PRACTICA N 8 Cuantificación de nitrógeno total y determinación del contenido de proteína cruda Introducción:

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1 1 PRACTICA N 8 Cuantificación de nitrógeno total y determinación del contenido de proteína cruda I. Introducción: El nitrógeno es el elemento químico que permite diferenciar las proteínas de otros compuestos, particularmente de grasas y carbohidratos. Sin embargo, la fracción de proteína del sistema biológico no es la única fuente de nitrógeno ya que puede derivarse también de pépticos, aminoácidos libres y compuestos nitrogenados de naturaleza no proteica (generalmente presentes en menor proporción). Por ello al determinar el contenido de nitrógeno en un sistema biológico se califica de nitrógeno total y al utilizar este dato para calcular el porcentaje de proteína del sistema se califica de cruda. La determinación del nitrógeno sigue siendo el método analítico más útil para cuantificar la fracción de proteínas sin interferencias de carbohidratos y lípidos. En el desempeño profesional si lo deseable es conocer el porcentaje de proteína, se determina el contenido de nitrógeno total en la muestra a objeto del estudio, luego se precipita la fracción de proteínas y se cuantifica el nitrógeno no proteico del sobrenadante. La diferencia con el contenido de nitrógeno total permite establecer el contenido de nitrógeno proteico. Para calcular el contenido de proteína cruda en función al contenido de nitrógeno total, se recurre al factor de conversión, definido en función del tipo de alimento. El factor representa el contenido de nitrógeno por 100 g de proteínas en ese sistema. El factor 6,25 es el más comúnmente usado. La proteína cruda es una de las determinaciones que integra la COMPOSICIÓN PROXIMAL o ANÁLISIS PROXIMO de los alimentos. La fracción de proteína cruda de los sistemas alimenticios, es importante desde el punto de vista nutricional, de las propiedades organolépticas de los alimentos. En los alimentos de origen animal, influyen significativamente en 58

2 2 su textura. En la harina de trigo y en el pan constituye el mejor índice de la II. calidad panadera. Para cuantificar el nitrógeno total en los alimentos y en la materia orgánica en general se requiere la conversión completa del nitrógeno en su forma nativa a nitrógeno gaseoso o a una sal inorgánica de amonio (estado totalmente reducido del nitrógeno). La siguiente etapa del análisis es la determinación precisa y exacta de alguna de las conversiones antes señaladas. Se han descrito y desarrollado tres (3) métodos, cada uno de ellos lleva el nombre de su creador: Dumas, Kjeldahl y Ter Meulen. En esta experiencia aplicaremos el método descrito y desarrollado por Kjeldahl. Preparación de la muestra: Consultar en AOAC (1990) el muestreo para el análisis, el almacenamiento, preservación y contenido de humedad para la preparación de muestras especificas (materiales biológicos líquidos pueden ser secadas al aire y alcanzaran su contenido de humedad constante). Resulta más conveniente que análisis de nitrógeno total se realice en muestras equilibradas al aire corregidas subsecuentemente a base seca. Esta muestra se manipula fácilmente, en contraste a las anhidras que son higroscópicas. III. Método de Kjeldahl A. Fundamento: El método de Kjeldahl se basa en la hidrólisis ácida de la materia orgánica de la muestra por calentamiento con ácido sulfúrico concentrado y sulfato de potasio en presencia de un catalizador sulfato de cobre. El nitrógeno se reduce en la sal sulfato de amonio, de la cual se libera con hidróxido de sodio en la forma de amoníaco y se destila. El destilado se valora con una solución patrón de ácido clorhídrico o sulfúrico. 59

3 B. 3 Reactivos: 1. Silicona u otro antiespumante de acción similar. 2. Sulfato de potasio (K 2 SO 4 ) 3. Catalizador adecuado (CuSO 4 ) 4. Ácido sulfúrico concentrado (H 2 SO 4 ) 5. Hidróxido de sodio al 50 % (NaOH) 6. Ácido sulfúrico o ácido clorhídrico al 0,1 N (HCl) 7. Rojo de metilo al 0,1 % en alcohol de 95 % (cuando se recoge el destilado en H 2 SO 4 0,1 N) 8. Hidróxido de sodio 0,1 N (cuando se recoge el destilado en H 2 SO 4 0,1N) 9. Mezcla indicadora rojo de metilo 0,1 % - azul de metileno 0,05 %, en alcohol de 95 %; o rejo de metilo 0,1 % - verde de bromocresol 0,075 %, en alcohol de 95%. 10. Ácido bórico al 4% (H 3 BO 3 ) C. Materiales: 1. Equipo de MacroKjedahl para digestión y destilación. 2. Balones de Kjeldahl. 3. Papel tornasol rosado. 4. Equipo de MicroKjedahl para digestión y destilación. 5. Balones de MicroKjeldahl. 6. Equipo Kjeldahl automatizado D. Procedimiento: 1. Digestión: 1. Pesar 0,7 2,2 g de muestra sobre un trozo de papel de filtro sin cenizas e introducir papel y muestra en el balón de digestión Kjendahl (evitar que quede muestra adherida al cuello del balón). 60

4 2. 4 Añadir de g de sulfato de potasio; 0,5 g de sulfato cúprico anhidro y 25 ml de ácido sulfúrico concentrado. 3. Añadir unas perlitas de vidrio (solo en el caso del MacroKjeldahl y una cantidad adecuada de antiespumante). 1. Colocar el balón en el aparato de digestión y calentar la mezcla de digestión a temperatura baja hasta que cese la formación de espuma. Aumentar progresivamente la temperatura de la hornilla (no permita que escape ácido del balón por exceso de calor; ni calentar por encima del nivel del líquido, cuando se usa mechero, puesto que se pueden producir pérdidas de nitrógeno por volatilización de las sales de amonio) 2. Continuar calentando hasta que la mezcla se haga transparente y / o incolora y luego continué calentando, durante 30 minutos o más. ( Si el volumen de ácido disminuye durante la digestión debe añadirse más para evitar sobrecalentamiento del balón). 2. Destilación: 1. Enfriar el balón y añadir cuidadosamente 250 ml de agua y mezclar bien. PRECAUCIÓN: RECORDAR QUE AL AGREGAR AGUA AL ÁCIDO SULFÚRICO SE DESARROLLA UNA REACCIÓN FUERTEMENTE EXOTÉRMICA, POR LO QUE HAY QUE SER EXTREMADAMENTE CUIDADOSO. 2. Colocar una tira de papel indicador (tornasol rosado) 3. Mantener el balón en posición inclinada y añadir ml de una solución de NaOH al 50 % dejándola correr por las paredes, de manera que se formen dos capas de líquido. 4. Conectar inmediatamente al condensador (cuya hornilla debe estar encendida con antelación) por medio del bulbo de Kjeldahl y luego agitar para mezclar. El papel indicador debe mostrar que el 4 61

5 5 contenido del balón esta alcalino. 5. Una vez que se ha mezclado la solución de álcali, colocar inmediatamente sobre la hornilla ya caliente. 6. Calentar hasta ebullición y destilar unos ml (con lo cual se asegura que ha pasado todo el amoniaco formado) 7. Enjuagar el extremo del tubo de salida del destilado con agua destilada, dentro del erlenmeyer que contiene el destilado. Para recoger el destilado se puede usar uno de los siguientes métodos: - Método 1: El extremo de salida del condensador (antes de comenzar la destilación) debe estar sumergido en 50 ml de solución de ácido sulfúrico 0,1 N, contenida en un erlenmeyer de 500 ml a la cual se le han agregado 5-7 gotas de solución indicadora de rojo de metilo. - Método 2: El extremo de la salida del condensador (antes de comenzar la destilación) debe estar sumergido en 50 ml de solución de ácido bórico contenida en un elenmeyer de 500 ml con 2-3 gotas de la solución indicadora rojo de metilo azul de metileno (o rojo de metilo verde de bromocresol). 3. Titulación: - Método 1 : Titular el exceso de ácido sulfúrico con solución de hidróxido de sodio 0,1 N. - Método 2 : Titular con solución de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico hasta obtener un color gris con la mezcla indicadora rojo de metilo verde bromocresol o un color azul con la mezcla rojo de metilo azul de metileno. NOTA: Si se desean titular alícuotas del destilado, transferir cuantitativamente el destilado a un matraz aforado de ml, 62

6 6 aforar el volumen con agua y titular alícuotas de 50 ml. En este caso, tome en cuenta el factor de dilución al realizarlos cálculos. 4. Cálculos: Reporte los resultados como: a. Porcentaje de nitrógeno total. b. Porcentaje de proteína cruda porcentaje de nitrógeno total x factor de proteína (*) (*) Consulte los factores para los diferentes alimentos. NOTA: En el método 2, el volumen gastado para titular el amoniaco viene dado por el resultado directo de la titulación. En el método 1, ese valor se obtiene por diferencia de volúmenes si las normalidades del ácido y del álcali son iguales; de lo contrario, es necesario trabajar basándose en miliequivalentes. Equipo de MacroKjeldahl: Unidad inferior, digestor integrado por seis hornillas y unidad de extracción de vapores. Unidad superior, destilador

7 Unidad de digestión de MicroKjeldahl Unidad de destilación de MicroKjeldahl Diseñado para determinar micro cantidades de proteína o nitrógeno o en el desempeño de una o dos macro determinaciones por día para lo cual se diluye la muestra y se toman alícuotas de la misma. Acepta un máximo de 4 ml de muestra digerida y da resultados reproducibles tan bajos como 1 mg N / L. Cada destilación toma solo cinco minutos. 64

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