Anti-HCV. Imuno-Elisa

Transcripción

1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Bendinelli, M. et al.: Hepatitis C vírus: Biology, Patogénesis, Epidemiology, Clinical Description, and Diagnosis, In: Specter, S. Editor. Viral Hepatitis Diagnosis, Therapy, and Prevention. Humana Press: , Choo, Q.-L.; Kuo, G. et al.: Isolation of cdna clone derived from a blood-borne non-a, non-b viral hepatitis genome. Science, 244: , Choo, Q.-L,; Weiner, A.J.; Overby, L.R. et al.: Hepatitis C Virus: The major causative agent of viral non- A, non-b hepatitis. Br Med J, 46: , Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Hepatitis C virus (H). Viral Hepatitis. Bios Scientific Publishers Limited: , Detection and Quantitation of H in serum. In: Lau, J.Y.N. editor. Hepatitis C Protocols. Humana Press: , CDC. Guidelines for laboratory testing and results reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR: 52 (RR-3), World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual. Geneva: World Health Organization, 04. MS Imuno-Elisa Anti-H Kit de 3ª geração para determinação qualitativa de Anticorpos Contra o Vírus da Hepatite C (Anti-H) no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). 3rd generation kit for qualitative determination of antibodies against Hepatitis C Virus (Anti- H) in human serum or plasma, by enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit de 3ª generación para determinación cualitativa de Anticuerpos Contra el Vírus de la Hepatitis C (Anti-H) en suero o plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC Edição I: Rev. 09/12

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA O vírus da hepatite C é o maior causador de hepatites não-a, não-b. Estima-se que cerca de 3% da população mundial, 170 milhões de pessoas sejam portadores de hepatite C crônica, constituindo-se num sério problema de saúde no mundo. O vírus da hepatite C é do tipo RNA, pertencente à família Flaviviridae. Há vários genótipos deste vírus, sendo 6 (1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5a e 6a) os mais importantes. Alguns têm distribuição em todo o mundo (1a, 1b, 2a, 2b), enquanto outros são somente encontrados em regiões específicas (5a e 6a). No Brasil encontramos os genótipos 1a, 1b, 2a, 2b e 3, com predominância do genótipo 1 sobre os outros (60% do 1 contra 40% dos outros). O genótipo 1 tende a não ter boa resposta ao tratamento que os demais. O período de incubação da hepatite C é em média de 6 a 7 semanas, com uma faixa de 2 a 26 semanas. Aproximadamente, a 30% dos pacientes com infecção aguda tem icterícia, 70% são assintomáticos, 70 a 85% evoluem para hepatite crônica, com conseqüente risco de desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular. Os anticorpos anti-h surgem 4 a semanas após o contágio. Os fatores de risco associados à transmissão do H são, principalmente, as exposições percutaneas através de transfusão e transplante de doadores infectados e uso de drogas injetáveis, em menor proporção hemodiálise e acidentes perfuro-cortantes. Outros fatores incluem a transmissão sexual e contato com familiares H positivos. Associado a estes se encontra um alto percentual de pacientes (45%) sem causa específica, mas cuja característica é que a maior parte destes pertencem a um nível sócio-econômico baixo. O avanço no desenvolvimento de testes diagnósticos para hepatite não-a, não-b veio com a clonagem do genoma do H por Qui-Lim Choo e colaboradores, em Este genoma possui cerca de nucleotídeos e no mínimo 9 proteínas codificadas, 3 são estruturais (Core, E1 e E2) e 6 não-estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B). O teste rotineiramente utilizado para diagnóstico de hepatite C é o teste imunoenzimático (ELISA) que apresenta ótima sensibilidade e especificidade, especialmente os de última geração. Entretanto, deve-se sempre considerar na sua interpretação a possibilidade de falsos resultados negativos nos primeiros meses após a contaminação e a de resultados falsamente positivos em doadores de sangue ou grupos de indivíduos com baixo valor preditivo de contaminação pelo H. Portanto, testes confirmatórios, como o RIBA e o NAT, devem sempre ser utilizados nestas condições. O Imuno-ELISA anti-h da WAMA é um teste imunoenzimático de 3ª geração que utiliza proteínas recombinantes Core, NS3, NS4 e NS5 do H para detectar a presença de anticorpos anti-h no soro ou plasma humano. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com proteínas recombinantes do vírus H (fase sólida). Quando anticorpos anti-h estão presentes na amostra de soro ou plasma, eles reagem com as proteínas recombinantes da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-igg humana de camundongo marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos IgG anti-h. Um substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) é adicionado, o qual revelará uma cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença de anticorpos anti-h. Uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática é adicionada, a qual mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos anti-h é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do H (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - x concentrada (1 x 50 ml) 3. Conjugado anti-igg humana de camundongo marcada com peroxidase (1 x 12 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 6 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Diluente de Amostra (1 x 12 ml) 7. Solução Stop (1 x 6 ml) 8. Soro Controle Negativo (1 x 0,2 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 0,2 ml) TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio de este conjunto diagnóstico, siempre y cuando esté dentro del plazo de validez y sea comprobado por su asesor técnico que no hubo fallas en la ejecución, manejo y conservación de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabilizan por fallas en el kit bajo estas condiciones. 14

3 17 02 b. Precisión Interensayo La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestra de suero positivos en carreras diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 1,099 0,334 Desviación Estándar 0,077 0,031 7,0% 9,2% LIMITACIONES DE USO ŸLa prueba Imuno-ELISA H de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Es de destacar también que los anticuerpos pueden ser indetectables en las etapas iniciales de la enfermedad y en algunos individuos inmunosuprimidos. ŸResultados repetidamente reactivos siempre se deben interpretar con información clínica del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. ŸEjemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. ŸDebido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. ŸLa prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de validez corresponde al último día del mes señalado en la etiqueta de los frascos y de la caja del kit 3. Se debe evitar exponer los reactivos a temperaturas elevadas, así como directamente al sol. 4. No congele cualquier reactivo, pues esto causará deterioro irreversible. 5. Lo Imuno-ELISA Anti-H de WAMA contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y anti-h (excepto el Suero Control Positivo). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No usar reactivos después de la fecha de validez. 13. Descartar el material conforme a las reglamentaciones locales. 14. Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, manipulación y descarte de los materiales. 10. Instruções para uso R E F E determinações 1. Microplacas com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do H (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado anti-igg humana de camundongo marcada com peroxidase (2 x 12 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 6 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (2 x 6 ml) 6. Diluente de Amostra (2 x 12 ml) 7. Solução stop (2 x 6 ml) 8. Soro Controle Negativo (2 x 0,2 ml) 9. Soro Controle Positivo (2 x 0,2 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES ŸMICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. ŸTAMPÃO DE LAVAGEM x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph 7,4 e tween como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 µl. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. ŸCONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE CAMUNDONGO MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. ŸDILUENTE DE AMOSTRA (6): pronto para uso. Contém proteína e azida sódica em tampão fosfato. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. ŸSOLUÇÃO STOP (7): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. ŸSORO CONTROLE NEGATIVO (8): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, negativo para H. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 a 0,05% como conservante. ŸSORO CONTROLE POSITIVO (9): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para H. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 a 0,05% como conservante. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). MARCADOR Anti-H HEPATITIS C - Interpretación de los Marcadores SIGNIFICADO Indica contacto previo con el virus de la hepatitis C, sin embargo, no distingue si la infección es reciente o pasada, y se curó espontáneamente o si no la cronicidad de la enfermedad. AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. Prueba de confirmación: PCR e inmunotransferencia La positividad indica infección activa. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO ŸMicropipeta de 50 µl/100 µl e ponteiras.

