Pruebas básicas de Coagulación. Departamento de Hemostasia y Trombosis. IIHEMA Academia Nacional de Medicina

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1 Pruebas básicas de Coagulación Departamento de Hemostasia y Trombosis. Academia Nacional de Medicina

2 Vía Intrínseca de la coagulación Bioq.. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis Academia Nacional de Medicina

3 PK XII XIIa QAPM XI IX XIa Ca 2+ IXa VIIIa FL Ca 2+ X Xa Va FL Ca 2+ VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION FT VIIa Ca 2+ II IIa XIIIa Fibrinógeno M. Fibrina Fibrina

4 QUÉ PRUEBAS EVALÚAN LA VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION?

5 XII FC XIIa VIA INTRINSECA XI XIa APTT Activador + FL IX Ca 2+ IXa VIIIa FL Ca 2+ X Xa Va FL Ca Ca 2+ II IIa KCT SCT Fibrinógeno Fibrina

6 APTT o KPTT Prueba de elección para la evaluación de la vía intrínseca

7 APTT CUALES SON LOS COMPONENTES Y/O REACTIVOS NECESARIOS PARA REALIZAR LA DETERMINACIÓN?

8 Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada Fosfolípidos de distinto origen y concentración Activador (Kaolín, Ac. Elágico, Sílice) Cloruro de calcio 0,025 M

9 APTT Qué sensibilidad debería poseer el reactivo de elección?

10 APTT Déficit de factores de la vía Presencia de heparina Inhibidores de la vía

11 DE QUÉ VARIABLES VA A DEPENDER LA SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA?

12 APTT Sensibilidad Activador Naturaleza y concentración de FL

13 CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA?

14 APTT o KPTT 100 µl l plasma paciente 100 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC 100 µl cloruro de calcio 0,025M V.N.:.: segundos

15 ES IMPORTANTE RESPETAR EL TIEMPO DE INCUBACIÓN?

16 VIA INTRINSECA VIA EXTRINSECA XIIa QAPM PK XI IX XIa X IXa VIIIa PL Ca 2+ II Xa Va PL Ca 2+ VIIa FT PL Ca 2+ IIa X FASE DE CONTACTO fibrinógeno fibrina XIIIa Fibrina insoluble

17 EN QUÉ SITUACIONES PENSARIAMOS AL OBTENER UN APTT PROLONGADO?

18 APTT prolongado Déficit de factores : VIII, IX, XI, XII, QAPM, PK Pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral Fibrinógeno < 100 mg/dl

19 APTT prolongado Heparina no fraccionada Inhibidores P. Politransfundido VIII, V

20 APTT prolongado Déficit de vitamina K Hepatopatías as CID

21 ANTE UN APTT PROLONGADO, QUÉ PRUEBA DEBEMOS REALIZAR?

22 Corrección con plasma normal ( relación 1:1)

23 APTT prolongado APTT mezcla plasma del paciente con plasma normal (1:1) Corrige No corrige o prolonga Déficit de factores Inhibidor

24 APTT Corregir con plasma normal (1:1) Indice de Rosner APTT (P+N) APTT N APTT P > Valor de corte (0,1) No Corrige Valor de corte Corrige

25 APTT P = 80 seg N = 40 seg P+N 46 seg 55 seg Corrige No Corrige APTT (P+N) APTT N APTT P = 0,10 Valor de corte

26 QUÉ HACER SI TENEMOS UN APTT PROLONGADO, QUE CORRIGE Y FACTORES VIII, IX, XI, XII NORMALES?

27 APTT c/incubación prolongada (10 min. a 37 C) Corrige Posible déficit Precalicreínas

28 CÓMO REALIZAMOS LA DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES DE LA VÍA?

29 Determinación de factores Modificación del APTT Reactivos: - fosfolípidos de distinto origen y concentración - activador - cloruro de calcio 0,025 M - plasma deficiente en factor a estudiar, (diluido?)

