VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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1 CAPÍTULO I.1.4. VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS INTRODUCCIÓN El diagnóstico de enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa e indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los métodos directos se detectan las partículas de los agentes infecciosos y/o sus componentes, tales como los ácidos nucleicos, proteínas estructurales y no estructurales, enzimas, etc. Los métodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos por las infecciones. Los métodos más comunes de detección directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, el enzimoinmunoensayo (ELISA), la hibridación de ácidos nucleicos (NAH) y la amplificación de ácidos nucleicos, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También se denominan métodos de diagnóstico molecular, puesto que los ensayos de NAH y PCR tienen como objetivo las moléculas de ácidos nucleicos. Los métodos indirectos más comunes de detección del agente infeccioso son las pruebas serológicas tales como: la neutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante ELISA y las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación. En general, los laboratorios de diagnóstico aplican simultáneamente los dos métodos para garantizar un diagnóstico seguro. Hasta la fecha, los principios de validación de la OIE se han desarrollado para los métodos de detección indirecta, esto es, para la prueba ELISA de anticuerpos. El objetivo de este capítulo es ampliar las normas a un método directo de detección de un agente infeccioso, es decir, adaptar los principios de validación a los ensayos de PCR. Las experiencias de la última década indican que las técnicas de PCR finalmente sustituirán a muchos de los métodos directos clásicos de detección de agentes infecciosos. Está claro que la PCR está reemplazando el aislamiento de virus o cultivo de bacterias para la detección de agentes que son difíciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los virus que se replican; ii) los cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar el diagnóstico; y iv) una pericia especial, que se está perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en día, son herramientas relativamente baratas, seguras y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico (2, 7). Generalmente, la sensibilidad y especificidad de la PCR es mayor que los procedimientos ELISA de aislamiento y captura. 32 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

2 A. MÉTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNÓSTICOS MOLECULARES RUTINARIOS 1. Principios de la técnica de PCR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reacción de amplificación basada en enzimas. El término reacción en cadena se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo específico de ADN o de ácidos nucleicos diana (nucleótidos), en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La región que hay que amplificar está definida por dos (o más) secuencias de nucleótidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucleótidos cortos que son complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana uniendo los nucleótidos libres a los cebadores. Repitiendo el régimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene es suficiente para operaciones posteriores, tales como detección, clonación y secuenciación. La sensibilidad de diagnóstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reacción puede ser también muy alta, ya que está determinada por las secuencias específicas de nucleótidos de la diana seleccionada, así como por el diseño del cebador. Los cebadores pueden diseñarse para detectar secuencias específicas de nucleótidos en los genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden diseñarse para ser complementarios de las secuencias muy comunes que se dan en la naturaleza. Estos cebadores no específicos, llamados cebadores universales, son capaces de aglutinar una gama más amplia de ADN y pueden utilizarse para detectar miembros dentro de una familia o género del agente infeccioso. a) Amplificación del ADN Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificación se realiza directamente, con o sin purificación previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extraído y purificado del material que se va a utilizar en la prueba, dará como resultado un aumento en la sensibilidad analítica y diagnóstica. b) Amplificación del ARN (PCR de trascripción inversa) Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen ácido ribonucleico (RNA) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificación por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y éste no está disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adición de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la trascriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripción inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reacción de trascripción inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere después a un tubo nuevo para la reacción de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con actividad trascriptasa inversa y tampones específicos en los cuales las polimerasas RT y ADN están activas. Ambas permiten una reacción RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin manipulación adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayoría de los casos será necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripción inversa. Sin embargo, en algunos casos, es suficiente con hervir la muestra antes de la RT-PCR (p. ej. muestras de materias fecales en PBS). c) Detección del amplímero por PCR El producto PCR o amplímero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El más común incluye la detección no específica del producto de la PCR, basada en una medida amplímera utilizando electroforesis en gel de agarosa y tiñendo el ADN con un tinte no específico, como el bromuro de etilo, o el reconocimiento específico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot seguido de hibridación con sondas de oligonucleótidos complementarias de la secuencia diana. Las sondas de hibridación pueden ser, enzima, marcado como quimiluminiscente o radionucleótido para permitir la detección de la secuencia diana específica. Más abajo se dan algunos ejemplos de métodos de PCR utilizados actualmente. 2. PCR convencional En la PCR convencional (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucleótidos para amplificar una parte pequeña del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analítica es relativamente alta con un número mínimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analítica también es bastante alta. La sensibilidad y especificidad analíticas se pueden mejorar mediante la aplicación de la PCR anidada (véase más adelante el punto 3). La especificidad se puede mejorar posteriormente utilizando el método Manual de la OIE sobre animales terrestres

3 Southern blot de transferencia a papel y comprobando los productos de la PCR con una sonda marcada, pero esto lleva mucho tiempo y no es una práctica común hoy día en los laboratorios de diagnóstico. 3. PCR anidada En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificación con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y especificidad analíticas superiores si se comparan con las pruebas de PCR convencionales. La sensibilidad analítica es típicamente <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la especificidad analítica también aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucleótidos tienen que unirse específicamente a las dianas seleccionadas para producir una reacción positiva (2). 4. PCR en tiempo real La PCR en tiempo real es una amplificación en la que los productos de la PCR son detectados directamente durante los ciclos de amplificación utilizando sondas marcadas con fluorescencia. Diversos métodos en tiempo real, tales como los ensayos que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan o Molecular Beacon, se han convertido en herramientas muy populares para la detección de agentes infecciosos. La PCR en tiempo real se ha utilizado para la detección de bacterias, virus o parásitos de una amplia variedad de especies animales (2, 6, 8). Estos nuevos ensayos tienen varias ventajas comparados con los métodos clásicos de la PCR convencional o anidada. Sólo se utiliza un par de cebadores, presentando, a menudo, una sensibilidad próxima o igual a la PCR anidada tradicional, pero con un riesgo mucho más bajo de contaminación. La fluorescencia, que indica la presencia del producto amplificado, se mide a través de la tapa o del lado del tubo de reacción, de forma que no es necesario el manejo posterior de los productos de la PCR. Estos procedimientos llevan considerablemente menos tiempo si se compara con la detección tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa, seguidos de la tinción con bromuro de etidio, con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminación. El empleo de la modalidad de placa de microtitulación de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite que el procedimiento sea automático y apropiado para pruebas a gran escala (5). El diagnóstico se puede automatizar posteriormente utilizando robots para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparación con los métodos clásicos, una ventaja adicional de la técnica de la PCR en tiempo real es que es posible realizar ensayos cuantitativos (6). 