TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO

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1 CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO. IMPORTANCIA CLÍNICA. CURSO Nº 2

2 I.S.S.N Título: Taller del Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: Diciembre 2007

3 BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO IMPORTANCIA CLÍNICA Ana Carrillo Redondo. Residente Análisis Clínicos. H. U. La Princesa. Alicia García Blanco. Facultativo especialista de área. Servicio de Microbiología. H. U. La Princesa. 1. Introducción La resistencia a antibióticos es un problema de relevancia mundial, y más concretamente a los antibióticos betalactámicos tan ampliamente utilizados. Existen numerosos mecanismos de resistencia a este tipo de antibióticos a través de modificaciones de las proteínas fijadoras de penicilina, la inactivación enzimática del antibiótico por producción de betalactamasas, la alteración de la permeabilidad por reducción de las porinas de la pared bacteriana o la eliminación del antimicrobiano una vez que ha penetrado en las bacterias gracias a bombas de expulsión presentes en sus envolturas (eflujo activo). Además, las bacterias pueden crear tolerancia, que es una forma particular de resistencia en la que la concentración bactericida mínima (CBM) es unas 32 veces la concentración inhibitoria mínima (CIM), de manera que frente a estos microorganismos tolerantes el betalactámico se comporta como un antibiótico bacteriostático en lugar de bactericida (1,2). De los distintos mecanismos, las betalactamasas son la principal causa de resistencia a estos antibióticos (3). Estas enzimas hidrolizan el enlace amida del anillo betalactámico (figura 1), de manera que pueden inactivar penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos, carbapenemas o distintas combinaciones de estos antibióticos. Pueden ser cromosómicas o plasmídicas y sintetizarse de forma permanente (E. coli, 17

4 Shigella, Proteus mirabilis) o sólo en presencia de un agente inductor (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella y Providencia rettgeri). H 2 O Figura 1. Acción de betalactamasas. La existencia de estas enzimas limita de forma importante el uso empírico de antibióticos betalactámicos en los hospitales. Además, la fácil transferencia de unos organismos a otros, la aparición de nuevos tipos de betalactamasas, su prevalencia cada vez mayor, así como la aparición de cepas multirresistentes a distintos antibióticos, resultan especialmente problemáticas en la práctica clínica. 2. Clasificación de betalactamasas Las betalactamasas se clasifican principalmente atendiendo a dos esquemas (tabla 1): la clasificación molecular de Ambler (4) y la clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros (5). La clasificación de Ambler divide las betalactamasas en cuatro clases (A-D). Se basa en la homología de las proteínas. Las clases A, C y D son serina-betalactamasas y la clase B son metalo-betalactamasas. La clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros también consta de cuatro grupos y diversos subgrupos. Se basa en las características funcionales, teniendo en cuenta distintos criterios como las propiedades bioquímicas (peso molecular, secuenciación de nucleótidos), las propiedades físicas (punto isoeléctrico), el espectro de hidrólisis, el espectro de 18

5 inhibición, la codificación (plasmídica o cromosómica), etc. Esta clasificación es mucho más importante en el diagnóstico microbiológico de laboratorio ya que considera los substratos y los inhibidores de las betalactamasas clínicamente relevantes. Grupo (B-J-M) Características Clase Molecular (Ambler) Inh AC Inh EDTA Enzimas representativas 1 Cefalosporinasas C - - AmpC; MIR-1 2a Penicilasas A + - PCI (S aureus) 2b Enzimas de A + - TEM1,2;SHV1 amplio espectro 2be Enz de espectro A + - TEM3-28; SHV2-6 extendido (BLEE) 2br Enz de amplio A ± - TEM30-36; TRC-1 espectro resistente a inh 2c Carbenicilinasas A + - PSE-1; CARB3 2d Cloxacilinasas D ± - OXA1-11; PSE-2 2e Cefalosporinasas A + - P vulgaris 2f Carbapenemasas A + - IMI1, NMCA,Sme1 3 Melalo B - + L1 (S maltophilia) betalactamasas 4 Penicilinasas ND -? B cepacia Tabla 1. Clasificación de betalactamasas. Inh: inhibidores; AC: ácido clavulánico. 3. Betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) La producción bacteriana de betalactamasas existe desde antes del uso generalizado de la penicilina. Aunque inicialmente esta actividad enzimática era más importante en cepas de Staphylococcus aureus se empezó a desarrollar como principal mecanismo de resistencia a antibióticos betalactámicos en bacterias gramnegativas (BGN). Sin embargo, su existencia no llama la atención hasta el descubrimiento de la resistencia a ampicilina mediada por plásmidos en E. coli. Más tarde, aparecen resistencias a cefalosporinas de segunda generación por la 19

