CHOLERA O1 SMART TM II
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- Felipe Ortíz Vargas
- hace 7 años
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1 CHOLERA O1 SMART TM II 25 Determinaciones Reorder No R Un inmunoensayo colorimétrico para la detección directa de Vibrio cholerae O1 (sólo para uso de investigación) NEW HORIZONS DIAGNOSTICS CORPORATION 9110 Red Branch Road Columbia, Maryland USA 410/ / Fax
2 Uso: El Cholera SMART TM II (Sensitive Membrane Antigen Rapid Test) es un inmunoensayo colorimétrico en formato de flujo lateral, diseñado para la detección presuntiva directa y rápida de Vibrio cholerae O1 en muestras clínicas, como apoyo a los métodos de cultivo tradicionales. Introducción: Las epidemias de cólera causadas por Vibrio cholerae O1, continúan siendo devastadoras y de gran relevancia global, sobre todo en muchos países en vías de desarrollo. Clínicamente el cólera puede variar desde una presentación asintomática, hasta una diarrea severa con pérdida masiva de líquidos, lo que conlleva a deshidratación, desbalance hidroelectrolítico y muerte. Vibrio cholerae O1 causa esta diarrea secretora mediante colonización del intestino delgado y la producción de una potente toxina. Por la importancia clínico-epidemiológica del cólera, es crítico determinar, tan pronto como sea posible, si el organismo está presente o no en las heces diarreicas de un paciente con diarrea acuosa. Este método es rápido, simple y confiable para detectar Vibrio cholerae O1 y tiene gran valor para los clínicos en el manejo de la enfermedad y para los oficiales de salud pública para implementar las medidas de control. Los anticuerpos monoclonales de NHD proveen especificidad para el antígeno O1 de Vibrio cholerae, evitando los problemas inherentes que se han encontrado en el uso de anticuerpos policlonales anti-o1 para la identificación de V. cholerae O1 a partir de muestras. La prueba de Cholera SMART TM II es simple y se puede realizar en aproximadamente 15 minutos. La prueba Cholera SMART TM II de flujo lateral reemplaza el sistema de flujo de muestra a través del Cholera SMART TM previamente utilizado, el cual se basaba en un sándwich de anticuerpos monoclonal anticuerpo policlonal. Pruebas in house del Cholera SMART TM II han mostrado un desempeño equivalente al del Cholera SMART TM. Principio de la prueba: El Cholera SMART TM II es un ensayo rápido, cualitativo en formato de flujo lateral. Un anticuerpo monoclonal específico anti-a, marcado con partículas de oro coloidal (coloración roja), es aplicado a una membrana y luego secado. La muestra se coloca en un dispositivo de filtración y si es necesario, se trata previamente con buffer de extracción. Cuando se dispensan en el hoyo de muestra (S), aproximadamente 4 gotas de la muestra clínica tratada, a través del dispositivo de filtración, este conjugado con oro coloidal reacciona con el antígeno A presente en la muestra y migra a lo largo de la membrana hasta alcanzar dos zonas de captura de anticuerpos, (T) Test y (C) Control. Aquellos conjugados anticuerpo-oro coloidal, que se han unido al antígeno de V. cholerae O1 presente en la muestra, se unirán luego en la zona de captura del anticuerpo anti-v. cholerae O1, observándose una línea de color rojo, detectable a simple vista, indicando un resultado positivo para la muestra en (T). Si no hay V. cholerae O1 presente en la muestra, no se formará ninguna línea en (T) y la muestra continuará migrando hasta alcanzar la línea del control positivo (C), la cual no es específica para el antígeno A, cualquier exceso de conjugado anticuerpo-oro coloidal será retenido en la línea (C), evidenciándose como una línea roja. La línea en (C) debe ser visible para asegurar que el aparato está trabajando de manera apropiada. La aparición de una línea en (C) es indicativo de una muestra negativa por V. cholerae O1. La
3 aparición de dos líneas, una en (T) y otra en (C) es indicativa de una muestra positiva por V. cholerae O1. El tiempo total para realizar la prueba es menor a 20 minutos. Materiales provistos: Cada kit contiene lo siguiente en cantidades suficientes para realizar 25 determinaciones: Foil pouch (paquete de papel aluminio): Chase buffer (buffer de arrastre): Positive control reagent (reactivo control positivo): Extraction buffer (buffer de extracción): Specimen filtering (filtración de muestras): Cada paquete contiene un aparato de Cholera SMART TM II Cada botella de Chase buffer contiene agua procesada, detergentes y 0.05% azida de sodio (preservante) La botella de reactivo control positivo contiene organismos de V. cholerae O1 inactivados con calor en buffer con 0.05% azida de sodio (preservante) La botella de buffer de extracción contiene tris salina buferizada con EDTA y 0.05% azida de sodio (preservante) Aparato para filtración de muestra: Tubo de plástico suave y tapa con filtro. Gotero de vidrio: El gotero de vidrio está marcado a los 0.3 / 0.5 ml Goteros de plástico: Goteros de plástico desechables Almacenamiento y estabilidad: PRECAUCIÓN: NO CONGELE La fecha de expiración del kit, anotada en la etiqueta de la caja, depende del almacenamiento apropiado de los componentes. Los reactivos se pueden mantener, ya sea refrigerados, o a temperatura ambiente (2 a 3 0 C). Precauciones: 1. Se deben seguir las mismas medidas de bioseguridad en la manipulación y disposición de los materiales empleados en la prueba, que las que se aplican con cualquier otro material microbiológico / clínico. 2. Todos los reactivos contienen 0.05% azida de sodio (preservante). La azida de sodio puede reaccionar con el plomo y el cobre de las tuberías formando metales de azida altamente explosivos. Para descartar, puede hacerlo en el drenaje con agua abundante.
