Descubra la Cromatografía de Convergencia UltraPerformance : UPC² Waters UPC² Workshop Mayo 2012 Cerdanyola del Vallès

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1 Descubra la Cromatografía de Convergencia UltraPerformance : UPC² Waters UPC² Workshop Mayo 2012 Cerdanyola del Vallès 2012 Waters Corporation 1

2 Agenda 09:15 Bienvenida 09:45 Introducción a la Cromatografía Supercrítica 10:00 Presentación del sistema ACQUITY UPC2 y de la tecnología de columnas asociadas 11:00 Pausa 11:30 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio. Grupo 1: Estudio de una mezcla en UPC2. Grupo 2: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC 13:00 Comida 14:00 Sesiones prácticas paralelas en el laboratorio. Grupo 1: Estudio de una mezcla en fase reversa UPLC. Grupo 2: Estudio de una mezcla en UPC2 15:30 Mesa redonda: Cómo aprovechar las posibilidades que ofrece el sistema UPC2 16:00 Conclusiones 16:30 Fin del seminario 2012 Waters Corporation 2

3 Introducción a la Tecnología de Fluidos Supercríticos 2012 Waters Corporation 3

4 Aplicaciones de los Fluidos Supercríticos Cromatografía (SFC) Analisis y Purificación Separaciones Quirales Fase Normal SF Diseño de Partículas (RESS & SAS) Polymerización Cristalización Impregnación Supercritical CO 2 Extracción (SFE) Compuestos Bioactivos Nutraceuticos Espécies y aromáticos Decafeinización Descontaminación o lavado Recuperación de compuestos valiosos en residuos Reacción Hidrogenación Hidroformilación Carboxilación 2012 Waters Corporation 4

5 Que es un Fluido Supercrítico? Gas Similar. Su baja viscosidad le confiere difusividad y limita la caída de presión Liquido Similar. Su elevada densidad le asegura buenas propiedades como solvente Alto Coeficiente de Difusión, aumenta el rendimiento cinético de la SFC 2012 Waters Corporation 5

6 CO 2 vs Solventes Densidad (g/cm 3 ) Viscosidad (x10 4 PaS) Difusividad (x10 9 m 2 /s) CO 55 C & 200 bar C 6 H 25 C 25 C MeCl C Waters Corporation 6

7 Qué Fluido Supercrítico? 2012 Waters Corporation Courtesy of A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Pr J-L. Veuthey, University of Geneva 8

8 CO 2 Diagrama de Fases 2012 Waters Corporation 9

9 Por qué CO 2? CO 2 Alcanza el Estado Supercrítico a 31.1ºC y 73.8 bar Su estado físico es fácilmente manipulable CO 2 es no tóxico y no inflamable CO 2 es químicamente puro, estable y un solvente no-polar, también compatible con detectores de LC CO 2 es un solvente Verde Se recupera de procesos industriales y plantas de fermentación Evita la producción de CO 2 que habría sido generada por el tratamiento de los solventes que sustituye Se necesita menos tiempo y energía para evaporar fracciones para conseguir los analitos puros 2012 Waters Corporation 10

10 Reducción de costes 2012 Waters Corporation 11

11 Que es un Cromatógrafo de Fluidos Supercríticos (SFC)? CO 2 se usa como fase móvil en combinación con uno o mas solventes orgánicos Gran variedad de fuerza de solventes La composición del modificador orgánico puede variar del 0 al 100% (típicamente metanol) Técnica Cromatográfica similar al HPLC Características Únicas Fase móvil comprimible Refrigerador para bomba de CO 2 Celda UV resistente a la Presión Regulador de Presión 2012 Waters Corporation 12

12 Difusividad ~ Velocidad/Eficacia Velocidad Lineal Óptima U opt 1.63D d p m L U Tiempo de Retención t R = ( 1+ K' ) Eficacia: L N 2 d p Alta difusividad (D m ), mayor velocidad lineal óptima U opt. El mismo número de picos se pueden separar en menos tiempo. Misma L, SFC es 3-10 veces mas rápida por la U opt En el mismo tiempo de análisis, 3-10 columnas mas largas pueden utilizarse en SFC, N es por tanto 3-10 mayor Waters Corporation 13