4 03 16 ŸÁgua destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem. ŸAgitador de microplaca. ŸIncubador com temperatura de 37 ºC. ŸLeitor de microplaca com filtro de 450 nm. ŸLavadora de Microplaca ŸPapel absorvente. ŸRecipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o soro controle negativo (8) e 2 cavidades para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5). 2. Dispensar 100 µl do diluente de amostra (6) em todas as cavidades da microplaca, exceto no blank. Dispensar 10 µl dos controles positivo (9) e negativo (8) e das amostras conforme o estabelecido no item 1. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 3. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 5. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 6. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 7. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 8. Dispensar 100 µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 9. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37ºC por 30 minutos. 10. Repetir as etapas 5 a Dispensar 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Incubar a 37 C por 30 minutos, protegendo da luz. 13. Bloquear a reação dispensando 50 µl da solução stop (7) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 14. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 10 minutos. NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. Determinar el valor del Cut-off: Cut-off = promedio de la D.O. de los Controles Negativos + 0,12 Atención: Si el valor promedio de la D.O. de los controles negativos es inferior a 0,02, se debe considerar como 0,02. Si el valor es superior a 0,02 debe ser considerado el valor de la D.O. medido, respectando lo criterio de validación del test. Ejemplo: Valor promedio de los Controles Negativos = 0,015 Entonces, CUT-off = 0,02 + 0,12 = 0,14 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente los Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de los controles negativos deben ser inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". Lo valor de la D.O. de los controles positivos deben ser igual o mayor a 0,800 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Dividir lo valor de D.O. de la muestra de paciente por lo valor de Cut-off. Lo test es considerado: REACTIVO : valor igual o mayor que 1. NO REACTIVO : valor menor que 1. DUVIDOSO (Borderline) : SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 498 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 100 eran positivos y 398 negativos se determinó la sensibilidad y la especificidad de lo kit Imuno-ELISA H da WAMA. Sensibilidad = Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdaderos Positivos RESULTADO 100 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,50 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se observó reacción cruzada con sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, vírus de la hepatitis B, citomegalovírus, HIV y Treponema pallidum. No se observó interferencia con factor reumatoide a la concentración de U/ml. Durante las pruebas, sin efecto "Hook" a concentraciones elevadas de anticuerpos fueron observados. Las características de rendimiento de la prueba no es afectada por las altas concentraciones de bilirrubina y hemoglobina. PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y replica bajo, en replicas. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100 µl do diluente de amostra (6) em todas as cavidades da microplaca, exceto no blank. Pipetar 10 µl dos controles negativos (8) (3 cavidades) e controles positivos (9) (2 cavidades) e das amostras nas respectivas cavidades. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 1,056 0,323 Desviación Estándar 0,058 0,024 5,4% 7,4%

5 15 04 inclusive el blank. La solución se tornará amarilla. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 14. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 10 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 100μl del diluyente de muestra (6) en todos los pocillos, excepto el blank. Dispensar 100μl de los controls negativos (8) (3 pocillos) y control positivos (9) (2 pocillos) y muestras en sus respectivos pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 5 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank (debese contener solamiente estes reactivos). El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 8. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 C por 30 minutos. 9. Pipetear 50μl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se volverá amarillo. 10. Homogeneizar por 30 segundos. 11. Leer la D.O. en un lector de microplacas con filtro de 450 nm, contra el blank, o en duplo comprimiento de onda (450/630nm), dentro de 10 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e Pipetar 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank (deverá conter somente estes reativos). A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. 8. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 30 minutos. 9. Pipetar 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela. 10. Homogeneizar por 30 segundos. 11. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630nm) dentro de 10 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle Neg. Controle Neg. Controle Pos. Controle Pos. A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar o valor do Cut-off: Cut-off = média das D.Os. dos Controles Negativos + 0,12 Atenção: Se o valor médio das D.Os. dos controles negativos é menor do que 0,02, ele deve ser considerado como 0,02. Se o valor é maior do que 0,02 considerar o valor da D.O. medida, respeitando o critério de validação do teste. Exemplo: Valor Médio dos Controles Negativos = 0,015 Então, CUT-off = 0,02 + 0,12 = 0,14 VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, deve ser menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. dos controles negativos deve ser menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. dos controles positivos deve ser igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank.