4 3. Los reactivos se han probado como una unidad. No sustituya reactivos de lotes diferentes. 4. No use reactivos que ya cumplieron con la fecha de expiración. 5. No diluya ninguno de los reactivos. Esto tendrá un impacto tanto en la sensibilidad como en la estabilidad de la prueba. Recolección y manipulación de muestras: La muestra debe ser un espécimen fecal. Las muestras que no se van a analizar inmediatamente se deben congelar. Alternativamente, las muestras se pueden colocar en Agua Peptona Alcalina (APA) a una dilución 1:10 (volumen de muestra : volumen de APA) e incubar por un máximo de 24 horas antes de realizar el análisis. El uso de hisopados rectales no está recomendado. Si se va a emplear un hisopado rectal, el mismo se debe colocar en 1 ml de APA e incubar a C por un máximo de 24 horas antes de realizar el análisis. El transporte de hisopados rectales en Medio Cary Blair puede reducir la sensibilidad de la prueba. Sin embargo, si se va a emplear este método de transporte, se recomienda colocar directamente el hisopo en el aparato de filtración, conteniendo 1 ml de buffer de extracción y mezclar vigorosamente. Preparación de la muestra: 1. Si la muestra es líquida, use el gotero plástico desechable para colocar la muestra en el tubo de plástico del aparato de filtración. Llene aproximadamente la mitad del tubo. Coloque la tapa provista para tal fin. Mezcle bien. Si la muestra contiene partículas grandes, las mismas se deben dejar sedimentar antes de dispensar la muestra en el aparato de filtración. 2. Si la muestra es semisólida o formada, use un palito de madera para colocar una porción de la muestra en el tubo de plástico del aparato de filtración. Llene aproximadamente una cuarta parte del tubo. Usando un gotero de vidrio, adicione al tubo aproximadamente 0.5 ml de buffer de extracción. Coloque la tapa del tubo y cierre bien. Mezcle vigorosamente. La agitación vigorosa va a producir suficiente volumen de muestra para ser procesada. De lo contrario, adicione 0.5 ml más de buffer de extracción y agite de nuevo. Si aún es difícil que la muestra atraviese el filtro, del aparato de filtración, se debe dejar que las partículas grandes de la muestra sedimenten. Es importante no diluir las muestras más de lo sugerido, ya que esto podría reducir la sensibilidad de la prueba.
5 Procedimiento de la prueba: 1. Recolecte la muestra de heces y siga las indicaciones para asegurarse de que la misma se encuentra en forma líquida. 2. Abra el sobre de aluminio foul pouch y saque el dispositivo de flujo lateral Cholera SMART TM II. Saque los contenidos. Marque el dispositivo con la identificación de la muestra empleando un marcador permanente. 3. Invierta y oprima el dispositivo de filtración de muestra para dispensar 4 gotas en el hoyo de muestra (S) del dispositivo de flujo lateral. Antes de dispensar la muestra, mediante presión al vial, asegúrese de que la tapa del dispositivo de filtración esté bien cerrado (observación del traductor, no es parte del texto original del panfleto) 4. Espere aproximadamente 3 minutos o hasta que la muestra se haya absorbido en el hoyo de la muestra. Luego adicione dos gotas de Chase buffer en el hoyo de la muestra. 5. Lea los resultados después de 15 minutos (no más de 30 minutos) después de adicionar la muestra. Observe el desarrollo de color en el Control (C) y la línea Test (T) y anote los resultados. Utilice la tabla para interpretar resultados. Las reacciones positivas fuertes pueden producir resultados en menos de 10 minutos. Control de calidad: Realice el control de calidad del Cholera SMART TM empleando el reactivo Positive control reagent cada día que va a realizar la prueba para asegurar el desempeño apropiado del kit. 1. Abra el sobre de aluminio y saque el dispositivo de flujo lateral Cholera SMART TM II. Saque los contenidos y marque el dispositivo como Control Positivo utilizando un marcador permanente. 2. Adicione 4 gotas del Positive control reagent en el hoyo de la muestra del dispositivo de flujo lateral Cholera SMART TM II. 3. Siga los pasos 4 5 del punto anterior. 4. Deberán aparecer dos líneas: una en la línea Control (C) y otra en la línea Test (T), indicando una muestra positiva. Si no aparece una línea roja en la línea Test (T) o