13 Comparativa Curvas de Eficacia HPLC 5 µm HTLC/Monolith SFC 5 µm HPLC 3 µm UPLC 2 µm Waters Corporation Courtesy of C. West, E. Lesellier, ICOA University of Orléans 14

14 Condiciones de Análisis Rápidas H (µm) Van Deemter curve H = f(u) u opt Only 25% efficiency loss 3 x u opt Condiciones Generic conditions Genéricas 2-EP, 150 x 4.6mm, 5µm. CO 2 -MeOH, 3.5mL/min 10mL/min Oven 40 C 200bar UV 220nm u (mm/s) AU min 4 Steroids 1. Androstenedione 2. Mestanolone 3. Testosterone 4. Stanozolol 1.90 min Minutes AU I II III IV V VI I II III IV 0.85 min Benzodiazepines I. Midazolam II. Flunitrazepam III. Lormetazepam IV. Clorazepam V. Nitrazepam VI. Oxazepam 2.75 min Minutes V VI 2012 Waters Corporation Courtesy of A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Pr J-L. Veuthey, University of Geneva 15

15 Viscosidad ~ Velocidad/Eficacia Eficacia: L N 2 d p R s = 0.25 N α 1 k 2 α 1+ k 2 Aumento de Presión: P 250LηF d 2 d 2 p c El aumento de número de platos en HPLC está principalmente limitado por la presión (El aumento de L y la disminución del dp implica aumento de presión). La baja viscosidad, disminuye el aumento de presión, permitiendo el aumento del caudal y la longitud de la columna, incluso el acoplamiento de varias columnas para mejorar la separación Waters Corporation 16

16 Analisis de Alta Resolución Analytical conditions : CO 2 -MeOH gradient mode, 4mL/min ; PrincetonSFC 2EP 150 x 4.6mm, 5µm; Oven 40 C ; 150bar ; 220nm BZD 1. Diazepam 2. Midazolam 3. Flunitrazepam 4. Lormetazepam 5. Flurazepam 6. Alprazolam 7. Triazolam 8. Clorazepam 9. Bromazepam 10. Nitrazepam 11. Clonazepam 12. Oxazepam 13. Lorazepam 14. Clozapine 15. Olanzapine P c = x 4.6mm, 5µm x 4.6mm, 5µm 30bar 80bar R 1 N N R 2 R 4 R 5 R 3 P c = Waters Corporation Courtesy of A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Pr J-L. Veuthey, University of Geneva 17

17 Qué compuestos pueden analizarse por SFC? Cualquier compuesto soluble en metanol o un solvente orgánico mas apolar. Ácidos Orgánicos Fuertes y Bases requieren modificador con aditivo (DEA, TFA). La mayor parte de sales y ácidos orgánicos y bases. Pequeños péptidos lipofílicos Se pueden separar solutos apolares como ceras y aceites 2012 Waters Corporation 18

18 Ventajas del SFC Mayor velocidad y Productividad Mejor forma de pico Mejor resolución Re-equilibrado mas rápido Reducción del ciclo de análisis Mas muestras por día SFC complementa RP-LC Técnica de fase normal Compatible con MS Selectividad Diferente Mejor retención de compuestos polares. SFC mejora la separación de isómeros y enantiómeros, y compuestos de estructura similar. No substituye completamente el HPLC, pero permite analizar el ~80% de moléculas pequeñas Zhao Y. et al. LC GC Europe, 2004, 174 (4), Waters Corporation 19

19 Recordatorio: Partículas menores aumentan la Productividad 2012 Waters Corporation 20

20 Tienen las columnas con química de menor tamaño de partícula (< 2 µm) los mismos benefícios en SFC, que el que tienen en HPLC? 2012 Waters Corporation 21

21 Curvas de Eficacia en Columnas de SFC 5.0 µm XBridge HILIC, 3.0x50 mm 3.5 µm XBridge HILIC, 3.0x50 mm 2.5 µm XBridge HILIC, 3.0x50 mm 1.7 µm ACQUITY BEH, 3.0x50 mm Condiciones Isocráticas CO 2 /Methanol 85: bar Presión de Salida 2012 Waters Corporation 22