6 05 14 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado: REAGENTE : se valor igual ou maior do que 1. NÃO REAGENTE : se valor menor do que 1. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 498 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência, das quais 100 eram positivas e 398 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ELISA anti-h da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADO ,50 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, citomegalovírus, HIV e Treponema pallidum. Nenhuma interferência foi verificada com fator reumatóide até a concentração de U/mL. Durante os testes realizados, nenhum efeito Hook para altas concentrações de anticorpos foi observado. A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina. PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em replicatas. Amostras Positivas Alta Número de Vezes Média das Absorbâncias 1,056 0,323 Desvio Padrão 0,058 0,024 5,4% 7,4% Baixa b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 pools de soros positivos em diferentes corridas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 1,099 0,334 Desvio Padrão 0,077 0,031 LIMITAÇÕES DE USO Ÿ O teste Imuno-ELISA H da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios iniciais da doença e em alguns indivíduos imunossuprimidos. ŸResultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Ÿ Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. ŸDevido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. ŸA prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 7,0% 9,2% de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,05% como conservante. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). MUESTRAS Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Durante un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO ŸMicropipeta de 50 µl y 100μl y puntas de pipeta. ŸAgua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. ŸAgitador de microplaca. ŸIncubadora con una temperatura de 37 º C ŸLector de micro placa con filtro de 450 nm ŸLavador de microplaca. ŸPapel absorbente. ŸRecipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para el suero control negativo (8) y 2 pocillos para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50μl delsustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5). 2. Dispensar 100μl del diluyente de muestra (6) en todos los pocillos, excepto el blank. Dispensar 10 µl de los controles positivo (9) y negativo (8) y muestras de acordo con lo estabelecido en lo item 1. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 3. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 4. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 5. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 6. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 7. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 8. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 9. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 10. Repetir los pasos 5 al Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima peroxidasa. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Incubar a 37 C por 30 minutos, protegerlo de la luz. 13. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca,

7 13 06 PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplaca con pocillos recubiertos con proteínas recombinantes de lo H (12 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - x concentrada (1 x 50 ml) 3. Conjugado anti-igg humana de ratón marcado con peroxidase (1 x 12 ml) 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 6 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Diluyente de Muestra (1 x 12 ml) 7. Solución Stop (1 x 6 ml) 8. Suero Control Negativo (1 x 0,2 ml) 9. Suero Control Positivo (1 x 0,2 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con proteínas recombinantes de lo H (24 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado anti-igg humana de ratón marcado con peroxidase (2 x 12 ml) 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 6 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (2 x 6 ml) 6. Diluyente de Muestra (2 x 12 ml) 7. Solución Stop (2 x 6 ml) 8. Suero Control Negativo (2 x 0,2 ml) 9. Suero Control Positivo (2 x 0,2 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS ŸMICRO PLACA (1): Retirar del envelope la cantidad de tiras que se utilizarán y dejar que alcancen la temperatura ambiente (-25 ºC). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con disecante, y deben mantenerse entre 2-8 ºC. ŸSOLUCIÓN DE LAVADO X concentrado (2): tampón fosfato salino (PBS), ph 7,4, conteniendo Tween como detergente. Diluir el volumen del concentrado completando 1000 ml con agua destilada o desionizada. Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución.. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente, 350μl de tampón diluido. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25ºC) antes de usar. ŸCONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE RATÓNMARCADO CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO) (4): estabilizado y listo para usar Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar ŸSUSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN B (TMB) (5): solución estabilizada de tetrametilbenzidina Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar La TMB no es ni mutagénica ni carcinogénica. ŸDILUYENTE DE MUESTRA (6): pronto para uso. Contiene proteina y azida de sodio en tampón fosfato. Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. ŸSOLUCIÓN STOP (7): listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manipular con cuidado. Es corrosivo. En caso de contacto con la piel lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. ŸSUERO CONTROL NEGATIVO (8): control diluido en buffer estabilizador de proteínas, negativos para H. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,05% como conservante. ŸSUERO CONTROLE POSITIVO (9): controle diluído en buffer estabilizador de proteínas, positivo para H. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA anti-h da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e anti-h (exceto o Soro Controle Positivo). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar as cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens do reagente estoque, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Descartar o material conforme regulamentações locais. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. MARCADOR Anti-H Teste Confirmatório: PCR e Imunoblot HEPATITE C Interpretação do Marcador SIGNIFICADO Indica contato prévio com o vírus da hepatite C, entretanto, não diferencia se a infecção é recente ou pregressa, e se foi curada espontaneamente ou se houve cronificação da doença. Sua positividade indica infecção ativa. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. ENGLISH SUMMARY The hepatitis C virus is the major cause of non-a, Non-B hepatitis. It is estimated that about 3% of the world's population, 170 million people, are patients with chronic hepatitis C, being a serious health problem in the world. The hepatitis C virus is an RNA type, belonging to the Flaviviridae family. There are several genotypes of the virus, being 6 (1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5a and 6a) the more important. Some are spread throughout the world (1 a, 1b, 2a, 2b), while others are only found in specific regions (5 a and 6a). In Brazil we find the genotypes 1a, 1b, 2a, 2b and 3, with a predominance of genotype 1 over the others (60% of 1 against 40% of others). Genotype 1 tends to not have the same good response to treatment as the remaining ones. The incubation period for hepatitis C is on average 6 to 7 weeks, with a range of 2 to 26 weeks. Approximately to 30% of patients with acute infection have jaundice, 70% are asymptomatic, 70 to 85% develop chronic hepatitis, with consequent risk of development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The anti-h antibodies appear 4 to weeks after the infection. The risk factors associated with the transmission of H are, mainly, the percutaneous display through transfusion and transplantation of infected donors and use of injectable drugs, to a lesser extent hemodialysis and puncture accidents. Other factors include sexual transmission and contact with relatives that are H positive. Associated with these, there is a high percentage of patients (45%) without specific cause, but whose characteristic is most of these belong to a low socio-economical level. A breakthrough in the development of diagnostic tests for non-a, non-b hepatitis came with the cloning of

8 07 12 the H genome by Qui-Lim Choo and collaborators, in This genome has about 9,400 nucleotides and at least 9 encoded proteins, 3 of which are structural (Core, E1 and E2) and 6 non-structural (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B). The test routinely used for diagnosis of hepatitis C is the enzyme linked immunoabsorbant assay (ELISA), which gives excellent sensitivity and specificity, particularly the 3rd generation. However, it should always be considered in its interpretation the possibility of false negative results in the first months after contamination and false positive results in blood donors or groups of individuals with low H contamination predictive value. Therefore, confirmatory tests, such as the RIBA and the NAT, must always be used under these conditions. The Imuno ELISA anti-h from WAMA is a 3rd generation enzyme immunoassay test uses H core, NS3, NS4 and NS5 recombinant proteins to detect the presence of anti-h antibodies in the serum or plasma. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with the recombinant proteins of the H virus (solid phase). When anti-h antibodies are present in the serum or plasma sample, they react with the recombinant proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. A mouse anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the IgG anti-h antibodies. A substrate (TMB+ hydrogen peroxyde) is added, which will reveal a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present, indicating the presence of the anti-h antibodies. An acidic stop solution to block the enzymatic reaction is added, which will change the color of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450 nm. The concentration of anti-h antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. KIT PRESENTATION R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with H recombinant proteins (12 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution concentrated x (1 x 50 ml) 3. Conjugated mouse anti-human IgG marked with peroxidase (1 x 12 ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 6 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (1 x 6 ml) 6. Sample Diluent (1 x 12 ml) 7. Stop Solution (1 x 6 ml) 8. Negative Serum Control (1 x 0.2 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 0.2 ml) 10. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplates with wells coated with H recombinant proteins (24 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution concentrated x (2 x 50 ml) 3. Conjugated mouse anti-human IgG marked with peroxidase (2 x 12 ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 6 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (2 x 6 ml) 6. Sample Diluent (2 x 12 ml) 7. Stop Solution (2 x 6 ml) 8. Negative Serum Control (2 x 0.2 ml) 9. Positive Serum Control (2 x 0.2 ml) 10. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY ŸMICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature ( 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. ŸWASH SOLUTION (x Concentrated) (2): Phosphate buffered Saline (PBS), ph 7.4, containing Tween as detergent. Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with distilled or deionized water. If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each cavity should be supplemented with approximately 350uL. Let it reach room temperature (-25 C) before using. ŸMOUSEANTI-HUMAN IgG HUMANA CONJUGATE LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready for use. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA El virus de la hepatitis C es el mayor causador de hepatitis no-a, no-b. Se estima que aproximadamente 3% de la población mundial, 170 millones de personas son portadores crónicos de la hepatitis C, lo que constituye un grave problema de salud en todo el mundo. El vírus de la hepatitis C es de lo tipo RNA, perteneciente à família Flaviviridae. Hay varios genotipos del virus, sendo 6 (1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5a y 6a) los más importantes. Algunos se distribuyen en todo el mundo (1a, 1b, 2a, 2b), mientras que otros sólo se encuentran en regiones específicas (5a y 6a). En Brasil encontramos genotipos 1a, 1b, 2a, 2b y 3, con un predominio del genotipo 1 en el otro (60% de uno contra el otro 40%). Genotipo 1 tiende a no tener una buena respuesta al tratamiento como otros. El período de incubación de la hepatitis C es de en media 6 a 7 semanas, con una banda de 2 a 26 semanas. Aproximadamente -30% de los pacientes con infección aguda tiene la ictericia, 70% son asintomáticos, 70-85% desarrollan hepatitis crónica, con el consiguiente riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular. Los anticuerpos anti-h parecen 4- semanas después de la exposición. Los factores de riesgo asociados con la transmisión del H son principalmente exposiciones percutáneas a través de la transfusión de y el trasplante de donantes infectados y el uso de drogas por vía parenteral, y en menor medida hemodiálisis y de accidentes de perforación de corte. Otros factores incluyen la transmisión y el contacto sexual con la familiares de H positivo. Asociado a estos tien un alto porcentaje de los pacientes (45%) sin una causa específica, pero cuya característica es que la mayoría de ellos pertenecen a un nivel socioeconómico bajo. El avance en el desarrollo de pruebas de diagnóstico para la hepatitis no-a, no-b llegó con la clonación del genoma del H por Qui-Lim Choo y sus colegas en Este genoma tiene aproximadamente 9400 nucleótidos y al menos 9 proteínas codificadas, 3 son estructurales (Core, E1 y E2) y seis no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). El examen usado rutinariamente para el diagnóstico de la hepatitis C es el inmunoensayo enzimático (ELISA) que tiene una excelente sensibilidad y especificidad, especialmente la de última generación. Sin embargo, siempre debe tenerse en cuenta en la interpretación la posibilidad de resultados falsos negativos en los primeros meses después de la contaminación y los resultados falsos positivos en donantes de sangre o grupos de individuos con bajo valor predictivo de la infección por el H. Por lo tanto, las pruebas confirmatorias como RIBA y NAT, siempre debe ser utilizado en estas condiciones. El Imuno-ELISA anti-h de WAMA es un test imunoenzimático de tercera generación que utiliza proteínas recombinantes Core, NS3, NS4 y NS5 de H para detectar la presencia de anticuerpos anti- H en suero o plasma humano. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con proteínas recombinantes del core del virus H (fase sólida). Cuando anticuerpos anti-vhc están presentes en el suero o plasma, que reaccionan con las proteínas recombinantes de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugado anti-igg humano de ratón marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos IgG anti-h. Un substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente, indicando la existencia del anticuerpo anti-h. Una solución stop ácida de bloquear la reacción enzimática se añade, que cambiará el color de la solución a amarillo. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración de anticuerpos anti-h es directamente proporcional a la intensidad del color de la reacción.