6 en la línea Control (C) y en la línea Test (T), revise las instrucciones y repita la prueba. Si el resultado del control de calidad no es satisfactorio, no reporte los resultados de las pruebas realizados en ese día. Por favor contacte New Horizons Diagnostics para obtener asistencia técnica o para reemplazar las pruebas a los teléfonos: o (410) El Chase buffer podría ser empleado como Control Negativo y para realizar la prueba se sigue el procedimiento descrito anteriormente. 6. La aparición de una línea roja sólo en la línea Control (C), indicará que la muestra es negativa. También se puede emplear como control negativo un cultivo de Vibrio cholerae no O1. Resultados: Prueba positiva Prueba negativa Inválido Inválido Aparición de una línea roja clara en las marcas Control (C) y Test (T). Aparición de una línea roja clara sólo en la marca Control (C) y ausencia de línea roja en la línea Test (T). Aparición de una línea roja sólo en la línea Test (T) y ausencia de línea roja en la línea Control (C). No se observan líneas coloreadas. La muestra no migró. Ilustraciones: S T C S T C POSITIVO NEGATIVO S T C S T C INVALIDO INVALIDO
7 Limitaciones del procedimiento: 1. Los resultados obtenidos con el uso de esta prueba rápida se deben complementar con otra información disponible, incluyendo síntomas y resultados del cultivo. No se pretende que el Cholera SMART TM II se emplee como el único diagnóstico para las infecciones por V. cholerae O1. 2. Cholera SMART TM II no detecta Vibrio cholerae no O1, incluyendo V. cholerae O139, una nueva cepa epidémica que causa cólera en el sudeste asiático. Las cepas de V. cholerae no O1 pueden causar diarrea y otros síntomas similares a las que presenta V. cholerae O1. 3. El Cholera SMART TM II no ha sido validado para su uso con especímenes fecales. El uso de hisopos y especímenes como orina, saliva o exudados de heridas no ha sido confirmado. 4. Cholera SMART TM II reconoce un antígeno presente en el lipopolisacárido de V. cholerae O1. La prueba detecta tanto bacterias viables como no viables, pudiendo resultar positivo aún después de un tratamiento exitoso. 5. Cholera SMART TM II puede diferenciar V. cholerae serogrupo O1 de V. cholerae serogrupo no O1, pero no permite diferenciación entre los serotipos de V. cholerae O1 (Inaba, Ogawa), ni tampoco puede eliminar la realización de la prueba de sensibilidad a los antibióticos. Valores esperados: El cólera produce epidemias y es endémico en ciertas áreas del mundo. Fuera de estas áreas, la ocurrencia del cólera es muy rara. Casos esporádicos de gastroenteritis causada por V. cholerae O1 se han identificado en áreas no endémicas, usualmente asociados al consumo de mariscos crudos, viajes a áreas epidémicas, ingestión accidental de comida o agua contaminada o otros comportamientos de riesgo. Características del desempeño: Cholera SMART TM II ha mostrado un desempeño equivalente al del Cholera SMART TM en pruebas de laboratorio.
8 Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica del Cholera SMART TM II se analizó empleando suspensiones de V. cholerae O1 a partir de un cultivo puro. Se prepararon diluciones a partir de una suspensión bacteriana inicial y el número de bacterias fue estimado por densidad óptica a 650 nm. Cholera SMART TM II detectó, de manera consistente, suspensiones que contenían al menos 2 x 10 7 ufc / ml de V. cholerae O1 (tanto del serotipo Inaba como Ogawa). Cholera SMART TM II fue analizado con ocho cepas de V. cholerae O1, incluyendo cepas Inaba y Ogawa y fue positivo para todas las cepas analizadas. Reacciones cruzadas: La reactividad cruzada del Cholera SMART TM II para otros organismos se valoró usando suspensiones de cultivos puros conteniendo > 10 8 ufc / ml. Ninguno de los organismos analizados mostró ninguna reacción cruzada en la prueba. Los organismos probados fueron (en el paréntesis se indica el número de cepas analizadas): Aeromonas hydrohila (2), Escherichia coli (3), Pseudomonas aeruginosa (1), Salmonella Typhi (1), Serratia marcescens (1), Shigella dysenteriae tipo 1 (1), V. cholerae no O1 (3), Vibrio cincinnatensis (1), Vibrio damsela (1), Vibrio harveyi (1), Vibrio hollisae (1), Vibrio ordalii (1) y Vibrio vulnificus (2) Red Branch Road Columbia, Maryland USA NHDiag@aol.com / fax
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