5. PCR múltiple Se denominan pruebas de PCR múltiple a las reacciones de PCR que utilizan cebadores múltiples dirigidos a diferentes dianas en un único ensayo. En la PCR múltiple se pueden detectar y diferenciar de forma simultánea varios agentes infecciosos en un único tubo de reacción individual. Los diferentes PCR diana amplificados en una prueba estándar de PCR se identifican basándose en el tamaño del producto de la PCR. El empleo de los métodos de la PCR anidada clásica para la construcción de un ensayo múltiple resulta complicado debido a la necesidad de dianas de diferentes tamaños, así como de cebadores que puedan competir entre sí en la misma mezcla reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el concepto de la PCR en tiempo real (pares de cebadores únicos) proporciona excelentes posibilidades para la construcción de sistemas múltiples muy sensibles (2, 4) basados en un tamaño más uniforme de la diana, en unas condiciones de amplificación uniformes y en la detección por separado de las dianas utilizando sondas de hibridación específicas marcadas con fluoróforos diferentes. B. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Cuando se realizan análisis diagnósticos de material clínico es importante producir datos de buena calidad. Para esto, hay que cumplir algunos criterios clave. Es necesario establecer los sistemas de garantía de calidad (GC) y de control de calidad (CC), esto es, un juego de protocolos de calidad, incluyendo el empleo de muestras control, que aseguren que el sistema está funcionando adecuadamente y confirme la calidad de los datos. En muchos laboratorios de todo el mundo ya se han establecido los sistemas GC y CC y hay personal entrenado y competente. La validación de ensayos es otro factor fundamental para garantizar que los resultados de las pruebas reflejan el estado real de las muestras (3). Para predecir la eficacia de un ensayo diagnóstico, es necesario utilizar una metodología de validación con el fin de documentar los resultados analíticos que se esperan del ensayo en cuestión. La validación es la evaluación de un ensayo diagnóstico con el fin de determinar su idoneidad para una utilización concreta. Los principios generales de validación de ensayos se pueden encontrar en el Capítulo I.1.3. Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas. El presente capítulo extiende estos principios de validación a los ensayos de diagnóstico molecular. Consúltese el Capítulo I.1.3. para la explicación de los términos y las definiciones. 34 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

4 C. MEDIDAS DE LA VALIDEZ Las características operativas (o parámetros del ensayo) proporcionan información sobre la eficacia de un método bajo condiciones específicas. En el Capítulo I.1.3. se presentan algunas características operativas, y en este capítulo se ofrecen algunas otras que son importantes para los métodos de la PCR. D. ETAPAS DE LA VALIDACIÓN DE ENSAYOS En el Capítulo I.1.3. se describen con detalle las cinco etapas de la validación de ensayos. En el presente capítulo, se exponen brevemente estas etapas, con especial énfasis en los ensayos de diagnóstico molecular. 1ª ETAPA. ESTUDIOS DE VIABILIDAD El estudio de viabilidad constituye la etapa preliminar en la validación de un nuevo ensayo. El objetivo es determinar si en un ensayo se puede detectar o no un rango de concentraciones testigo sin actividad de fondo. Se eligen, al menos, diez muestras (por ejemplo, agentes infecciosos producidos en el laboratorio en cultivo celular o bacteriano), que comprendan desde niveles bajos hasta niveles altos del agente infeccioso. También hay que incluir, al menos, diez muestras que no contengan el testigo. Normalmente, es difícil separar esta etapa de la segunda, ya que es necesaria una optimización preliminar antes de que se puedan realizar estudios posteriores. Los ensayos que parecen prometedores se someten a un desarrollo posterior en la 2ª etapa. Obsérvese que, a veces, se puede mejorar considerablemente un ensayo mediante esquemas de optimización adecuados, y de esta forma la exclusión de ensayos no óptimos se hará con cautela. La selección de la diana y el diseño del cebador son críticas, y debería tenerse en cuenta la naturaleza del agente infeccioso, su estructura genómica y la diversidad de secuencias genéticas que existen entre diferentes cepas o aislados, y la utilización que se pretende dar a la prueba (por ejemplo prueba de control, tipificación de cepas, etc.). El resultado obtenido por la PCR puede verse influido por el funcionamiento del equipo del laboratorio y en particular por el termociclador, que, por tanto, se debería supervisar de forma continua como parte del programa QA. Es crucial la calibración de la temperatura correcta y, para los instrumentos de la PCR en tiempo real, deben calibrarse de forma regular los sistemas ópticos, de acuerdo con los protocolos QA de laboratorio. Los ensayos desarrollados y validados mediante la utilización de equipo clave, como la extracción robótica o un termociclador fabricado por un fabricante específico, deben ser revalidados o tener datos de equivalencia generados antes de su utilización en plataformas de equipamiento alternativas. 2ª ETAPA. DESARROLLO Y ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO 1. Selección de las concentraciones óptimas de los reactivos, los parámetros de los protocolos y el equipo La toma, preparación y transporte de muestras (véase Capítulo I.1.1.) y los métodos de extracción de ácidos nucleicos (véase Capítulo I.1.8.) son todos parámetros esenciales en la realización de un ensayo y deberían optimizarse para el diagnóstico de enfermedades. Incluso los métodos adecuados varían dependiendo del tipo de muestra y organismo. En general, el suero sanguíneo, el tejido del cuerpo y las muestras de frotis son muestras adecuadas para la extracción fácil de ácidos nucleicos objeto de estudio, mientras que las muestras de heces y semen son más difíciles de manejar. La extracción del ARN difiere de la del ADN, y el ARN es más proclive a la degradación. Tanto los métodos comerciales (robóticos, columnas de giro, extracciones por procedimientos magnéticos, etc.) como los métodos químicos estándar se utilizan para la extracción del ADN o del ARN. Es fundamental establecer el método más reproducible y eficaz de extracción antes de llevar a cabo una validación posterior del ensayo. Si se cambia el método de extracción, deben generarse unos datos de equivalencia o se debe repetir el procedimiento completo de validación. Todo el equipo utilizado en el proceso debe mantenerse correctamente. Los aparatos que requieren calibración (bloques de calentamiento, refrigeradores, congeladores, termocicladores, pipetas, etc.) deben calibrarse según los protocolos de calidad del laboratorio. Cuando se realicen los ensayos clásicos de PCR o en tiempo real, es necesario optimizar todos los parámetros, los protocolos y los reactivos. Un ensayo estandarizado es un método que produce constantemente el mismo resultado para una muestra dada cuando se repite varias veces y cuando se lleva a cabo por diferentes analistas en diferentes laboratorios. Manual de la OIE sobre animales terrestres

5 2. Repetitividad estimaciones preliminares En esta etapa debe conseguirse una concordancia entre las réplicas en la realización del ensayo y entre las distintas realizaciones del mismo. Esto proporciona información importante sobre el ensayo antes de que se lleve a cabo una validación posterior. Si se encuentra una excesiva variabilidad, habrá que corregirla antes de continuar con el proceso de validación. 3. Determinación de los parámetros esenciales de control Durante la optimización del ensayo de la PCR, también se puede estimar la capacidad del método de no verse afectado por pequeños cambios en los parámetros principales. Es preciso documentar las variaciones intencionadas durante la realización del ensayo a fin de caracterizar los parámetros esenciales del mismo. Los ejemplos de tales parámetros son: tiempos de incubación y temperaturas, concentración de tampones, cebadores, MgCl 2, etc., ph, cantidades de otros componentes añadidos (por ejemplo dntp, suero bovino, albúmina, etc.). La caracterización de dichos parámetros de control es crucial para la identificación de los puntos esenciales que deben controlarse correctamente en el ensayo. 4. Sensibilidad y especificidad analíticas La sensibilidad analítica (o límite de detección) se define como la cantidad más pequeña de agente detectado por el ensayo, y puede representarse como el número de copias del genoma, de dosis infecciosas, de unidades que integran la colonia, de unidades que forman la placa, etc. del agente que puede detectarse y distinguirse a partir de un resultado cero. Para determinar la sensibilidad analítica se utiliza una dilución de punto final hasta que el ensayo ya no pueda detectar el blanco en estudio en más del 5% de las réplicas (2 desviaciones estándar). Los fragmentos clonados de los productos de la PCR en estudio se pueden usar como muestras estándar, bien como ADN o para dianas de ARN, siendo éste trascrito in vitro a ADN. La especificidad analítica se define como la capacidad de un ensayo para distinguir el agente objeto de estudio de otros agentes infecciosos. La capacidad se determina analizando los patógenos genéticamente relacionados entre sí y el material clínico obtenido de los animales portadores de enfermedades que pueden imitar a (o confundirse con) aquellas para las que se ha diseñado la prueba. 5. Rango Las técnicas analíticas deben optimizarse en la fase lineal de la curva de respuesta. El rango de un ensayo se define como el intervalo existente entre la concentración máxima y mínima de un agente infeccioso en una muestra en la que el agente puede detectarse de forma fiable. 3ª ETAPA. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DEL ENSAYO 1. Sensibilidad y especificidad diagnósticas La sensibilidad diagnóstica (proporción de animales de referencia que se sabe que están infectados, que dan respuesta positiva en el ensayo) y la especificidad (proporción de animales de referencia que se sabe que no están infectados, que dan respuesta negativa en el ensayo) son los parámetros más importantes obtenidos durante la validación de un ensayo. Constituyen la base para el cálculo de otros parámetros y son, por lo tanto, cruciales para el conjunto del proceso de validación. Se puede calcular el número de muestras de referencia que se requiere para determinar las estimaciones y el error admisible de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. Para hacer esto, debe utilizarse una predicción razonable de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. Normalmente, la confianza de la estimación se establece en el 95%. Sin embargo, ninguna fórmula puede tener en cuenta los numerosos factores del hospedador/organismo que pueden afectar al resultado de la prueba. En el Capítulo I.1.3. se explica, a grandes rasgos, el número de muestras requeridas para determinar las estimaciones de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. En la práctica esto es difícil de conseguir con los métodos moleculares especialmente en lo referente a muestras positivas en el caso de una enfermedad que no es endémica o no está extendida. Generalmente, el ensayo se pone en práctica en la fase final, quizás en paralelo con la Norma de oro de que se ensaye un número suficiente de animales. A medida que se avanza en la utilización de la prueba, los datos adicionales recogidos ayudarán a reducir el error de las estimaciones. El estado de los animales que se sabe que están infectados y el de los que no lo están, debería establecerse mediante comparaciones con otros ensayos. No es adecuado el empleo de muestras adicionadas en la PCR, ya que éstas podrían no ser representativas de muestras infectadas de forma natural, y de esta forma podría ponerse potencialmente en riesgo todo el proceso de validación. 36 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

6 2. Repetitividad y reproducibilidad La repetitividad y reproducibilidad son dos parámetros importantes de la precisión de un ensayo. La repetitividad se mide como el grado de concordancia entre réplicas ensayadas en diferentes realizaciones. La reproducibilidad se determina utilizando un ensayo idéntico (protocolo, reactivos y controles) en diferentes laboratorios. Hoy en día, tal como se indica en el Capítulo I.1.3, es poco frecuente realizar en su totalidad la 3ª etapa recomendada por la OIE en los laboratorios de diagnóstico veterinarios llevando a cabo ensayos de la PCR. Tradicionalmente, muchos laboratorios han utilizado pruebas de elaboración propia, probablemente por razones prácticas. Los métodos estandarizados y validados deben seguirse allí donde se hayan publicado. Tienen que llevarse a cabo los procesos de validación entre laboratorios, incluso si son costosos y requieren una labor intensa. Este trabajo propiciará la realización de los ensayos estandarizados, permitiendo la actividad diagnóstica armonizada en diferentes países. 4ª ETAPA. SEGUIMIENTO DE LA VALIDEZ DE LA OPERATIVIDAD DEL ENSAYO La estimación de la prevalencia de un virus en la población es necesaria para calcular el valor predictivo de los resultados positivos (VP+) o negativos (VP ) de la prueba. Esto se aplica por igual a los métodos de ensayos moleculares y a otros métodos tales como el enzimoinmunoensayo (ELISA). Se insta a los Laboratorios de Referencia a determinar los valores de la sensibilidad y especificidad diagnósticas de la forma más precisa posible, ya que éstas son muy importantes para valorar la eficacia real de un ensayo cuando se usa en el campo. También es importante estimar los valores predictivos (VP+ o VP ) en las circunstancias locales. Durante la validación inicial y el empleo de un ensayo nuevo, se recomienda la investigación de los resultados negativos y positivos falsos. Por ejemplo, las reacciones positivas falsas basadas en ensayos moleculares pueden ser evaluadas por análisis de secuencia del ADN amplificado, para ayudar en la corrección de errores debidos a la fijación de dianas o cebadores no específicos, a la falta de rigor del ensayo, etc. 5ª ETAPA. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN Cuando el ensayo se utiliza como una prueba rutinaria, es importante mantener el CC interno. El ensayo tiene que ser supervisado continuamente con relación a la repetitividad y exactitud. La OIE recomienda que la reproducibilidad entre laboratorios (pruebas del anillo) se compruebe, al menos, dos veces al año (9). Si el ensayo se va a aplicar en otra región geográfica y/o población, podría ser necesario hacer una revalidación o documentar la equivalencia bajo las nuevas condiciones. La revalidación también puede ser necesaria si la prueba se aplica a una matriz de muestra distinta, por ejemplo, validación en sangre y utilización en otros tejidos o validación para tejidos de cabezas de ganado y utilización en otras especies. Esto es especialmente cierto para los ensayos de la PCR ya que es muy común que las mutaciones puntuales ocurran en muchos agentes infecciosos (esto es, virus de ARN). Las mutaciones, que se pueden dar dentro de los emplazamientos del cebador o la sonda pueden afectar a la eficacia de un ensayo y, de ser así, los criterios de actuación establecidos ya no son válidos. También es recomendable confirmar de forma regular la secuencia diana de las regiones genómicas seleccionadas para los aislados nacionales o regionales de los agentes infecciosos. Esto es especialmente cierto para los emplazamientos de los cebadores si se quiere garantizar que los mismos permanezcan estables con el fin de que no se cuestione la validez de la prueba. Puede ser necesaria la repetición de la validación y la solidez cuando la prueba se transfiere de un laboratorio de desarrollo al campo, dado que las condiciones pueden ser menos óptimas y el personal estar menos preparado. 1. Precauciones y controles Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnóstico rutinario, se deberían tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la técnica de PCR para la detección de agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos o negativos falsos. Estos, junto con controles internos (miméticos) garantizan la evaluación segura de los resultados. a) Precauciones para evitar resultados positivos falsos Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una reacción positiva), pueden surgir de bien de temas relacionados con el laboratorio, tales como contaminación cruzada, o factores relacionados con la prueba, por ejemplo una realización del ensayo o de la optimización ineficaces. Los restos de productos de las muestras positivas o, más comúnmente, de la contaminación cruzada por los productos de Manual de la OIE sobre animales terrestres

7 la PCR provenientes de experimentos anteriores constituyen una posible fuente de error, y se han aplicado varias técnicas y herramientas para evitar los resultados falso positivos de la PCR. Las muestras y los reactivos se deben manejar en campanas de aire de flujo laminar, que regularmente se descontaminan regularmente utilizando luz UV y lejía. La construcción y utilización de soportes de tubos y abridores especiales ayuda a evitar resultados positivos falsos de la PCR. Además, se deberían aplicar prácticas de laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas básicas (extracción del ADN, preparación y mezcla del cebador, preparación de la muestra, electroforesis por gel agarosa de la ampliación de productos, etc.). en áreas o habitaciones del laboratorio separadas (1,2). Se deben utilizar diferentes juegos de pipetas en cada una de las etapas. Se recomienda el empleo de un desplazamiento positivo y de filtros. También se recomienda que diferentes personas lleven a cabo las distintas etapas, que están restringidas a las respectivas áreas del laboratorio. Se deben tomar precauciones para evitar la introducción de material amplificado de laboratorios potencialmente contaminados dentro de las áreas limpias del laboratorio mediante las restricciones en los movimientos de las muestras, documentos, equipo, personas o cualquier otra forma de contaminación potencial. El movimiento en la dirección contraria debería ocurrir sólo después de la descontaminación, la ducha y el cambio de ropa. Además, es preferible diluir las muestras con una cantidad desconocida pero que se supone grande, de agente o ácido nucleico diana antes de la introducción del material en las áreas limpias del laboratorio. También es muy importante incluir controles negativos, por ejemplo, muestras que sean tan parecidas a las muestras de prueba como sea posible, pero sin la diana. A los laboratorios que han tenido problemas con la contaminación cruzada, se les recomienda al menos un control negativo por cada cinco muestras de diagnóstico. Ambas muestras control positivas y negativas se deberían intercalar de forma rutinaria con muestras de diagnóstico a fin de evaluar la realización de la prueba de PCR. b) Controles de los procesos (miméticos) para evitar resultados negativos falsos Los resultados negativos falsos (muestras que contienen el agente objetivo pero probadas como negativas) se deben en su mayor parte a los efectos inhibidores y/o a los errores de pipeteo. Por tanto, los controles internos se utilizan como indicadores de la eficacia de la prueba de PCR. Los controles internos de la PCR pueden incluir ADN extraño añadido a la muestra o ADN que se da en la muestra de forma natural. El ADN extraño añadido a la muestra puede incluir miméticos de ADN o de ARN. Los miméticos de ADN, oligonucleótidos manufacturados, tienen las mismas secuencias de unión a los cebadores que las de la PCR diana, pero flanquean un fragmento de ADN heterólogo de un tamaño diferente. Las secuencias de nucleótidos idénticas de unión al cebador permiten la amplificación simultánea del molde y del mimético en el mismo tubo con una competición mínima. Las diferencias de tamaño proporcionan una discriminación fácil por medio del análisis de Southern blot. El ARN blindado, un concepto idéntico a los miméticos de ADN, utiliza un fragmento de ARN control envuelto en proteínas protectoras de bacteriófago para proteger o estabilizar el ARN para los ensayos de control o la estandarización de las pruebas RT-PCR. En los ensayos de la PCR en tiempo real, también es posible emplear controles internos, un gen vigilante que se da forma natural, un fragmento seleccionado del genoma del animal hospedador como el actina beta, GAPDH o el ARN ribosómico. Mediante la inclusión de dicho control intrínseco, con un fluoróforo indicador específicamente coloreado, es posible comprobar la calidad de la muestra y confirmar la eficacia de la PCR cuando se detectan simultáneamente el agente en estudio y los ADN intrínsecos (8). Los controles internos aumentan la fiabilidad del diagnóstico de PCR (1,2) Se debe tener precaución al diseñar y validar los controles internos. Es necesario realizar muchas pruebas para garantizar que la amplificación por PCR del control interno añadido no compite con la PCR de diagnóstico y por tanto disminuye la sensibilidad analítica. Los controles internos se emplean en concentraciones ligeramente por debajo del límite de detección de la PCR de diagnóstico para garantizar la realización de la prueba. También debería tenerse en cuenta que los controles internos tienen una desventaja similar a las pruebas descartadas y no son representativos del ácido nucleico diana y pueden proporcionar resultados negativos falsos. 2. Preparación de estándares Los laboratorios de referencia deben proporcionar muestras estándares representativas de un agente infeccioso dado. Dichas muestras pueden ser agentes infecciosos cultivados, especimenes clínicos, etc., que se distribuyen de manera que el agente infeccioso se conserve bien. De esta forma, las muestras se distribuyen congeladas en disolventes orgánicos (por ejemplo, trizol) o de otras formas adecuadas. Las muestras también se pueden enviar como ácidos nucleicos (congelados, secados por congelación o en etanol). Para los detalles específicos, véanse los capítulos individuales sobre enfermedades. Los laboratorios de referencia deberían proporcionar los miméticos apropiados. 38 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

8 REFERENCIAS 1. BALLAGI-PORDANY A. & BELAK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, BELAK S. & THOREN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases. Expert Rev. Mol. Diagn., 1, BURKHARDT H.J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38, ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J., & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, JUNGKIND D. (2001). Automation of laboratory testing for infectious diseases using the polymerase chain reaction our past, our present, our future. J. Clin. Virol., 20, HEID C.A., STEVENS J., LIVAK K.J. & WILLIAMS P.M. (1996). Real-time quantitative PCR. Genome Res., 6, LOUIE M., LOUIE L. & SIMOR A.E. (2000). The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. CMAJ., 163, MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30, OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, * * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados en la medicina veterinaria (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: Manual de la OIE sobre animales terrestres