22 Comparación de Resolución µm 3.0x100 mm Column 2 ml/min CO 2 /Methanol Gradient AU µm AU Minutes 2012 Waters Corporation 23

23 ACQUITY UPC 2 Nuevo Miembro 2012 Waters Corporation 24

24 en la Familia ACQUITY 2012 Waters Corporation 25

25 2012 Waters Corporation 26

26 Gold Award en Pittcon! 2012 Waters Corporation 27

27 ACQUITY UPC 2 Características de Sistema Rango de caudal a ml/min Máxima presión de trabajo 6,000 psi (413 Bar) up to 4mL/min Convergence Manager que contiene BPA integrado Cuatro nuevas químicas de columnas de 1.7µm Software Estandar de Waters (MassLynx o Empower ) Completa compatibilidad con la consola de Empower Connections INSIGHT 2012 Waters Corporation 28

28 ACQUITY UPC 2 System 2012 Waters Corporation 29

29 3 Configuraciones de sistema Configuración 1 2 SFC Columns Configuración 2 4 SFC Columns Configuración 3 6 SFC Columns 2012 Waters Corporation 30

30 Calidad CO 2 Presión : ~ 60 bar Calidad alimentaria >99.97% Pureza Sin necesidad de manoreductor Una botella estandar de CO 2 (B50 sifonado) puede durar ~3-4 semanas Waters Corporation 31

31 CO 2 y seguridad CO 2 Monitorización Un detector de CO2 debe situarse a unos 60cm de altura (a menor altura que la mesa del instrumento). El detector debe iniciar una alarma a 4500 ppm de CO 2. Waters no recomienda ningún distribuidor específico. O 2 Monitorización 2012 Waters Corporation 32

32 UPC² Químicas de Columna 2012 Waters Corporation 33

33 2012 Waters Corporation 34

34 Clasificación Unificada CO 2 /MeOH 90/ Waters Corporation Courtesy of C. West, E. Lesellier, ICOA University of Orléans 39

35 Retención en Fases Estacionarias: Compuestos con propiedades similares 2012 Waters Corporation 40

36 Diferentes Selectividades Coumarin 2. Flavone 3. Caffeine 4. Thymine 5. Papaverine 6. Sulfamethoxazole 7. Cytosine 8. Sulfamethizole BEH 2-EP BEH CSH Fluoro-Phenyl Columna: 4.6 x 150mm, 5 µm 5-40% MeOH sin aditivo 3.0mL/min at 40 C, 150 bar Volumen Inyección: 3µL Minutes 2012 Waters Corporation 41

37 ACQUITY UPC² Químicas de Columna Primer set de químicas de columna sub-2 µm Diseñadas y testadas para el sistema ACQUITY UPC² Alta eficacia y resolución Amplio rango de selectividad 3.5 µm Químicas de columna Máxima flexibilidad para resolver cualquier análisis 2012 Waters Corporation 42

38 ACQUITY UPC² Químicas de Columna BEH 2-EP (2-Ethylpyridine) Buena retención, forma de pico y selectividad BEH Intensa interacción con grupos polares como fosfolípidos CSH Fluoro-Phenyl Buena retención de bases débiles Ordenes de elución alternativos para compuestos ácidos y neutros HSS C 18 SB Analisis de glicéridos en matrices diversas (Farmacéuticos, alimentación ) Columnas disponibles en formato sub-2-µm Disponible en Q en tamaño de partícula de 3.5 µm y todas las columnas HSS Línea Viridis Las 4 químicas en 5 µm 2012 Waters Corporation 43

39 Batch Testing Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen el resultado del test del batch de SFC en el Certificado de Análisis (CoA) Todas las columnas ACQUITY UPC² tienen un e-cord conectado 2012 Waters Corporation 44

40 Sesiones Workshop 2012 Waters Corporation 45

41 Mesa Redonda 2012 Waters Corporation 46