6 hiperproducción de la betalactamasa cromosómica AmpC. La siguiente explosión de betalactamasas sucede con la aparición de resistencias a cefalosporinas de tercera generación a principios de los años 80 que se denominaron betalactamasas de espectro extendido (BLEEs). Éstas derivan de betalactamasas ya existentes que han sufrido mutaciones aleatorias por presión selectiva al introducir las cefalosporinas de tercera generación. Inicialmente estaban restringidas a E. coli y Klebsiella spp., organismos que contenían las tres betalactamasas progenitoras de las BLEEs (TEM-1, TEM-2 y SHV-1) (6). Tras la introducción de la cefotaxima en Europa apareció la primera BLEE documentada en una cepa de Klebsiella ozonaea en Alemania en 1983 (7). Se denominó SHV-2 ya que sólo difería de su progenitora SHV-1 en un único aminoácido. Un año después, se describió en Francia una nueva BLEE que se denominó TEM-3. En los siguientes cinco años, se describieron nuevas BLEEs resistentes a cefotaxima en Klebsiella spp., E. coli y Citrobacter freundii. La introducción de la ceftazidima, hizo que rápidamente aparecieran nuevas BLEEs que conferían resistencia a ella. Desde entonces, ha habido una rápida evolución de este tipo de enzimas por todo el mundo, incluso se han descrito BLEEs que confieren resistencia a cefaminicas y carbapenemas (6,8,9). Las BLEEs pertenecen al grupo 2be y a la clase molecular A (tabla 1). Deben su nombre a que confieren resistencia a un amplio espectro de antibióticos betalactámicos como las amino-, carboxi- y ureidopenicilinas (ampicilina, ticarcilina y piperacilina respectivamente), cefalosporinas de tercera y cuarta generación (excepto cefamicinas) y monobactámicos (aztreonam) pero no carbapenemas (imipenem, 20

7 meropenem). Esta acción hidrolítica es inhibida por ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam (inhibidores de betalactamasas). Las BLEEs se encuentran codificadas en plásmidos lo que permite su amplia y fácil diseminación no sólo entre cepas de la misma especie sino también entre cepas de distintas especies. Su aparición es especialmente importante por el amplio patrón de resistencia que provocan y son las responsables de infecciones nosocomiales graves pero también de infecciones de menor gravedad aunque más frecuentes como las infecciones urinarias (ITU). El perfil de multirresistencia asociado a otros antibióticos no betalactámicos ocasiona un problema terapéutico de notables dimensiones (10). 4. Tipos de BLEEs 4.1 SHV Son las betalactamasas más frecuentes en aislamientos clínicos (11). Su nombre hace referencia a sulfhydryl variable. La primera betalactamasa descrita, SHV-2, sólo difería en el cambio de una glicina por una serina en la posición 238 de su progenitora SHV-1. Desde su descubrimiento hace algo más de 15 años, se han encontrado organismos con BLEEs tipo SHV en todos los continentes, sugiriendo que el incremento de la utilización de cefalosporinas de tercera generación ha sido el factor responsable de su expansión (8, 12). Se ha descrito este tipo de BLEEs en un amplio rango de Enterobacteriaceae y en brotes de Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. 4.2 TEM Derivan de las betalactamasas clásicas TEM-1 y TEM-2 que se aislaron por primera vez en una paciente griega llamada Temoneira. Retrospectivamente, la 21

