendo aquella que nos permita alcanzar la máxima eficacia terapéutica. La Figura 12.1 ilustra los componentes de un sistema de terapia génica y las vías de administración. Naturaleza del ácido nucleico terapéutico Según el efecto biológico que pretendemos obtener, el agente terapéutico será de distinta naturaleza. En general, podemos clasificar los ácidos nucleicos terapéuticos en tres grupos, dependiendo de si

2 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 2 buscamos la corrección directa de una mutación, la suplementación génica, o la inhibición de la expresión. a) En los últimos años se ha conseguido corregir específicamente defectos a nivel del ADN de distintos modos. Uno de los primeros sistemas en ser desarrollados fue el de los quimeraplastos, moléculas quiméricas (híbridas) formadas por ADN y ARN que son capaces de reconocer específicamente una mutación y corregirla. Este tipo de tecnología funciona con cierta eficacia cuando se aplica a células en cultivo (in vitro), y es de esperar que en el futuro se pueda utilizar también in vivo. Los quimeraplastos son oligonucleótidos formados por una molécula lineal de ADN que contiene un tracto de 5 desoxi-ribonucleótidos complementarios a la secuencia genómica que se quiere corregir. Es importante que esta región correctora esté flanqueada por fragmentos de 10 ribonucleótidos (ARN). El oligonucleótido se empareja específicamente con la región mutada y los sistemas de reparación celulares llevan a cabo la reparación de la mutación tomando como molde la base correspondiente del oligonucleótido terapéutico. Teóricamente, es posible diseñar oligonucleótidos ARN/ADN para corregir directamente las mutaciones puntuales que causan las enfermedades hereditarias más frecuentes. Figura 12.2 Estructura de un quimeraplasto. En los últimos años se ha avanzado mucho en el desarrollo de nucleasas con dedos de zinc, conocidas como tijeras moleculares. Son unas proteínas compuestas por un dominio de unión a ADN (formado por varios dedos de Zinc) fusionado con un dominio de rotura de ADN (habitualmente el enzima de restricción FokI) Los dedos de zinc pueden diseñarse para la unión específica a una región del genoma, y esto crea una rotura de doble cadena del ADN que se repara mediante recombinación homóloga u otro sistema de reparación del ADN. La Figura 12.3 ilustra el funcionamiento de nucleasas de dedos de zinc.

3 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 3 b) En el caso de mutaciones que simplemente producen pérdida de función, puede ser suficiente la suplementación génica, es decir, suplementar las células con copias normales del gen sin preocuparnos de corregir las mutaciones presentes en el ADN genómico. Lo más habitual en estos casos es que el agente terapéutico sea una unidad de expresión en la que la transcripción del gen en cuestión viene regulada por promotores virales potentes, por promotores regulables o por promotores específicos de un tipo celular concreto. La Figura 12.4 muestra un plásmido de expresión para suplementación génica. c) Cuando el defecto genético que tratamos de corregir origina una ganancia de función, como suele suceder en mutaciones con efectos oncogénicos, lo lógico es intentar inhibir la expresión del gen que está causando el fenotipo aberrante. Los agentes terapéuticos más utilizados en estas circunstancias son las moléculas antisentido o los ribozimas. Los oligonucleótidos antisentido pueden inhibir directamente la expresión de un gen al unirse a la doble hélice de ADN mediante enlaces tipo Hoogsteen, formado una triple hélice que impide la transcripción mediada por la ARN polimerasa II. Estos oligonucleótidos suelen estar modificados químicamente para aumentar su estabilidad y eficacia, siendo las principales modificaciones los grupos fósforo-tioato en el esqueleto desoxi-ribosa-fosfato de los oligonucleótidos, o bien los ácidos nucleicos en los que el enlace fosfodiéster viene substituido por un enlace peptídico (denominados Acidos Nucleicos Peptídicos, PNA). Los ARNm antisentido son capaces de emparejarse con los ARN sentido y formar moléculas bicatenarias de ARN que no pueden ser traducidas y son digeridas por la RNAsa H celular. Los ribozimas, pequeñas moléculas de ARN con actividad catalítica, pueden ser diseñados para reconocer un ARNm específico y degradarlo merced a su actividad endonucleolítica específica. En general, la utilización de moléculas antisentido y ribozimas está limitada por la baja eficacia que muestran todavía en modelos in vivo.