30 Determinación de factores Muestra: plasma diluido 1/5, 1/10, 1/20 Curva del factor : -diluciones del estándar: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 Diluyente Fluido II (buffer Owren modificado, ph 7,35)

31 Determinación de factores 50 µl l dilución n paciente 50 µl l dilución n plasma deficiente 50 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC 50 µl cloruro de calcio 0,025M

32 Determinación de factores V.N.:.: 50%-150% Valores : déficit del factor inhibidor

33 Determinación de factores inhibidor específico Tiempo (seg) normal o déficit Factor (U/dl)

34 DEFICIENCIA DE FACTORES DEFICIENCIA Fibrinógeno Factor II Factor V INCIDENCIA HERENCIA 1:1 millón AR 1:2 millones AR 1:1 millón AR Factor VII 1: AR Factor VIII 1: XLR Factor IX 1: XLR Factor XI 1: AR Factor XIII 1:2 millones AR

35 Vía final o común Bioq.. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis Academia Nacional de Medicina

36 VIA INTRINSECA VIA EXTRINSECA XIIa HMK PK XI IX XIa IXa VIIIa PL Ca 2+ VIIa FT PL Ca 2+ X Xa Va PL Ca 2+ X II fibrinógeno IIa fibrina XIIIa Fibrina insoluble

37 QUÉ PRUEBAS PODEMOS UTILIZAR PARA EVALUAR ESTA VÍA?

38 Tiempo de Trombina (TT) Fibrinógeno (I)

39 Tiempo de Trombina (TT)

40 Tiempo de Trombina Mide el tiempo de coagulación del plasma en presencia de trombina. Evalúa la transformación de fibrinógeno a fibrina, pero excluye la participación del factor XIII.

41 Tiempo de Trombina Reactivo: Muestra: - solución de trombina de 10 unidades/ml - plasma citratado

42 CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA?

43 Tiempo de Trombina 100 µl l de plasma 30 segundos 37º C 100 µl l de trombina Se debe informar su valor en relación con el normal del día. d - valores normales entre segundos.

44 EN QUÉ SITUACIONES TENDRÍAMOS UN TT PROLONGADO?

45 T T prolongado Fibrinógeno disminuido (<100mg%) Fibrinógeno anómalo Heparina PDF-DD Paraproteínas Heparinoides

46 T. TROMBINA Corregir con plasma normal (1:1) P= 25seg N= 16seg N/2= 20seg P+N=? P+N < N/2 N/2 Corrige No Corrige

47 Fibrinógeno (I)

48 Determinación de Fibrinógeno Modificación Tiempo de Trombina (método de Clauss) Reactivos: solución de trombina (concentración de 100 ó 75 U/ml)

49 Determinación de Fibrinógeno Muestras : - diluidas 1/10 en buffer veronal Owren ph=7,35 Curva de calibración: - diluciones 1/5, 1/10, 1/20 y 1/40 del estándard.

50 CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA?

51 100 µl l Trombina µl l de dilución de plasma Tiempo de coagulación Tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la concentración de Fibrinógeno

52 Determinación de Fibrinógeno Los resultados se expresan en mg/dl. V.N.:.: mg/dl

53 Resultados : TT alterado,tp normal,aptt normal Corrige mezcla del plasma del paciente c/normal (1:1) No corrige Dosaje de Fibrinógeno Disminuido Alterado T de Reptilasa Normal Hipo o afibrinogenemia Disfibrinogenemia congénita o adquirida Inhibición tipo heparina

54 Qué hacer ante un paciente con antecedentes de sangrado tardío, que presenta APTT, PT y TT normales?

55 Determinar Factor XIII

56 Factor XIII Alterado Normal Determinación de α-2 antiplasmina Déficit congénito o adquirido del FXIII o inhibidor del FXIII Disminuído: déficit congénito o adquirido

57 ESTRUCTURA DEL FACTOR XIII Subunidad A (XIIIA): B A A Tetrámero (A 2 B 2 ) B Cromosoma 6 globular Sitio activo Monocitos, megacariocitos, placenta, hígado Subunidad B (XIIIB) Cromosoma 1 Filamentosa Transportador XIIIA Hígado

58 CUALES SON LAS FUNCIONES DEL FXIII?

59 Estabilizar el coágulo (transamidasa) Produce la unión entre la fibrina y la α2 2 antiplasmina.

60 Funciones del F XIII Entrecruzamiento (uniones covalentes) entre: monómeros meros de fibrina malla de fibrina fibronectina colágeno (matriz para proliferación de fibroblastos) α2- antiplasmina

61 VIA INTRINSECA XIIa HMK PK VIA EXTRINSECA XI IX XIa IXa VIIIa PL Ca 2+ VIIa FT PL Ca 2+ X Xa Va PL Ca 2+ X II IIa fibrinógeno fibrina Fibrina insoluble XIIIa

62 A A B B E FIBRINOGENO 2FpA + 2FpB D D MONOMERO DE FIBRINA D E D trombina E D D D E D F XIIIa DIMERO DE FIBRINA D D E D D E E E D D D D D D E D D POLIMERO DE FIBRINA

63 Manifestaciones clínicas Diátesis hemorrágicas tardías: - caída del cordón umbilical - traumas o cirugías - hemorragias intracraneales (SNC, ¼ pacientes deficitarios) Cicatrización tardía y anómala de heridas Abortos espontáneos y recurrentes

64 Cómo evaluar la deficiencia de FXIII? Prueba de solubilidad Sensibilidad? Ca 2+ o IIa Urea o Ac.Acético plasma

65 Tiempo (min) SOLUBILIDAD Plasmas deficientes (artificiales) IIa/Aa Ca/Aa Ca/Urea 1% NP 5% NP 10% NP Concentración de plasma (%)

66 PRUEBA DE SOLUBILIDAD DEL COAGULO Trombina/Ac.Acético mayor sensibilidad tiempos más cortos EQAS, 2003

67 Prueba de solubilidad en urea 5M 200 µl de PPP 100 µl buffer Owren 200 µl Cl2Ca 30 minutos a 37º C 3 ml de urea 5 M Valor normal: insoluble > 24 horas

68 Solubilidad en Trombina-Acético 200µl l fisiológica 200 µl l plasma 100 µl l trombina (30UI/ml) 30min 37 3ml Ac.. Acético al 2%

69 Laboratorio (Cuantificación) Inmunoelectroforesis específica (Laurell)) para subunidades A y B. Elisa para subunidades A y B.

70 Sistema Fibrinolítico Bioq.. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis Academia Nacional de Medicina

71 Sistema Fibrinolítico PAI Plasminógeno PAI t-pa u-pa/u-par Plasmina α2 - Antiplasmina Fibrina PDF

72 Sistema Fibrinolítico Test Globales Lisis de Euglobulinas Lisis en Sangre Entera Inhibidores PAI α 2 -PI PDF/f. Sustrato y activador Plasminógeno t-pa Marcadores de Fibrinolisis D-Dímero

73 Evaluación Fibrinolítica Dosaje de plasminógeno Método funcional cromogénico Electroinmunoensayo Dosaje de α2-antiplasmina Lisis de Euglobulinas Método funcional cromogénico Electroinmunoensayo

74 Evaluación Fibrinolítica Lisis de Euglobulinas Pre y post isquemia por oclusión venosa TPA Método funcional PAI cromogénico Dímero D Aglutinación PDF en látex

75 Puntos a tener en cuenta: Reposo previo : Ayuno previo: - 20 minutos (el estrés y ejercicio la liberación endotelial de tpa) - Cafeína: la actividad fibrinolítica. - Carbohidratos ricos en calorías: la actividad del PAI-1

76 Puntos a tener en cuenta: Evitar : - Alcohol: la actividad fibrinolítica por la liberación del PAI-1 - Tabaco: el antígeno del tpa

77 PAI Biológico (UI/ml) Hora RITMO CIRCADIANO Normales tpa Biológico (UI/ml) 1 0,8 0,6 0,4 0, tpa inmunológico (ng/ml) Hora Hora AE Wallnöfer et al, 1993

78 Lisis del coágulo Evalúa globalmente la actividad fibrinolítica Afectada por los niveles de Plg/Plm Plm, fibrinógeno, activadores e inhibidores de la fibrinolisis (α2-pi)(

79 Lisis del coágulo Sangre recién extraída en tubo de vidrio limpio y seco. Baño a 37ºC ºC,, tomar la hora cuando coagula. Tomar el tiempo de lisis completa del coágulo

80 Lisis de Euglobulinas Precipitación de fracción proteica ( Euglobulinas ) en medio ácido Fibrinógeno Activadores del Plg Plasmina Plasminógeno PAI Sobrenadante: - Inhibidores de la Plasmina (α2-pi)(

81 Lisis de euglobulinas 250 µl PPP* 4 ml agua destilada 70µl ácido acético (1%) 30 min. en heladera 4-8ºC Centrifugar a 1000 rpm, 5 min (*) PPP obtenido de sangre anticoagulada (9:1) con citrato ácido de sodio.

82 Lisis de euglobulinas Descartar el sobrenadante 250µl de borato de sodio 250µl de CaCl2 0,025M

83 FIBRINOLISIS Respuesta a la isquemia Muestra basal (pre) Muestra luego de 10 min. de compresión (post) Esfingomanómetro: presión media entre la mínima y la máxima (del paciente)

84 Respuesta a la isquemia Tanto la muestra basal como la post oclusión se deben recoger en tubos con citrato ácido y mantener refrigeradas Índice post/pre: < 0,70 buena respuesta 0,70-0,75 pobre respuesta > 0,75 mala respuesta

85

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