8 primera BLEE aislada se describió en Liverpool en 1982 en un aislamiento de Klebsiella oxytoca y que portaba un plásmido de resistencia a ceftazidima, hoy se conoce como TEM-12 (13). Desde entonces, más de 100 TEM han sido descritas, la mayoría BLEEs. Algunas de estas BLEEs son conocidas con más de un nombre (14). Las características de estas enzimas se pueden consultar en la dirección CTX-M y Betalactamasas Toho Su nombre refleja la potente actividad hidrolítica de este tipo de enzimas frente a cefotaxima. Además muchas de las betalactamasas tipo CTX-M hidrolizan también ceftazidima y cefepimas aunque con menor eficacia. La actividad frente a aztreonam es variable. La capacidad inhibitoria de tazobactam es casi diez veces mayor que la del ácido clavulánico. Derivan de betalactamasas cromosómicas de distintas especies del género Kluyvera. Debemos tener en cuenta que un mismo organismo puede contener betalactamasas tipo CTX-M y SHV o CTX-M y AmpC simultáneamente, lo que altera su patrón de resistencia antibiótica. Toho-1 y Toho-2, también conocidas como CTX-44 y CTX-45 respectivamente (14), son betalactamasas estructuralmente relacionadas con las del tipo CTX-M. Su actividad hidrolítica también es más eficaz frente a cefotaxima que a ceftazidima. 4.4 OXA Las betalactamasas tipo OXA deben su nombre a su capacidad de hidrolizar la oxacilina. Pertenecen al grupo 2d de la clasificación de Bush (tabla 1). Predominan en Pseudomonas aeruginosa pero también se han detectado en otras BGN. No todas las betalactamasas de este tipo son BLEEs (OXA-10-11, 14-20, -28, 31-32, ). 22

9 La evolución de las BLEEs tipo OXA a partir de sus predecesoras de espectro más reducido tiene muchas semejanzas con la evolución de las BLEEs tipo SHV y TEM. 4.5 PER Las BLEEs tipo PER comparten entre un 25 y un 27% de homología con las BLEEs del tipo TEM y SHV. Fueron originariamente descritas en Turquía en Pseudomonas aeruginosa y más tarde en Salmonella enterica, Acinetobacter, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Alcaligenes faecalis y Vibrio cholerae. 4.6 VEB-1, BES-1 y otras BLEEs Se están describiendo continuamente nuevas betalactamasas por toda la diversidad geográfica. VEB-1 tiene homología con PER-1 y PER-2, confiere resistencia a ceftazidima, cefotaxima y aztreonam, y es inhibida por ácido clavulánico. Esta acción está mediada por un plásmido que además confiere resistencia a otros antibióticos no betalactámicos. Fue originariamente descrita en un paciente vietnamita hospitalizado en Francia (8). GES, BES, TLA, SFO y IBC son otros ejemplos de BLEEs no TEM no SHV que se han ido descubriendo a lo largo de los cinco continentes en los últimos años (8). 5. Epidemiología de organismos productores de BLEEs. La aparición de los primeros organismos productores de BLEEs fue en Europa, en Alemania y en Inglaterra, aunque fue en Francia donde se produjo el primer brote epidémico. Desde entonces se han publicado brotes epidémicos de organismos con este tipo de enzimas, por los cinco continentes desde América hasta Asia pasando por África y Australia (8). En España se describió la primera BLEE en 1988 y la primera epidemia documentada ocurrió entre 1988 y 1990 (15. 16). 23