4 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 4 La Figura 12.5 muestra los distintos tipos de moléculas utilizadas para inhibir la expresión génica. Hoy en día, las mejores perspectivas de inhibición eficaz y específica de la expresión génica se basan en la interferencia de ARN, un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional descrito en plantas y C. elegans que consiste en la degradación de ARN mensajeros endógenos por la presencia de moléculas pequeñas de ARN de doble cadena homólogas al mensajero que se destruye. Este proceso depende de una RNAasa tipo III llamada DICER, responsable de la formación de los ARN pequeños, y de un complejo llamado RISC (RNA Induced Silencing Complex) que contiene unas proteínas del complejo ARGONAUTA y los ARN pequeños que dirigen el complejo a la diana. Se ha visto que este mecanismo también juega un papel importante en la regulación génica en humanos, ya que el análisis del genoma ha revelado la presencia de genes que codifican ARN pequeños (aproximadamente 75 nucleótidos) que forman horquillas y que son procesados por DICER y proteínas del complejo Argonauta para generar ARN intereferentes pequeños, de unos nucleótidos. Estos genes endógenos se denominan mirna (microrna), para diferenciarlos de los sirna que provienen de moléculas bicatenarias de ARN de procedencia externa. Actualmente se piensa que ambos tipos de moléculas (mirna y sirna) tienen la misma vía efectora, que actúa impidiendo la traducción (si la homología de la molécula interferente con el ARN mensajero no es total), o bien eliminando los mensajeros si la homología es total. Sorprendentemente, también se ha visto que las repeticiones centroméricas y los transposones, cuando se transcriben, dan lugar a ARN interferentes pequeños que utilizan este mecanismo para modificar la cromatina, induciendo metilación en las histonas ó en el ADN y provocando la formación de heterocromatina o el silenciamiento transcripcional. En los últimos años se ha demostrado que se pueden utilizar sirnas ó micrornas para inhibir la expresión de genes endógenos, generando moléculas interferentes específicas para un gen concreto. Por ejemplo, se ha conseguido silenciar genes endógenos en células humanas mediante sirnas dirigidos específicamente frente a promotores concretos. Dicho silenciamiento se lleva a cabo por metilación de los dinucleótidos CpG de esos promotores y por metilación de la lisina 9 de la histona H3 de esa región. El avance más espectacular usando esta tecnología tuvo lugar en 2004, cuando un grupo consiguió reducir hasta

5 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 5 un 40% los niveles de colesterol en ratón, usando unos sirna sintéticos conjugados con colesterol que fueron injectados directamente en la vena de la cola. Los sirna fueron captados eficazmente por receptores del hígado, yeyuno y otros órganos y provocaron la degradación de los ARNm endógenos de apolipoproteína B, con el consiguiente descenso en los niveles de LDL y colesterol total. Figura 12.6 El video ilustra el funcionamiento de los microarns. Tipos de vectores y su utilización en distintas estrategias de transferencia génica Los ácidos nucleicos terapéuticos han de ser vehiculizados al interior de las células diana por medio de vectores adecuados. Se distinguen dos tipos fundamentales de vectores: los basados en virus (vectores virales) y los vectores sintéticos (vectores no virales) que intentan emular la capacidad natural que tienen los virus de introducir ácidos nucleicos en las células. 1. Los vectores virales fueron los primeros en ser utilizados, dada su alta eficacia como vehículos de ácidos nucleicos. Los virus están compuestos por un ADN ó un ARN rodeado de una cápside proteica y, en algunos casos, una envuelta lipoproteica. El ciclo biológico de los virus pasa por la introducción del genoma viral en determinados tipos celulares, habitualmente por la presencia de receptores en la membrana de las células. Para poder utilizar un virus como vector en terapia génica, es preciso insertar el ácido nucleico terapéutico en el genoma viral, y conseguir al mismo tiempo que el virus no se replique y por tanto no sea patogénico. Por esto, los virus utilizados en terapia génica se denominan virus recombinantes y defectivos (carecen de alguna función necesaria para su propio ciclo replicativo). A continuación se repasan los principales vectores virales utilizados actualmente en terapia génica. a) Vectores retrovirales. La familia Retroviridae está compuesta por las subfamilias Spumaviridae, Lentiviridae y Oncoviridae. Los vectores retrovirales utilizados en terapia génica están derivados de los oncovirus murinos del tipo C, especialmente los que son anfitrópicos (que pueden infectar tanto células murinas como humanas). Recientemente se han desarrollado vectores derivados de lentivirus, especialmente del HIV-1. Los retrovirus son virus ARN que tienen una envuelta fosfolipídica, con glicoproteínas que determinan el tropismo del virus al ser reconocidas por receptores celulares específicos. Dentro de esta envuelta hay una cápside proteica de estructura icosaédrica que contiene 2 copias del genoma viral, la transcriptasa inversa (RT), y la integrasa. El genoma de un retrovirus es una molécula de ARN de polaridad positiva en la que se distinguen 3 tipos de genes: genes gag (que codifican las proteínas de la cápside), genes pol (que codifican las enzimas necesarias para el ciclo viral, como la proteasa y la integrasa) y genes env (que codifican las glicoproteínas de la envuelta). El genoma está flanqueado por dos repeticiones terminales largas (LTR, Long Terminal Repeat), y contiene también una señal de empaquetamiento PSI mediante la cual las moléculas de ARN se unen a las proteínas de la cápside y son empaquetadas eficazmente. El LTR izquierdo contiene una región (U3) para el comienzo de la transcripción, y un primer binding site (pbs) para el comienzo de la retrotranscripción. El LTR derecho contiene una secuencia de poli-purinas (ppt) para la replicación de la segunda cadena.