9 11 08 Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 1,056 0,323 Deviation Standard 0,058 0,024 5,4% 7,4% b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 2 pools of positive serum in different runs. Positive Samples High Low LIMITATIONS OF USE The test Imuno-ELISA H from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and in some immunosuppressed individuals. Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA anti-h from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, Hepatitis B surface antige (HBsAg) and anti-h (except in the positive serum control). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Discard the material following local regulations. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. Anti-H Marker Confirmatory test: PCR and Immunoblotting Number of times Average of Absorbances 1,099 0,334 HEPATITIS C - Interpretation of the Markers MEANING Indicates prior contact with the hepatitis C virus; however, does not differentiate if the infection is recent or past, and if it was cured spontaneously or if there was a chronicity of the disease. Its positivity indicates active infection. Deviation Standard 0,077 0,031 7,0% 9,2% Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. ŸCHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION A (HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready for use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. ŸCHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. ŸSAMPLE DILUENT (6): ready for use. Contains protein and sodium azide in phosphate buffer. Stable at until expiration date printed on the bottle. ŸSTOP SOLUTION (7): ready to use. Contains 1.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. ŸNEGATIVE SERUM CONTROL (8): control diluted in proteins stabilizer buffer, negative for H. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin 300 at 0.05% as preservative. ŸPOSITIVE SERUM CONTROL (9): Control diluted in protein stabilized buffer, positive for H. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin 300 at 0.05% as preservative. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED ŸMicropipette of 50 ul and 100 ul and tips. ŸDistilled and deionized water for the dilution of the wash solution. ŸMicroplate shaker. ŸIncubator at 37 C. ŸMicroplate reader with 450nm filter. ŸMicroplate Washer ŸAbsorbent paper. ŸContainer for material disposal PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum negative control (8) and 2 wells for the serum positive control (9). Use one cavity well for the blank, which will only have 50µl of the chromogen substrate solution A (4), and 50µl of chromogen substrate solution B (5). 2. Pipete 100µl of the sample diluent (6) in all the cavity wells, except on the blank. Pipette 10 µl of positive (9) and negative (8) control and of the samples established in step 1. Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 3. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 4. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 60 minutes. 5. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 6. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic).

10 09 10 WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 7. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 8. Pipete 100µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 9. Cover the plate with adhesive sheet and incubate at 37 C for 30 minutes. 10. Repeat the steps 5 to Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 12. Incubate at 37 C for 30 minutes, protecting from light. 13. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (7) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 14. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 10 minutes. NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipete 100µl of the sample diluent (6) in all the cavity wells, except on the blank. Pipette 10 µl of negative controls (8) (3 wells) and positive controls (9) (2 wells) and of the samples in their respective wells. 2. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 60 minutes. 3. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 5 times with wash solution (2). 4. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 5. Pipette 100µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 6. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 30 minutes. 7. Repeat the steps 3 and Pipette 50µl of Chromogen Substrate - Solution A (4) and 50µl of Chromogen Substrate - Solution B (5) in each well of the plate, including the blank (which should contain only these reagents). The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 8. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 30 minutes. 9. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will turn yellow. 10. Mix for 30 seconds. 11. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 10 minutes. CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. To determine the Cut-off value: Cut-off = average OD of Negative Control Warning: If the average OD of the negative control is less than 0.02, use it as If the value is greater than 0.02 consider the measured OD, respecting the validation criteria for the test. Example: Average of Negative Controls = Therefore, CUT-off = = 0.14 TEST VALIDATION: The test is valid if: ŸThe O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and the Stop Solution, must be less than at 450 nm. ŸThe O.D. value of the negative controls must be less than at 450/630 nm or at 450 nm after subracting the blank. ŸThe O.D. value of the positive controls must be equal or greater than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. INTERPRETATION OF THE RESULTS Divide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered: REACTIVE : if the value is equal or greater than 1. NOT REACTIVE : if value is less than 1. INDETERMINAT ( Borderline ) : SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 498 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory, of which 100 were positive and 398 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA anti-h from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 100 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,50 A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A ANALYTICAL SPECIFICITY There was no cross-reaction in sera from infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis B virus, Cytomegalovirus, HIV, and Treponema pallidum. No interference was verified with rheumatoid factor until the 2,000 U/mL concentration. During the tests, no effect "Hook" for high concentrations of antibodies was observed. The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin. PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in replicates.