10 La especie más frecuente involucrada en estos brotes epidémicos es Klebsiella pneumoniae (17) en más del 75% de los casos (8), sobre todo en unidades de cuidados intensivos (UCI), aunque con menor carácter epidémico aparece cada vez más frecuentemente E. coli (18) principalmente fuera del ámbito hospitalario en infecciones del tracto urinario adquiridas en la comunidad. En las primeras décadas tras el descubrimiento de las BLEEs, la mayoría pertenecían a los tipos TEM o SHV. Sin embargo, actualmente las más frecuentes en la mayoría de países, son las de tipo CTX-M (15,19,20). El resto de tipos de BLEEs presentan menor importancia desde el punto de vista epidemiológico, al menos por el momento. Los factores de riesgo para la infección por organismos con BLEE son similares a aquellos para las enfermedades nosocomiales: períodos de hospitalización prolongados, permanencia en UCI, ser sometido a procedimientos quirúrgicos o invasivos, así como la administración inicial de antibióticos (10). Otro aspecto epidemiológico importante es la progresiva asociación de BLEEs con otros mecanismos de resistencia, como las betalactamasas cromosómicas tipo AmpC. Este es el caso del aislamiento de la cepa Enterobacter aerogenes productora de TEM-24 que ha sido la causa de brotes epidémicos en distintos hospitales de países europeos (15). También se asocian con resistencia a antibióticos no betalactámicos como aminoglicósidos, cotrimoxazol o fluoroquinolonas, que les confieren a estos organismos características especiales de multirresistencia a tratamientos combinados. 24

11 6. Detección de BLEEs en el laboratorio. La detección de organismos productores de BLEEs en los laboratorios de microbiología es de vital importancia para poder optar rápidamente a un tratamiento antibiótico adecuado y evitar la rápida diseminación de estos organismos sobre todo en pacientes más susceptibles. Los métodos más utilizados en los laboratorios de microbiología están basados en la observación fenotípica de la susceptibilidad de estos organismos a cefalosporinas y la pérdida de resistencia en presencia de inhibidores de betalactamasas (15). Se utilizan métodos de aproximación de discos como la sinergia de doble disco o la combinación de discos (figura 2a y 2b respectivamente). Las limitaciones de estos métodos dependen de la disposición de los discos y de la interpretación de la sinergia. En algunas cepas con problemas de permeabilidad o con resistencia simultánea a los inhibidores puede verse restringida la detección de BLEEs. También pueden producirse falsos positivos en cepas hiperproductoras de SHV-1 o que presenten betalactamasas cromosómicas sensibles a los inhibidores. Además existen sistemas comerciales que añaden inhibidores de betalactamasas, fundamentalmente ácido clavulánico, a las cefalosporinas de amplio espectro (cefotaxima, ceftazidima y cefepima). Cabe destacar las tiras E-test (figura 2c) que contienen en una parte de ellas concentraciones decrecientes de cefalosporina y en la otra parte las mismas concentraciones del antibiótico con una concentración fija de ácido clavulánico. Para confirmar la presencia de BLEE debe existir una reducción de al menos tres diluciones en presencia del inhibidor [consultar las recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards (21) para cada antibiótico y microorganismo específico]. 25

12 Es frecuente observar en el laboratorio cepas productoras de BLEEs con CMI para las cefalosporinas dentro del rango de sensibilidad. En este sentido, es importante resaltar que la detección de BLEE en estas cepas obliga a cambiar la interpretación de sensible a resistente frente a las cefalosporinas. CAZ AMX/CLA CTX CTX CTX/CLA a b c Figura 2. Métodos de detección de BLEEs. a) Sinergia de doble disco. b) Combinación de discos. c) E-test. CAZ: ceftazidima. AMX: amoxicilina; CLA: ácido clavulánico; CTX: cefotaxima. En todos los casos es recomendable utilizar simultáneamente los discos o las tiras de ceftazidima y cefotaxima en asociación con ácido clavulánico ya que no todas las enzimas hidrolizan por igual los dos substratos. Éste sería el caso de los microorganismos productores de una BLEE tipo CTX-M en los que la utilización de ceftazidima impediría su correcta detección, al contrario de lo que ocurre si las BLEEs son del tipo TEM o SHV. Es importante tener en cuenta que un mismo organismo puede presentar betalactamasas tipo BLEE y tipo AmpC simultáneamente. El ácido clavulánico induce la actividad AmpC y puede esconder la inhibición sobre la BLEE. En estos casos, es preciso añadir cefepima con clavulánico ya que esta cefalosporina queda poco 26