6 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 6 El ciclo replicativo de los retrovirus comienza cuando el virus es reconocido por receptores celulares, lo que lleva a la fusión de la envuelta viral con la membrana celular y a la internalización del nucleoide. A continuación tiene lugar la retrotranscripción del ARNm para formar un ADNc bicatenario (este proceso tiene lugar dentro de la nucleocápside, antes de su llegada al núcleo de la célula), y después se desensambla la cápside al llegar a la membrana nuclear. El genoma viral se integra en el genoma de la célula huésped (integración mediada por la propia integrasa del virus), y entonces comienza la transcripción a partir del promotor U3 que está en el LTR izquierdo. Se producen distintos tipos de ARNm, fundamentalmente un transcrito que contiene gag y pol y otros transcritos que codificarán las proteínas de la envuelta. Los ARNm son exportados al citoplasma y traducidos, dando lugar a poliproteínas gag-pol y a las proteínas de la envuelta. Estas últimas viajan a la membrana celular, mientras que las poliproteínas gag-pol forman nuevas nucleocápsides al unirse a la señal de empaquetamiento de los ARNm positivos. Tras el empaquetamiento, que tiene lugar en el citoplasma, las cápsides salen de la célula por gemación, quedando rodeadas de nuevo por una envuelta compuesta por la membrana celular y las glicoproteínas codificadas por el virus que habían llegado anteriormente a la membrana. Las nuevas partículas retrovirales se activan cuando la proteasa rompe la poliproteína gag-pol dentro de la propia partícula viral y da lugar a moléculas independientes de proteasa, integrasa y retrotranscriptasa. La Figura 12.7 muestra la estructura del genoma de un retrovirus. Es importante señalar que el nucleoide de un oncovirus es incapaz de atravesar la membrana nuclear, por lo que es necesario que la célula sufra al menos una mitosis para que el genoma viral entre en contacto con el genoma de la célula huésped. En cambio, los retrovirus de la familia de los lentivirus sí que pueden atravesar la membrana nuclear, por lo que pueden infectar células que no están en división. Esta es una propiedad muy importante a la hora de valorar las posibles aplicaciones de estos tipos de vectores. Para generar un retrovirus recombinante defectivo, es necesario sustituir los genes de las proteínas virales por el gen terapéutico que se quiere utilizar. Lógicamente, para producir estos virus defectivos debemos usar una línea célular (célula empaquetadora) que aporte los genes virales en trans. Estas células empaquetadoras tienen los genes virales insertados en el genoma celular, de modo que expresan establemente las proteínas virales. Sin embargo, las copias de los genes virales que están integradas en el genoma celular carecen de la señal de empaquetamiento, por lo que sus transcritos no pueden empaquetarse en las nuevas partículas virales. De este modo, una célula empaquetadora en condiciones normales no produce viriones completos, sino sólo partículas vacías. En cambio, cuando transfectamos estas células con un plásmido recombinante que contenga el ADN terapéutico flanqueado por los LTR y por la señal de empaquetamiento (además de otros elementos necesarios en cis como el

7 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 7 primer binding site, y el tracto polipurínico necesario para la síntesis de la segunda cadena) se generarán partículas retrovirales recombinantes y defectivas, que pueden ser purificadas y concentradas a partir de los sobrenadantes del cultivo celular. En este proceso es muy importante evitar la aparición de retrovirus con capacidad replicativa, que podrían generarse por recombinación homóloga entre las secuencias virales que están presentes en nuestro plásmido con las secuencias virales presentes en el genoma de la célula empaquetadora. Por este motivo, se utilizan células empaquetadoras que tienen los genes virales separados entre sí, de modo que serían necesarias varias recombinaciones independientes para generar un virus replicativo, algo altamente improbable. Figura 12.8 En este video se explica el ciclo replicativo de un oncoretrovirus, así como el proceso de producción de retrovirus recombinantes defectivos. Los retrovirus recombinantes defectivos han sido muy utilizados en terapia génica. Por las limitaciones propias del tamaño del genoma viral, el ADN terapéutico no puede ser mayor a 7-8 kb. Son vectores con buena infectividad, un tropismo amplio, pero son bastante lábiles (lo que dificulta su purificación) y sólo transducen eficazmente células que están en división. Además, son inactivados en el torrente sanguíneo por el sistema del complemento, por lo que su principal uso ha estado reservado a estrategias de terapia génica ex vivo. Su capacidad integrativa les permite alcanzar, en teoría, una duración muy larga de la expresión incluso en células que estén dividiéndose activamente. Sin embargo, los promotores virales suelen silenciarse por metilación, por lo que la expresión no es tan prolongada como cabría esperar. Se está investigando la posibilidad de modificar el tropismo de estos vectores, mediante la creación de proteínas de la envuelta quiméricas que incluyan algún scfv (anticuerpo monocatenario) u otros ligandos de receptores celulares conocidos. Como se ha mencionado, recientemente se han desarrollado vectores retrovirales basados en lentivirus, aprovechando la circunstancia de que el HIV-1 es uno de los virus mejor estudiados. El genoma de este virus contiene algunos genes (tat y rev, por ejemplo) que no están presentes en los oncoretrovirus y que son esenciales para la expresión de los genes virales. Algunas de las proteínas virales tienen señales de localización nuclear y facilitan la entrada del virus por los poros nucleares, de ahí la capacidad que tienen estos virus de infectar células que no están en división. Aunque los problemas de seguridad de los lentivirus están prácticamente superados, todavía hay que mejorar los sistemas de producción para poder utilizarlos en pacientes con total seguridad. Su principal aplicación está en la transferencia de genes a células del sistema nervioso in vivo, y a progenitores hematopoyéticos ex vivo, siendo esta última una propiedad especialmente interesante por su inmenso potencial terapéutico, y porque estas células son prácticamente intransfectables por otros medios. b) Vectores adenovirales: Se conocen gran cantidad de serotipos de adenovirus humanos, pero los más utilizados en terapia génica han sido los serotipos 2 y 5. Los adenovirus son virus ADN sin envuelta, responsables de las principales enfermedades de vías respiratorias altas (el catarro común), con muy buen tropismo por células humanas. La nucleocápside de un adenovirus consta de una cápside icosaédrica que está compuesta por 720 proteínas hexona y 60 proteínas pentona. De las pentonas parte la proteína de la fibra (una proteína trimérica) que termina en una proteína botón (knob) mediante la cual el adenovirus se une a receptores celulares específicos.

8 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 8 Figura 12.9 Estructura de una partícula adenoviral, con las hexonas, pentonas y fibras. Tomada del sitio educativo de los premios Nobel. El genoma adenoviral es un ADN de doble cadena de aproximadamente 35 kb de tamaño, flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de nucleótidos y una señal de empaquetamiento (psi) cerca del ITR izquierdo. Contiene gran cantidad de genes, que se agrupan en regiones tempranas (early) y tardías (late), según el momento en que se transcriben después de la infección. Así, las regiones tardías se transcriben tras la replicación del genoma viral, y contienen los genes que codifican las proteínas estructurales del virus. En cambio, las regiones tempranas se transcriben antes de la síntesis del ADN viral, y cumplen varias funciones: las proteínas codificadas en E1 incluyen, por ejemplo, E1A (proteína necesaria para transactivar la transcripción de los demás genes virales) y E1B 55kd (que se une a E4). Además, estas proteínas interfieren con las funciones de la célula huésped: E1A es una oncoproteína, E1B 19kd inhibe la apoptosis mediada por p53 y E1B 55kd promueve la degradación de p53. la región E2 codifica proteínas necesarias para la replicación viral: ADN polimerasa, proteína terminal, etc. la región E3 codifica algunas proteínas que ayudan al adenovirus a escapar al sistema immune, como la proteína gp19kd que inhibe la presentación de fragmentos antigénicos con moléculas de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad. la region E4 codifica diversas proteínas que silencian genes endógenos, regulando el transporte de ARN mensajeros fuera del núcleo.

9 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 9 Figura Estructura del genoma de un adenovirus. El ciclo replicativo de un adenovirus es más sencillo que el de los retrovirus. El adenovirus se une a un receptor de membrana específico denominado CAR (CoxackieAdenovirusReceptor) mediante el botón de la fibra, y a continuación la pentona se une por un motivo RGD (arginina-glicina-aspártico) a integrinas cercanas para después ser internalizado por endocitosis. La propia cápside adenoviral es capaz de desestabilizar el endosoma, que se rompe y libera las partículas virales al citoplasma. Las nucleocápsides llegan a la membrana nuclear y son capaces de introducir el genoma viral a través de los poros nucleares. Para generar adenovirus recombinantes defectivos (es decir, que lleven el ADN terapéutico pero no puedan replicarse) se sigue una estrategia similar a la que veíamos para los retrovirus: substituir algún gen viral por el gen terapéutico. Lo más habitual es delecionar el genoma viral en la región E1, para lo que necesitaremos una célula empaquetadora que exprese de manera estable los genes contenidos en esa región. La línea celular más utilizada como célula empaquetadora para construir adenovirus recombinantes se denomina célula 293. Para conseguir el adenovirus recombinante, se cotransfectan células 293 con dos plásmidos distintos: un plásmido en el que el gen terapéutico está flanqueado por parte del gen E1, la señal de empaquetamiento y los ITR virales, y otro plásmido que contiene todo el genoma viral excepto la señal de empaquetamiento y la región de E1 que está presente en trans en el genoma de las células 293. Una vez dentro de la célula, los mecanismos de recombinación son capaces de generar un genoma viral recombinante que llevará el gen terapéutico dentro del genoma viral (al que le falta E1). Como el gen terapéutico va unido a la señal de empaquetamiento PSI, únicamente estos transcritos se empaquetarán correctamente en las nuevas cápsides virales, mientras que los genomas virales producidos endógenamente carecen de la señal PSI y por tanto no producen viriones infectivos. Los adenovirus delecionados en E1 permiten insertar genes terapéuticos con un tamaño máximo de 5 kb, por lo que posteriormente se han generado vectores que llevan además deleciones en E3 y E4, para conseguir llegar a una capacidad de 7-8 kb. La última generación de vectores adenovirales consiste en los llamados adenovirus gutless (vacíos), en los que todo el genoma viral ha sido delecionado y por tanto tienen una capacidad teórica en torno a las 30 kb de ADN exógeno. Para producirlos hay que aportar en trans todas las funciones adenovirales necesarias, mediante plásmidos helper ó por estrategias que utilizan el sistema Cre/loxP. Figura El proceso de producción de adenovirus recombinantes defectivos se muestra en este video. Los adenovirus comenzaron a usarse en terapia génica más tarde que los retrovirus, pero rápidamente ganaron en popularidad y hoy en día son los vectores más utilizados para aplicaciones in vivo. Infectan gran variedad de células, son relativamente estables y fáciles de purificar y concentrar, y son eficaces tanto sobre células quiescentes como sobre células en división. Como el genoma del vector no se integra en el genoma de la célula huésped, la duración de la expresión en células en división es limitada. Su principal inconveniente es la toxicidad que producen a dosis altas, y la fuerte respuesta inmune celular y humoral que sigue a su administración, con la consiguiente disminución de eficacia terapéutica. Los nuevos vectores adenovirales vacíos superan algunos de estos inconvenientes. c) Vectores Virales Adenoasociados: Se trata de Parvovirus que infectan al hombre pero no son patógenos. Pertenecen al grupo de los Dependovirus, virus ADN sin envuelta que necesitan de funciones helper para completar su ciclo replicativo completo. Estas funciones helper las aporta un adenovirus o un

10 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 10 herpesvirus que sobreinfecta las mismas células que previamente habían sido infectadas por un dependovirus. El genoma de un virus adenoasociado es un ADN monocatenario con un tamaño de 4,8 kb y una estructura muy simple, con dos regiones codificantes: cap, que codifica las tres proteínas de la cápside, y rep, que codifica 4 proteínas necesarias para la replicación viral. El genoma está flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR), que forman unas estructuras en horquilla y que son los únicos elementos necesarios en cis para poder llevar a cabo el ciclo vital del virus. Figura Estructura del genoma de un adenoasociado. La infección por un virus adenoasociado comienza por la unión del virus a receptores celulares y su entrada en la célula. El genoma viral es capaz de entrar en el núcleo incluso en células que no se dividen, y una vez allí se convierte a doble hebra y se integra en un locus específico localizado en el brazo largo del cromosoma 19 humano (banda 19q13). Todas estas funciones están mediadas por proteínas de la célula huésped, pero además se ha comprobado que las proteínas virales Rep78/68 son necesarias para la integración específica del genoma viral en una secuencia llamada AAVS1 que está en 19q13. En ausencia de funciones helper, el genoma viral integrado permanecerá como un provirus, en forma latente. Ante una sobreinfección por adenovirus ó herpesvirus, el adenoasociado comienza su fase lítica con la transcripción de los genes virales, la replicación del genoma viral y el empaquetamiento en las cápsides para dar lugar a nuevos viriones. Para obtener virus adenoasociados recombinantes como vectores en terapia génica, se construye un plásmido recombinante que contiene el gen terapéutico flanqueado por los ITR virales. En el método clásico de producción de estos vectores, se cotransfectan células 293 con el plásmido recombinante y con otro plásmido que aporta en trans las funciones cap y rep, y después se infectan esas mismas células con un adenovirus. El problema de este procedimiento es que los preparados virales tienen una fuerte contaminación por adenovirus, por lo que es necesario inactivar este adenovirus contaminante mediante tratamiento con calor. Los métodos actuales de producción evitan este problema al aportar las funciones helper del adenovirus en un tercer

11 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 11 plásmido que se cotransfecta con los otros dos, de forma que la generación de adenovirus maduros es prácticamente imposible. Figura El siguiente video muestra el ciclo replicativo de un AAV y la estrategia para la producción de AAV recombinantes defectivos. Los vectores adenoasociados están ganando popularidad rápidamente por sus extraordinarias características: buena infectividad, integración en el genoma de la célula huésped, muy baja toxicidad y ausencia de respuesta inmune celular frente a las proteínas virales. Por desgracia, la especificidad de la integración en un locus concreto se pierde en los virus adenoasociados recombinantes, ya que no se produce Rep68/78 (que es absolutamente necesaria para que tenga lugar esta integración específica). En consecuencia, la integración se realiza al azar, como en el caso de los retrovirus. Los virus adenoasociados pueden transducir células mitóticas o células en división, y están especialmente indicados en aplicaciones in vivo en las que se requiere una expresión prolongada del gen terapéutico. d) Otros vectores virales que actualmente están ganado en popularidad son los Herpesvirus, basados en el virus del herpes simplex (HSV), que tienen un marcado tropismo neuronal y por eso se emplean fundamentalmente para la transferencia de genes al sistema nervioso. Los HSV son virus envueltos con un genoma lineal de 152 kb de ADN bicatenario, en el que se han identificado más de 80 genes. El genoma está dividido en dos regiones únicas (Larga y Corta) que están flanqueadas por repeticiones terminales (TR) y repeticiones internas (IR). El virus se une a glicosamino-glucanos celulares y a receptores celulares específicos (por ejemplo, el receptor HveC, que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se expresa a alto nivel en el sistema nervioso). Tras la entrada en la célula, el virus avanza por transporte retrógrado y llega al núcleo, penetrando por los poros nucleares. Después de entrar en el núcleo se expresan los genes inmediatos tempranos, que activan la expresión de los genes tempranos (necesarios para la síntesis de ADN viral) y de los genes tardíos (proteínas estructurales). Una característica importante es que uno de los genes inmediatos tempranos (ICP4) es absolutamente necesario para la replicación viral, por lo que basta eliminarlo del genoma para obtener virus defectivos. En los vectores actualmente en uso se han delecionado todos los genes inmediatos tempranos, por lo que son totalmente apatogénicos. Otra característica importante de estos virus es que cuando no se replican entran en un periodo de latencia en el que se transcriben únicamente unos transcritos asociados a latencia (LATs), aunque no se expresen los genes inmediatos tempranos. Por tanto, incluyendo la unidad transcripcional en la región de latencia se pueden obtener virus defectivos que expresan de forma persistente un gen terapéutico. Además, se trata de vectores de gran capacidad porque permiten acomodar hasta 50 kb de ADN exógeno.

12 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 12 Figura Estructura del genoma de un virus del herpes simple. 2. Los Vectores no-virales representan un intento de imitar las funciones de los virus como vehículos de transferencia génica mediante sistemas sintéticos, de forma que en principio son vectores mucho más seguros desde el punto de vista de su peligrosidad biológica y su patogenicidad. En este sentido, los vectores no-virales no se diferencian conceptualmente de los fármacos a los que estamos habituados. La principal limitación de este tipo de vectores es que, en la actualidad, su eficacia in vivo es mucho menor que la de los vectores virales. Esto se debe a la inestabilidad propia de sistemas sintéticos complejos y a las diferentes barreras que han de superar: Los complejos entre el ácido nucleico y los demás componentes de estos sistemas han de ser estables tras su administración, y no desintegrarse antes de alcanzar las células. Por otra parte, la biodistribución de estos preparados hace que la concentración efectiva en las células diana sea baja, por lo que es importante que lleven en su superficie algún tipo de ligando para receptores específicos de las células a las que lo queremos enviar. Habitualmente, estos complejos entran en las células por endocitosis, de manera que quedan expuestos al ataque de las enzimas lisosomales. Para evitar esto, se intenta incluir en estos vectores algún tipo de molécula que altere el ph del endosoma y consiga romperlo antes de su fusión con los lisosomas y liberar así el complejo intacto al citoplasma. Estas moléculas suelen ser péptidos o proteínas virales que cumplen esta misma función en algunos tipos de virus. Una vez en el citoplasma, estos complejos han de ser lo suficientemente estables como para llegar hasta el núcleo, pues si el ácido nucleico se libera muy pronto será degradado por nucleasas citoplasmáticas. Pero si son demasiado estables, el ácido nucleico no conseguirá liberarse y por tanto no podrá entrar en el núcleo de la célula. Este compromiso entre protección y liberación es quizás uno de los retos más importantes que tienen que superar los vectores no virales para aumentar su eficacia actual. En cierta medida, la inclusión en estos complejos de alguna molécula capaz de dirigirlos al núcleo celular serviría para acelerar su tránsito citoplasmático. Por tanto, otro componente habitual en los

13 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 13 vectores no virales son las moléculas con señales de localización nuclear que además permitan la entrada del ácido nucleico a través del complejo del poro nuclear, pues de lo contrario sólo serán capaces de ser efectivos en células que estén en mitosis. Como se ve, la tarea de construir un vector no-viral ideal equivale a intentar reconstruir en el laboratorio lo que los virus consiguen de manera natural, lo cual no es en absoluto sencillo. En cualquier caso, son uno de los campos de investigación más activa, sobre todo por parte de empresas farmacéuticas y de biotecnología, y es previsible que los próximos años vean avances significativos en este terreno. Actualmente, los vectores no-virales más utilizados son los siguientes: a) Inyección Directa: Lógicamente, lo más sencillo es injectar directamente el ácido nucleico (ADN desnudo) en el órgano de interés. Aunque poco eficaz, este procedimiento funciona razonablemente en ciertas aplicaciones y en algunos órganos. Por ejemplo, el músculo esquelético es uno de los órganos que más eficazmente incorporan un plásmido inyectado, alcanzando niveles de expresión suficientes para conseguir inmunización frente a proteínas virales, tumorales, etc. En ocasiones se utiliza la inyección de ADN formulado con diversos polímeros (sobre todo poli-vinil-pirrolidona) que lo protegen de la acción de las nucleasas y prolongan su vida media tras la administración. También se utiliza el ADN encapsulado en microesferas de polímeros biodegradables (por ejemplo, copolímeros de ácido láctico y glicólico), que pueden inyectarse en un órgano y proporcionar liberación sostenida del ácido nucleico terapéutico durante un periodo de tiempo más o menos prolongado, dependiendo del tipo de polímero utilizado. Otra variedad es la transferencia génica balística (pistola génica o gene gun ), en la que el ácido nucleico terapéutico se adsorbe sobre la superficie de una bolas microscópicas de oro u otro metal inerte, que son disparadas a presión sobre el órgano diana. Es una vía de administración utilizada en la piel (para inmunización génica) o a veces sobre otros órganos, pero las bolas no tienen un gran poder de penetración (raramente superior a unos pocos milímetros). Figura Transferencia génica por inyección intramuscular directa. b) Complejos formados por el ácido nucleico terapéutico y otros componentes: son los sistemas más complicados de elaborar y optimizar, pero los más eficaces dentro de los vectores no-virales. El principio que subyace a todos los sistemas de este tipo es la complejación del ADN (molécula grande con alto número de cargas negativas) con polímeros de naturaleza catiónica (con cargas positivas), de manera que la neutralización de cargas da lugar a complejos más o menos estables, de pequeño tamaño, en los que el ADN está protegido de la acción de nucleasas. Suele distinguirse entre lipoplexos (cuando el ADN se compleja con lípidos catiónicos) y poliplexos (ADN complejado por policationes, habitualmente poli-lisina o poli-etilén-imina). Sobre la estructura básica de un lipoplexo o un poliplexo pueden añadirse otro tipo de moléculas que actúen como estabilizadores, ligandos para receptores específicos, moléculas desestabilizadoras del endosoma, señales de localización nuclear. Por ejemplo, se ha utilizado polietilén-glicol para aumentar la estabilidad de lipoplexos en el torrente sanguíneo y evitar la inactivación por el suero. Asimismo, ha sido muy utilizada la unión de poli-lisina a transferrina o a orosomucoide, para conseguir unión específica a receptores hepáticos. Otra estrategia utilizada con bastante éxito ha sido la formación de lipoplexos que además incluyen partículas del virus hemaglutinante del Japón

14 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 14 (virus Sendai) inactivados, lo que proporciona una entrada en las células muy eficaz (por la fusogenicidad del virus Sendai) y buen escape endosomal. Figura Este video muestra la combinación de vectores virales y no virales, con un ejemplo tomado del virus hemaglutinante del Japón (virus Sendai). La siguiente Tabla resume las principales características de los vectores que se han mencionado: Retrovirus Adenovirus AAV No virales Tamaño máximo teórico 7-8 kb 7-8 kb (30 kb) 5 kb No límite Títulos alcanzados durante la preparación (partículas/ml) 10 8 /ml /ml /ml No límite Administración preferente Ex vivo Ex/in vivo Ex/in vivo Ex/in vivo Integración en el genoma Si No Si/No Mínima Duración expresión in vivo Corta Corta Larga Corta Inmunogenicidad Poca Mucha Poca Nada Inmunidad previa Improbable Si Si No Problemas de seguridad Mutagénesis Inflamación Toxicidad Mutagénesis Ninguno Como resumen de todo lo dicho acerca de vectores, podemos concluir diciendo que el vector ideal de terapia génica debería ser fácil de preparar, tener gran capacidad para aceptar genes terapéuticos de gran tamaño, funcionar tanto en células en división como en células quiescentes, ser totalmente inocuo e invisible para el sistema inmune, fácilmente dirigible a distintos tipos de células diana, ser capaz de persistir en las células durante periodos prolongados y poseer elementos reguladores de la transcripción del gen terapéutico que sean fácilmente regulables para poder variar los niveles del producto terapéutico según sea necesario. Hay numerosos ejemplos de cómo se han conseguido mejorar los distintos tipos de vectores para dotarlos con alguna de estas propiedades. Por ejemplo, los retrovirus se han podido pseudotipar con las proteínas de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular para modificar su tropismo. Igualmente, se ha modificado la proteína botón de la fibra de los adenovirus mediante anticuerpos bi-específicos o por modificación genética. Los vectores no virales se han glicosilado para ser selectivamente reconocidos por receptores específicos presentes en distintos tipos celulares. También se han construido sistemas de transcripción regulables muy efectivos, que se pueden incorporar en los distintos tipos de vectores. Aplicaciones clínicas de la terapia génica Desde el caso de la niña Ashanti Da Silva, primer paciente de la historia tratado mediante terapia génica en 1989 por sufrir Inmunodeficiencia Combinada Severa (déficit del enzima adenosín-desaminasa), el número de ensayos clínicos llevados a cabo en todo el mundo ha aumentado rápidamente, de manera que en la actualidad hay varios miles de enfermos incluidos en protocolos clínicos de terapia génica. Como las estrategias utilizadas son variadísimas, a continuación se resumen las más utilizadas hasta el momento:

15 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 15 Terapia génica del cáncer: la estrategia más utilizada es, sin duda, la utilización de los llamados genes suicidas. Se trata de transferir a las células tumorales un gen que codifique una proteína capaz de activar un pro-fármaco inactivo a su forma activa. Es muy popular la utilización del gen de la timidínkinasa del virus del Herpes Simplex (HSV-tk), que codifica una timidín-kinasa capaz de fosforilar el ganciclovir a ganciclovir-trifosfato. El ganciclovir tri-fosfato es la forma activa capaz de interferir con la replicación del ADN y provocar la muerte de las células que están dividiéndose activamente. Por tanto, si somos capaces de transferir el gen de la HSV-tk a las células de un tumor, que tienen una alta tasa replicativa, la administración sistémica de ganciclovir conseguirá matar selectivamente las células tumorales. Una ventaja añadida es el llamado efecto espectador (bystander), mediante el cual la timidínkinasa producida en unas células puede pasar a las células vecinas, de forma que aunque no todas las células tumorales hayan incorporado el gen terapéutico, el efecto citotóxico es bastante homogéneo en todo el tumor. Esta estrategia se ha empleado en tumores cerebrales, usando vectores retrovirales para transducir sólo células tumorales (en división) pero no neuronas (que no se dividen). También se ha empleado con éxito en tumores hepáticos, usando en este caso vectores adenovirales. Otra estrategia utilizada en terapia génica del cáncer se basa en la suplementación de las células malignas con genes supresores tumorales (p53, por ejemplo). Se ha utilizado también la transferencia al tumor de genes que inhiben la angiogénesis (endostatina, angiostatina, etc) para eliminar el tumor por falta de aporte vascular. Por último, una de las estrategias que han tenido más éxito y que ofrecen mejores perspectivas de futuro es la inmunopotenciación, es decir, favorecer la puesta en marcha de una respuesta inmune frente a las células tumorales. En este sentido, se han transferido los genes de gran variedad de citoquinas o moléculas inmunopotenciadoras (IL-2, IL-12, GM- CSF, IFN-, TNF, etc.) tanto a células tumorales como a células presentadoras de antígeno (células dendríticas), o bien se han transferido a las células tumorales los genes de moléculas co-estimuladoreas del complejo mayor de histocompatibildad (por ejemplo, B7.1) para favorecer la presentación de los antígenos tumorales. El video de la Figura muestra algunos ejemplos de utilización de terapia génica frente al cáncer. Terapia génica de enfermedades hereditarias: la mayoría de las enfermedades metabólicas debidas a mutaciones inactivantes en genes que codifican proteínas con actividad biológica (un enzima, un factor de coagulación, una hormona, etc) pueden abordarse mediante una estrategia de suplementación génica que restaure los niveles de la proteína deficiente. Por ejemplo, se ha utilizado la transferencia génica al músculo para conseguir la producción local de distrofina en casos de distrofia muscular de Duchenne. De manera similar, se han transferido genes al músculo o al hígado para que estos órganos secreten al torrente circulatorio un factor que está ausente. En este sentido, ha tenido especial resonancia el éxito alcanzado con la transferencia mediada por virus adenoasociados del gen del factor IX de la coagulación al músculo esquelético, para producir niveles plasmáticos de este factor que puedan corregir los defectos en la coagulación que sufren animales hemofílicos. En los últimos años, hemos asistido a importantes avances en este campo, como la curación de dos niños con adrenoleucodistrofia, la restauración de la visión tricromática en monos daltónicos, la curación de un paciente adulto con talasemia, la reparación de una mutación causante de hemofilia mediante nucleasas de dedos de zinc, o la curación de 13 niños burbuja.

16 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 16 Inmunización frente a enfermedades infecciosas mediante transferencia génica, con el fin de que las células sinteticen péptidos inmunogénicos y estimulen al sistema inmune hasta eliminar el agente patógeno. Se están ensayando inmunizaciones génicas frente a virus (virus B y virus C de la hepatitis, virus de la gripe) u otros agentes, como el parásito de la malaria. Es bastante eficaz la inyección directa de un plásmido en músculo o la transferencia intradérmica mediante pistola génica. En general, la eficacia de estos tratamientos reside en la capacidad de producir localmente una proteína que sea liberada y capturada por macrófagos y otras células presentadoras de antígenos, que procesan esas proteínas a pequeños péptidos y los presentan con moléculas de clase II del sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) para estimular las células CD4+ (linfocitos T helper). Además, si las células transfectadas expresan moléculas de clase I del MHC también podrán presentar los péptidos recién sintetizados y estimular células CD8+ (linfocitos T citotóxicos). Tras más de 20 años de trabajo, la terapia génica está comenzando a demostrar su utilidad clínica en humanos, como se ha visto en los párrafos anteriores. De todas formas, aún será necesario esperar a los resultados de los ensayos clínicos que están en marcha en todo el mundo. En 2011 había 1714 ensayos clínicos activos, el 79% de ellos en fase I (estudio de toxicidad) ó fase I/II. El resto son ensayos en fase II (estudio de eficacia terapéutica) o en fase III, y dos están ya en fase IV. Las tablas siguientes, tomadas del sitio web del Journal of Gene Medicine, agrupan estos ensayos por tipos de enfermedad, vector o molécula terapéutica:

17 CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 17