13 afectada por AmpC, incluso cuando está hiperproducida, y sí que puede observarse la sinergia con el ácido clavulánico. Además, la detección de las betalactamasas tipo AmpC se puede manifestar por la inhibición selectiva que muestran en presencia de ácido borónico (22). 7. Alternativas terapeúticas en infecciones por organismos productores de BLEEs. La detección de BLEEs en distintos microorganismos implica resistencia a los siguientes antibióticos betalactámicos: las penicilinas (ureido-, carboxi- y aminopenicilinas), las cefalosporinas (excepto las cefamicinas) y las monobactamas. Por tanto, los únicos betalactámicos que se pueden utilizar frente a estos microorganismos son las cefamicinas como la cefoxitina, las combinaciones de betalactámicos con inhibidores (ácido clavulánico, tazobactam o sulbactam) o las carbapenemas (15). Algunos de estos tratamientos presentan limitaciones, por ejemplo el uso de cefamicinas puede desarrollar resistencia por pérdida de expresión de las porinas necesarias para la entrada del antibiótico. La combinación amoxicilina-clavulánico es una buena opción cuando no existe resistencia por producción simultánea de otras betalactamasas, alteraciones de permeabilidad o, en menor medida, la hiperproducción de la propia BLEE. La presencia de BLEEs en especies productoras de la betalactamasa cromosómica AmpC (Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, etc) añade complejidad al tratamiento ya que estos microorganismos son intrínsicamente resistentes a cefoxitina y a amoxicilina-clavulánico, con lo cual la única opción entre 27

14 los betalactámicos para el tratamiento de estas cepas sería las carbapenemas o la piperacilina-tazobactam. La aparición de AmpC plasmídica demostrada por primera vez en los años 90 (23) complica aún más el problema, ya que puede aparecer en especies que carecen de AmpC cromosómica como K. pneumoniae y P. mirabilis. La detección de organismos productores de AmpC es importante para asegurar un tratamiento antibiótico rápido y efectivo al paciente. En cuanto al uso de antibióticos no betalactámicos, hay que tener en cuenta la resistencia a otros antimicrobianos como los aminoglucósidos y cotrimoxazol a través de elementos genéticos (plásmidos, transposones o integrones), que en muchas ocasiones, la resistencia se transfiere conjuntamente con el gen responsable de la BLEE. Además, es importante mencionar el aumento de la frecuencia de resistencia a las fluoroquinolonas, especialmente en E. coli. Se observa una asociación significativa entre la producción de BLEE y la resistencia a estos antibióticos, debida probablemente a la presión selectiva por el frecuente uso de betalactámicos y fluoroquinolonas en el mismo contexto terapéutico. La expresión de un patrón de multirresistencia asociado a la producción de BLEEs es cada vez más frecuente, lo que limita enormemente las opciones terapéuticas. No obstante, para el tratamiento de ITUs no complicadas producidas por E. coli con BLEE, es posible recurrir al uso de antibióticos casi ya olvidados, como son la fosfomicina y la nitrofurantoína (15). 8. Conclusiones Nos enfrentamos a un creciente problema de resistencia antibiótica, tanto en el ámbito hospitalario como a nivel comunitario, con claras implicaciones terapéuticas y de morbimortalidad. La rápida detección en el laboratorio de microorganismos 28

15 productores de BLEEs es esencial para poder ofrecer un tratamiento adecuado al paciente. La incesante aparición de nuevas BLEEs como mecanismos de resistencia a betalactámicos pone una vez más de manifiesto la importancia del correcto uso de los antibióticos. 9. Bibliografía 1. Mensa y col. Guía de Terapeútica Antimicrobiana. 16ª edición. Masson. Elsevier. 2. García-Rodríguez JA, Picazo JJ. Compendio de Microbiología Médica Harcourt. 3. Livermore DM and Brown DFJ. Detection of β-lactamase-mediated resistance. J Antimicrob Chemother. 2001; 48: Ambler RP. The structure of β-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol). 1980; 289: Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother. 1995;39(6): Larson LL and Ramphal R. Extended-Spectrum β-lactamases. Semin Respir Infect. 2002; 17(3): Knothe H, Shah P, Krcmery V, Antal M and Mitsuhashi S. Transferable resistance to cefotaxima, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection. 1983; 11: Paterson DL and Bonomo RA. Extended-Spectrum β-lactamases: A Clinical Update. Clin Microbiol Rev. 2005; 18(4):

16 9. Bradford PA. Extended-Spectrum β-lactamases in the 21 st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Important Resistance Threat. Clin Microbiol Rev. 2001; 14(4): Pujol M and Peña C. El significado clínico de las betalactamasas de espectro extendido. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2003; 21(2): Jacoby GA. Extended-spectrum beta-lactamases and other enzymes providing resistance to oxymino-beta-lactams. Infect Des Clin N Am. 1997; 11: Sturenburg E, Mack D. Extended-spectrum β-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect. 2003; 47: Du Bois SK, Marriott MS and Amyer SG. TEM- and SHV- derived extendedspectrum betalactamasas: relationship between selection, structure and function. J Antimicrob Chemother. 1995, 35: Jacoby GA. β-lactamase Nomenclature. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50(4): Oliver A y Cantón R. Enterobacterias productoras de β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido Control Calidad SEIMC. Revisiones en bacteriología. 16. Cantón R, Oliver A, Coque TM, Varela MC, Perez-Diaz JC, Baquero F. Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacter isolates in a Spanish hospital during a 12-year period. J Clin Microbiol. 2002; 40: Coque TM, Oliver A, Pérez-Díaz JC, Baquero F, Cantón R. Genes encoding TEM-4, SHV-2, and CTX-M-10 extended-spectrum β-lactamases are carried by multiple Klebsiella pneumoniae clones in a single hospital (Madrid, 1989 to 2000). Antimicrob Agents Chemother. 2002; 46: Hernández JR, Pascual A, Canton R, Martinez-Martinez L. Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria GEIH. Escherichia coli y Klebsiella pnumoniae productores de β-lactamases de espectro extendido en hospitales españoles (Proyecto GEIH-BLEE 2000). Enferm Infecc Microbiol Clin. 2003; 21: Sabaté M, Tarragó R, Navarro F, Miro E, Verges C, Barbe J et al. Cloning and sequence of the gene encoding a novel cefotaxime-hydrolyzing β-lactamase (CTX-M- 9) from Escherichia coli in Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44:

17 20. Oliver A, Pérez-Díaz JC, Coque TM, Baquero F, Cantón R. Nucleotide sequence and characterization of a novel cefotaxime-hydrolyzing β-lactamase (CTX- M-10) isolated in Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: National Comittee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 13 th informational supplement. M10000-S12. Wayne PA Coudron PE. Inhibitor-Based Methods for Detection of Plasmid-Mediated AmpC ß-Lactamases in Klebsiella spp., Escherichia coli, and Proteus mirabilis. J Clin Microbiol. 2005, 43(8): Papanicolaou GA, Medeiros AA and Jacoby GA. Novel plasmid-mediated betalactamase (MIR-1) conferring resistance to oxyimino- and alpha-mothoxy beta-lactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 1990, 34(11):

18 CON LA COLABORACIÓN DE: