ENFERMEDADES DE LOS MOLUSCOS INFORMACIÓN GENERAL

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1 SECCIÓN 2.2. ENFERMEDADES DE LOS MOLUSCOS CAPÍTULO I.2. INFORMACIÓN GENERAL 1. ENFERMEDADES DE MOLUSCOS EN EL MANUAL DE ANIMALES ACUÁTICOS DE LA OIE En las últimas décadas, la producción mundial de moluscos se ha visto afectada por varias enfermedades y, dado su grave impacto sobre el desarrollo económico y socioeconómico de muchos países, algunas de estas enfermedades han llegado a constituir una restricción primaria para el desarrollo y mantenimiento de la acuicultura de moluscos. La transmisión de agentes de enfermedades mediante transferencias de moluscos vivos ha sido una causa importante de brotes de enfermedad y epizootias. Para la lista de enfermedades de moluscos de la OIE, consultar la edición actual del Código de animales acuáticos. Para todas estas enfermedades, los Laboratorios de Referencia de la OIE pueden suministrar asistencia técnica sobre la aplicación práctica de los estándares que se incluyen en el Código de animales acuáticos y en el Manual de animales acuáticos. 2. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO Los moluscos producidos se pueden muestrear para al menos tres fines. Estos son: 1) vigilancia; 2) brote o sospecha de enfermedad; y 3) diagnóstico confirmativo. El número y tipo de muestras a tomar para análisis varía mucho dependiendo de cual sea el propósito Recogida de ejemplares En el capítulo de este Manual de animales acuáticos se presenta una estrategia general sobre vigilancia y muestreo. El muestreo debe diseñarse para hacer posible la detección de los animales infectados, a un nivel de confianza del 95%. La siguiente sección presenta información relevante para muestrear moluscos. Para las pruebas de diagnóstico cuya especificidad y sensibilidad se ha establecido, el tamaño de la muestra puede determinarse usando métodos como el FreeCalc ( o programas similares, según se indica en el capítulo en Requisitos de vigilancia para el reconocimiento internacional de ausencia de infección. Sin embargo, para las pruebas de diagnóstico cuya especificidad y sensibilidad no se ha establecido, el tamaño de la muestra debería determinarse según el cuadro 1 del presente capítulo. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

2 Cuadro 1. Tamaño de muestra aleatoria según la prevalencia supuesta del patógeno en el lote y suponiendo una técnica con el 100% de especificidad y sensibilidad Tamaño del lote Tamaño de la muestra, a 2% prevalencia Tamaño de la muestra, a 5% prevalencia Tamaño de la muestra, a 10% prevalencia o más Según Ossiander y Wedemeyer, Recomendaciones específicas para el muestreo de moluscos El tiempo y la frecuencia del muestreo están determinados por el ciclo de infección del agente de la enfermedad y el período de incubación. Cuando se muestrea para enfermedades estacionales, como por ejemplo la infección por Marteilia refringens o Haplosporidium nelsoni, se debería asignar un período de tiempo adecuado para asegurar una detección óptima. Como los patógenos pueden aumentar la intensidad de la infección asociada a la pérdida de condiciones que el hospedador experimenta después del desove, se recomienda también muestrear después del desove. Los períodos de muestreo deben tener también en cuenta la transferencia de formas juveniles y fijadas a áreas de crecimiento, y la transferencia de los adultos para ulterior engorde o recambio. Además, las muestras deben abarcar un margen de tamaños o centrarse en el grupo de edad más susceptible cuando ésta es conocida. Durante el muestreo, debe seleccionarse cualquier molusco que presente anormalidades (crecimiento anormal, valvas agujereadas, tasas de mortalidad elevadas o altas). Las enfermedades tienen fases subclínicas de desarrollo que escapan a la detección cuando se usan métodos de análisis rutinarios. Sin embargo, la probabilidad de detectar la infección puede aumentar manteniendo los bivalvos en cuarentena por un período largo y sometiéndolos a estrés (hacinamiento, manipulación, cambios de temperatura y salinidad, etc.). Para detectar la infección, las especies de moluscos que son más susceptibles deben examinarse histológicamente. Por ejemplo, miembros de los Arcidae (Arca, Barbatia), Malleidae (Malleus), Isognomonidae (Isognomon), Chamidae (Chama), Tridacnidae (Tridacna) y Veneridae toleran una prevalencia alta de infección por Perkinsus olseni y son buenos indicadores de la presencia de P. olseni. La prevalencia de la infección es un factor importante que influencia la probabilidad de detección. Cuando los moluscos se trasladan del nicho natural a una planta de producción o entre sitios naturales de zonas diferentes, se puede necesitar un gran número de bivalvos para detectar una baja prevalencia de infección. Por ejemplo, en el oeste de Australia, Marteilia sydneyi y Perkinsus sp. ocurren con prevalencia del 0,1% en nichos aislados no tocados por el hombre. Este nivel de muestreo debería ser proporcional al nivel de riesgo de las aguas que reciben y a los recursos acuáticos que representan. En cada zona, debe seleccionarse un número de sitios de muestreo del modo más práctico que aumente las probabilidades de detectar los agentes de la enfermedad. El número de sitios debe aumentar en el caso de zonas amplias que contengan varias áreas discretas de cultivo de la especie susceptible. Deben considerarse parámetros que tengan efecto sobre el desarrollo de los agentes 298 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

3 de la enfermedad, como la densidad de la población, el flujo del agua y el ciclo de desarrollo de los moluscos. Es un requisito importante que las técnicas de análisis empleadas sean los mejores métodos disponibles para la detección del patógeno en cuestión, y que cuando la infección esté presente, pueda ser detectada. Para los métodos de análisis, se tiene que determinar la sensibilidad y la especificidad. Esta información tienen una influencia importante en el tamaño de la muestra (véase la sección 2.1) Envío de muestras Todas las muestras de moluscos deben entregarse al laboratorio de diagnóstico aprobado y deben de llegar vivas. Se debe informar al laboratorio del tiempo aproximado de llegada de las muestras, de modo que se pueda preparar el material requerido para procesar los moluscos antes de la llegada de las muestras. Las muestras de los moluscos deben embalarse de acuerdo son estándares actuales para mantenerlas vivas. Si el lugar de muestreo está lejos del laboratorio, los animales moribundos o los que tienen los tejidos con mal olor son de poca utilidad para un examen posterior. Las muestras deben enviarse tan pronto como sea posible después de su recogida del agua, para reducir el aislamiento del aire y la posible mortalidad durante el transporte, especialmente en el caso de moluscos enfermos moribundos. Cuando las muestras no pueden entregarse vivas en un laboratorio de diagnóstico debido al avanzado estado de la enfermedad, a una gran distancia, a las conexiones lentas del transporte, etc., los ejemplares deben fijarse en el sitio como se recomienda en las siguientes secciones de este capítulo o en los capítulos individuales de este Manual de animales acuáticos. Aunque esto es adecuado, por ejemplo, para ulterior examen por histología o por microscopía electrónica de transmisión, otras técnicas, como los frotis en fresco, las impresiones titulares, la bacteriología rutinaria, la micología o el cultivo líquido con tioglicolato de Ray para Perkinsus spp., no pueden llevarse a cabo. Las necesidades para el diagnóstico y los requisitos de las muestras deben comentarse con el laboratorio de diagnóstico antes de la recogida de las muestras. Las muestras deben de acompañarse con información de apoyo, incluyendo el motivo del envío de la muestra (vigilancia, mortalidad anormal, crecimiento anómalo, etc.), las observaciones de síntomas y los parámetros ambientales relacionados, la prevalencia aproximada y las pautas de mortalidad, el origen y la naturaleza de los moluscos (especie, edad, si las muestras pertenecen o no a poblaciones locales de moluscos o a producciones de otro sitio, fecha de transferencia y fuente de localización, etc.). Esta información debería identificar posibles cambios en el manejo o en las condiciones ambientales que pudieran haber influenciado la mortalidad, en asociación, o no, con la presencia de agentes infecciosos Examen macroscópico La observación macroscópica de los moluscos debería abarcar, en la medida de lo posible, el comportamiento animal, la superficie de la concha, el interior de la concha, y los tejidos blandos. A menudo es difícil observar el comportamiento de los moluscos en aguas abiertas. Sin embargo, la observación de los moluscos en algunas instalaciones, como tanques con reproductores y criaderos, pueden proporcionar indicaciones útiles sobre cambios de comportamiento relacionados con la enfermedad. Si se notan signos (como fijación prematura de las larvas en el fondo, acumulación de alimento en los tanques, síntomas de debilitamiento, etc.), se pueden examinar muestras para lesione macroscópicas, incluyendo la observación en un microscopio de disección para detectar anormalidades y deformidades, o animales de olor nauseabundo, y fijarlos para posterior procesamiento como se recomienda más adelante. Para los adultos y formas juveniles, los síntomas de debilitamiento pueden incluir valvas entreabiertas, acumulación de Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

4 arena, barro y desechos en el manto y las branquias, retracción del manto del borde de la concha, disminución de actividad (natación de la vieira, excavación de la almeja, pastar de la oreja de mar), etc. El reflejo de la oreja de mar de enderezarse después de ser invertida no es posible en animales debilitados, y es un buen indicador de debilidad. Debería observarse la mortalidad en aguas abiertas para detectar tendencias de pérdidas y tomarse muestras para análisis posterior. Deben registrarse factores ambientales previos y posteriores a la mortalidad. Incluso bajo condiciones de cultivo, las conchas de los moluscos pueden no estar limpias y hay microorganismos contaminantes que normalmente colonizan la superficie de las conchas de los moluscos. Organismos como los percebes, lapas, esponjas, gusanos poliquetos, larvas de bivalvos, tunicados, briozoos, etc, no suelen amenazar la salud de los moluscos. Los sistemas de cultivo, como los cultivos en suspensión o en aguas superficiales, pueden incluso aumentar los organismos contaminantes y las conchas pueden resultar cubiertas por otros animales y por plantas. Esto puede influenciar directamente la salud impidiendo la apertura y el cierre de la concha o, indirectamente, a través de la competición para los recursos de alimento. Los síntomas de debilitamiento asociados a una fuerte contaminación deberían ser causa de preocupación más bien que la propia contaminación. Los daños a la concha por organismos perforadores como las esponjas y los gusanos poliquetos son generalmente benignos, pero bajo ciertas condiciones pueden alcanzar proporciones que hacen que la concha se rompa o agujeree hasta los tejidos blandos. Este grado de daño a la concha puede debilitar al molusco y volverlo susceptible a infecciones por patógenos intercurrentes. Deben apreciarse las deformaciones de la concha (tamaño, agujeros superficiales), la fragilidad, la rotura o la reparación, pero normalmente no son indicativas de un problema de enfermedad. El olor y la coloración anormal, sin embargo, pueden indicar una posible infección de los tejidos blandos que puede necesitar examen en el laboratorio. Los moluscos deben abrirse con cuidado para no dañar los tejidos blandos, en particular el manto, las branquias, el corazón y la glándula digestiva. La presencia de organismos contaminantes en la superficie interna de la concha es una indicación clara de debilidad. La superficie interna de la concha es normalmente lisa y limpia debido a la acción el manto y de las branquias. Puede ocurrir una perforación de la superficie interna, pero se puede sellar por la deposición adicional de conchiolina y nácar. Esto puede ocasionar la formación de ampollas llenas de barro o de agua. Las ampollas también pueden formarse por irritantes superficiales como cuerpos extraños. El grado de perforación de la concha puede determinarse manteniendo la concha cerca de una luz fuerte. Cuando las anormalidades presentes en la matriz de la concha merezcan más investigación, se pueden llevar al laboratorio los ejemplares intactos recién recogidos o fijarlos para posterior descalcificación, según se requiera. Con frecuencia, la apariencia de los tejidos blandos es una indicación de la condición fisiológica del animal. Los tejidos blandos deben examinarse para la presencia de lesiones con abscesos, pústulas, decoloración de los tejidos, perlas, edemas, transparencia general o acuosidad, deformaciones branquiales, etc., y, cuando se encuentren junto con animales débiles o moribundos, estas anormalidades deberían ser causa de preocupación. Las anormalidades y las lesiones de los tejidos deben anotarse y documentarse, así como cualquier deformidad de la concha, organismos perforadores de la misma y habitantes sospechosos en el manto. El nivel de daño en los tejidos debe anotarse y tomar muestras de los animales afectados y no afectados para su examen en el laboratorio tan pronto como sea posible Examen de poblaciones donde ocurre una mortalidad anormal Una mortalidad anormal en los moluscos se reconoce normalmente como una mortalidad repentina y notable que ocurre en un corto espacio de tiempo entre dos observaciones o inspecciones de la producción (por ejemplo, en unos 15 días en el caso de instalaciones localizadas en la zona entre mareas). En un criadero, una mortalidad anormal es el fracaso de la producción sucesiva de larvas a partir de diferentes productores. Dado el amplio espectro de especies, ambientes y condiciones de cultivo, estas definiciones deben adaptarse cuando y donde sea necesario. 300 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

5 Siempre que ocurra una mortalidad anormal en las poblaciones de moluscos, se debe llevar a cabo una investigación urgente para determinar la etiología Las muestras tomadas deben ser recogidas, conservadas o fijadas, y mantenidas de acuerdo con los procedimientos descritos en este Manual de animales acuáticos. Cuando sea posible, también deben fijarse moluscos no afectados o control para comparación histológica con los tejidos anormales. Cualquiera que sea el fijador, es esencial eliminar la concha para permitir el fácil ingreso del fijador. Los bivalvos y los gasterópodos operculados pueden mantener la concha cerrada frente el fijador hasta que comienza la autolisis. 3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Las técnicas aplicables a los agentes de enfermedades de los moluscos se limitan a la detección directa del agente causal. Los métodos serológicos clásicos no pueden emplearse a efectos diagnósticos porque los moluscos no producen anticuerpos. Además de la histología y la citología, para la detección de agentes de las enfermedades descritas, pueden usarse inmunoensayos con anticuerpos monoclonales o sondas de ácidos nucleicos. A este respecto, el desarrollo de técnicas de diagnóstico basadas en el ADN para los agentes de enfermedades en los moluscos ha sido seguramente el avance más significativo de los últimos años. Debido al desarrollo y a la amplia aplicación potencial de estas técnicas diagnósticas y a los problemas inherentes asociados en la actualidad a su uso, el tema de su validación adquiere suma importancia. En las siguientes secciones se proponen tres niveles de procedimientos de análisis. La histología se recomienda como método de referencia para el porque proporciona una gran cantidad de información. Es particularmente importante porque el examen macroscópico no suele dar síntomas patognomónicos o información indicativa sólida. Además, la mortalidad puede deberse a varios agentes de enfermedades o a problemas fisiológicos, como la pérdida del buen estado de salud tras el desove, y esto solo puede ser determinado empleando histología. El análisis de vigilancia se realiza rutinariamente por histología. Dependiendo de la situación epidemiológica, y cuando esté justificado, la vigilancia dirigida puede descansar en otras técnicas. Cuando ocurren brotes de mortalidad anormal, también se recomienda la histología. Es particularmente importante porque el examen macroscópico no suele dar síntomas patognomónicos o información indicativa sólida. Además, la mortalidad puede deberse a varios agentes de la enfermedad o a problemas fisiológicos, como la pérdida del buen estado de salud tras el desove, y esto solo puede ser determinado empleando histología. Además de la histología, pueden usarse varios métodos presuntivos, como los frotis de tejidos, el medio de cultivo líquido de Ray con tioglicolato (RFTM) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según se recomienda en los capítulos dedicados a las enfermedades individuales. Tales métodos pueden presentar las ventajas de ser procedimientos rápidos y/o baratos en respuesta a la sospecha de infección por un agente infeccioso determinado. Cuando en un análisis de vigilancia o en brotes de mortalidad se encuentra un agente infeccioso, los métodos moleculares se usan cada vez más para la identificación específica, además de la microscopía electrónica. Algunas de las enfermedades de moluscos consideradas por la OIE están causadas por agentes patógenos que pertenecen a géneros que abarcan especie muy estrechamente relacionadas. En los siguientes capítulos se recomienda emplear protocolos específicos diseñados para detectar ciertos agentes catalogados, que se usan para confirmar resultados de análisis histológicos y/o emitir diagnósticos específicos de especie Técnicas histológicas Debido al uso genérico de la histología en procedimientos de diagnóstico de enfermedades de moluscos, en este capítulo se presenta una indicación técnica detallada. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

6 La histología es una técnica empleada para el estudio de la estructura de las células y los tejidos al microscopio óptico. La preparación de los tejidos implica varios pasos, que incluyen la fijación del tejido, la deshidratación, la impregnación y la inclusión de las muestras, la realización de los cortes finos, la tinción y el montaje de las preparaciones en portas. Los animales moribundos vivos o los animales recién muertos (en minutos) presentan las condiciones óptimas para recoger tejidos. Siempre que sea posible, se debe realizar un corte estándar a través de la glándula digestiva que incluya las branquias, manto y palpos. Alternativamente, para ejemplares mayores, se deben hacer varios cortes para incluir todos los tejidos importantes Fijación del tejido El papel del fijador es mantener la morfología de los tejidos tan similar como sea posible a la morfología in-vivo y evitar la necrosis posterior al muestreo. Los fijadores recomendados para el estudio de moluscos marinos son la solución de Davidson y la de Carson para ejemplares grandes. Para ejemplares menores, se pueden utilizar fijadores con glutaraldehído que son compatibles con los usados en microscopía electrónica. La relación del fijador al volumen del tejido debe ser por lo menos 10:1 para asegurar una buena fijación. Solución de Davidson: Agua marina Alcohol al 95% Formaldehído 1 al 35 40% Glicerol Ácido acético glacial Solución de Carson: NaH 2 PO 4.2H 2 O NaOH Agua destilada Formaldehído 1 al 40% Ajustar el ph a 7,2 7, ml ml 800 ml 400 ml 10% (añadir antes de uso) 23,8 g 5,2 g 900 ml 100 ml No hay un fijador universal y la elección debe hacerse teniendo en cuenta el uso posterior del material fijado así como los aspectos prácticos del uso del fijador (precio, disponibilidad de los componentes, etc.). La solución de Davidson es una excelente elección para conservar la estructura de los tejidos. Además, los cortes finos de tejidos fijados con la solución de Davidson se pueden teñir después por diferentes métodos histoquímicos, así como por técnicas de hibridación in-situ con sondas de ADN. A este fin, debe evitarse la sobre-fijación (más de horas). La solución de Carson puede que no sea tan buena como la de Davidson para análisis histológico. Sin embargo, permite una buena conservación de la ultraestructura y puede usarse para estudiar posteriormente muestras por microscopía electrónica. Como la microscopía electrónica puede ser una valiosa ayuda en el diagnóstico o en la confirmación de infecciones en los moluscos, puede considerarse la conveniencia de la fijación de algunas muestras (especialmente las más pequeñas) con glutaraldehído, como se describe en la sección 6.2 de este capítulo. Por lo demás, el material fijado con solución de Carson que contenga niveles adecuados de agentes infecciosos buscados, o anormalidades, se puede volver a fijar en glutaraldehído. Se recomienda fijar parte del molusco en solución de Davidson y otra parte en la de Carson para ulterior investigación. Esto debe hacerse para asegurar la fijación de todos los tejidos/órganos en los dos fijadores. Si ninguno estuviera disponible, es adecuado emplear 10% de formalina 1 Una solución acuosa saturada al 37 39% con gas formaldehído. 302 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

7 tamponada con agua de mar filtrada. En cada país, la industria de la acuicultura de moluscos debería acordar el modo más eficaz de asegurar una fijación apropiada Deshidratación, impregnación e inclusión de las muestras La inclusión de las muestras en parafina requiere varios pasos durante los cuales el agua que contienen los tejidos se reemplaza progresivamente, primero con alcohol, luego con xileno o una solución menos tóxica de aclarado, y finalmente con parafina. Después de fijar las muestras con solución de Carson o de Davidson, se transfieren a soluciones graduales de alcohol (70 95 [v/v]) antes de la deshidratación final con etanol absoluto. A continuación, el alcohol contenido en los tejidos se elimina por inmersión en xileno. Luego, los tejidos se impregnan en parafina, que es soluble en xileno, a 60 C. Estos pasos se pueden realizar automáticamente usando una máquina. Se producen bloques al dejar enfriar los tejidos en moldes llenos de parafina sobre una mesa de enfriamiento; el enfriamiento y la humedad son esenciales para la realización de los cortes Preparación de los cortes Después de que los bloques se han enfriado en una mesa de enfriamiento, lo que permite que la parafina solidifique, se obtienen cortes histológicos de cerca de 2 3 µm utilizando un microtomo. Los cortes se recogen en portas para histología, se escurren y se secan durante la noche a 60 C. El secado de las muestras a esta temperatura permite eliminar el exceso de humedad y favorece que los cortes se adhieran a los portas Tinción y montaje de las preparaciones Antes de teñir, se elimina la parafina de los cortes sumergiéndolos en xileno o una solución de aclarado menos tóxica durante minutes. Esto se repite una vez y el solvente se elimina por dos inmersiones sucesivas en baños de etanol absoluto durante períodos de 10 minutos en cada caso, y rehidratación por inmersión en un baño de agua de grifo durante 10 minutos. Luego se pueden realizar diferentes técnicas topográficas e histoquímicas de tinción. Cuando se emplea tinción con hematoxilina-eosina (H&E), (hematoxilina o equivalente) las estructuras nucleares y basófilas se tiñen de un color azulado a morado oscuro, el retículo endoplásmico se tiñe de azul y el citoplasma muestra un color gris. El colorante ácido eosina tiñe de rosa otras estructuras. Esta técnica de tinción es simple y reproducible, y aunque solo permite una diferenciación limitada de estructuras celulares, hace posible la detección de anormalidades en los tejidos y en la estructura celular. Se pueden aplicar otras técnicas para demostrar estructuras particulares o las características que se desee (por ejemplo, tricomas en el tejido conectivo y gránulos citoplásmicos) Métodos para microscopía electrónica de transmisión En este capítulo se presentan indicaciones técnicas detalladas, debido al frecuente uso de la microscopía electrónica de transmisión en la identificación confirmativa de agentes infecciosos en procedimientos de diagnóstico de enfermedades de los moluscos. La fijación para microscopía electrónica debe realizarse inmediatamente después de que el animal haya muerto, antes que la fijación para histología. Solo las muestras tomadas rápidamente de animales vivos resultan utilizables. La preparación de muestras para microscopía electrónica implica los siguientes pasos: fijación del tejido, descalcificación de las muestras (cuando sea necesaria), deshidratación, impregnación e inclusión de las muestras, y preparación y tinción de contraste de los cortes. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

8 Fijación del tejido Para tejidos que se van a examinar por microscopía, es importante realizar correctamente la fijación a fin de causar el menor daño posible a la ultraestructura. Las muestras se cortan para que sus dimensiones no excedan los 1 2 mm. Este pequeño tamaño facilita que las diversas soluciones penetren rápidamente en la muestra. La fijación de las muestras se lleva a cabo directamente con 3% de gliceraldehído durante 1 hora. La fijación más extensa conduce a artefactos en las membranas. Las muestras se lavan tres veces con tampón, luego se fijan con 1% de ácido ósmico y se lavan de nuevo dos veces con tampón. Existen varias recetas de fijadores con glutaraldehído y de tampones que funcionan igualmente bien. Para dañar lo menos posible la ultraestructura, las muestras se tratan con soluciones que tienen una osmomolaridad semejante a la de los tejidos. Los tejidos de los moluscos se tratan con soluciones que presentan una osmomolaridad de alrededor de 1000 mosm. La osmomolaridad de las soluciones se ajusta con NaCl. Como los tejidos de los moluscos son casi isoosmóticos con el agua de mar, es posible preparar el glutaraldehído con agua pasada por filtros de 0,22 µm, y usar el agua de mar filtrada para lavados posteriores. Cacodilato sódico Cloruro sódico 0,4 M: 8,6 g en 100 de agua destilada 10% en agua destilada Tampón cacodilato, ph 7,4: 1000 mosm Cacodilato sódico 50 ml de la solución base 0,4 M NaCl 20 ml de la solución base al 10% Agua destilada 30 ml Ajustar el ph a 7,4 Glutaraldehído al 3% : 1000 mosm 25% glutaraldehído 2,5 ml 0.4 M cacodilato sódico 5 ml 10% NaCl 3,5 ml Agua destilada 9 ml Ácido ósmico al 1%: 1000 mosm 4% ácido ósmico 1 volumen 0,4 M cacodilato sódico 1 volumen NaCl 1 volumen de la solución base al 10% Agua destilada 1 volumen 5% EDTA: EDTA Disódico Tampón cacodilato 5 g 100 ml El EDTA se disuelve a un ph por encima de 8. Cuando la solución se clarifica, se ajusta el ph a 7,4 añadiendo HCl concentrado. Si las muestras se han fijado previamente y se han mantenido con solución de Carson, deben lavarse varias veces en un baño de tampón antes de la fijación con 3% de glutaraldehído. 304 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

9 Deshidratación, impregnación e inclusión de las muestras Las muestras se deshidratan por baños sucesivos en etanol: etanol al 70% una vez, etanol al 95% dos veces, y etanol absoluto tres veces. La deshidratación se completa con dos baños en óxido de propileno, que permite la subsiguiente impregnación con Epon o con otra resina. Las muestras se impregnan progresivamente. Tras un primer baño en una mezcla de óxido de propileno Epon (50/50), las mezclas se colocan en un baño de Epon. Cuanto más dure la incubación, mejor es la impregnación de los tejidos. La inclusión se realiza colocando las muestras en moldes rellenos de resina Epon. Se incluye en cada bloque una etiqueta de identificación de la muestra y los bloque se colocan a 60ºC (la temperatura a la que polimeriza la resina Epon) durante 48 horas Preparación de los cortes y la tinción de contraste Los bloques se cortan al tamaño adecuado con una hojilla de afeitar y después se realizan los cortes utilizando un ultramicrotomo. Se obtienen cortes finos (0,5 1 µm) que se colocan en portas de vidrio. Éstos se usan para controlar la calidad de las muestras mediante microscopía óptica y para encontrar en los cortes las áreas de interés. Los cortes finos se tiñen a C con una solución de azul de toluidina al 1%. Después de secar, los portas se montan bajo cubres con una gota de resina sintética y se observan en un microscopio óptico. Los cortes ultrafinos de nm de grosor se llevan a rejillas de malla de cobre para análisis por microscopía electrónica. Para tinción de contraste de los cortes ultrafinos, se usa acetato de uranilo y citrato de plomo Métodos moleculares Normalmente las técnicas moleculares ofrecen ventajas de sensibilidad que con frecuencia son contrarrestadas por problemas técnicos. La PCR es particularmente dependiente de las condiciones bajo las que se desarrolla, dando resultados positivos y negativos falsos. Cuando se emplean técnicas moleculares, deben ser desarrolladas con cuidado y poniendo atención muy especial a la inclusión de adecuados controles positivos y negativos para superar la posible falta de seguridad y mantener una adecuada exactitud. Las técnicas de PCR, PCR-RFLP (polimorfismo de fragmentos de restricción), secuenciación, hibridación in-situ e inmunohistoquímica se usan cada vez más para identificación confirmativa de agentes infecciosos. Para aplicar estas técnicas, las muestras deben prepararse conservando el ADN del patógeno. De modo similar, las muestras para pruebas con métodos basados en el uso de anticuerpos deben conservarse de tal modo que mantengan los sitios antigénicos reactivos para los anticuerpos empleados Preparación de muestras Las muestras seleccionadas para pruebas de diagnóstico basadas en ADN o en anticuerpos deberían manejarse y embalarse con el mayor cuidado para reducir la potencial contaminación entre las muestras o la degradación antes de realizar la prueba. Para evitar la contaminación deben usarse envases nuevos (bolsas de plástico para muestras o botellas). Dentro de cada envase o contenedor se debe colocar una etiqueta resistente al agua, con los datos apropiados, para cada conjunto de muestras. Algunos métodos adecuados para la conservación y transporte de muestras para pruebas moleculares o inmunológicas son: Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

10 Ejemplares vivos refrigerados o con hielo: en el caso de ejemplares que pueden transportarse rápidamente al laboratorio para análisis en 24 horas, las muestras se conservan en bolsas rodeadas de una cantidad adecuada de hielo seco en cajas con aislante y se envían al laboratorio. Ejemplares enteros congelados: se seleccionan ejemplares vivos de acuerdo con el propósito del muestreo, y se congelan rápidamente en el campo usando hielo seco granizado o bien se congelan en un laboratorio de campo mediante un congelador mecánico a 20 C o a temperatura más baja. Se prepara e inserta la etiqueta en el contenedor con las muestras, se empaquetan en una caja con aislante conteniendo una cantidad adecuada de hielo seco y se envían al laboratorio. Muestras conservadas en alcohol: en regiones donde es problemática la conservación y el envío de muestras congeladas, se puede emplear etanol al 90 95% para conservar, mantener y transportar algunos tipos de muestras. Moluscos completos (cuando el ejemplar es pequeño) o tejidos cortados en el caso de moluscos mayores. Se empacan para envío según los métodos anteriormente descritos. Tejidos fijados para hibridación in-situ e inmunohistoquímica: a estos efectos son adecuados los métodos clásicos de conservación. Normalmente, la solución de Davidson es una buena elección para el uso posterior de sondas moleculares. Para ADN, debe evitarse específicamente la sobre-fijación (más de horas) Extracción del ADN Para extraer el ADN, los tejidos conservados se trituran hasta pulverizarlos. Se añaden alrededor de 10 volúmenes de tampón de extracción (NaCl [100 mm], ácido etilendiaminotetracético [EDTA, 25 mm], ph 8, dodecil sulfato sódico [SDS, 0,5%]) junto con proteinasa K (100 µg/ml). Después de incubar toda la noche a 50 C, se extrae el ADN mediante el protocolo estándar del fenol/cloroformo, y se precipita con etanol. Considerando las limitaciones de tiempo y los riesgos para el personal de laboratorio, los equipos o kits disponibles comercialmente pueden suponer una alternativa técnica satisfactoria. El uso de estos kits comerciales debe validarse mediante comparación con el protocolo estándar del fenol/cloroformo antes de su uso rutinario en los laboratorios de diagnóstico Preparación de portas para hibridación in-situ Para hibridación in-situ, los moluscos se fijan con el fijador de Davidson durante aproximadamente 24 horas y luego se incluyen en parafina según los métodos descritos anteriormente para histología. Se preparan cortes de 5 µm de espesor y se colocan en portas recubiertos de aminoalquilsilano, que luego se incuban toda la noche a 40 C. Los cortes se desparafinan por inmersión en xileno durante 10 minutos. Este paso se repite una vez y luego el solvente se elimina por inmersión en dos baños sucesivos de etanol absoluto durante 10 minutos en cada caso. Luego, los cortes se rehidratan sumergiéndolos en una serie gradual de etanol. El protocolo puede requerir un paso de permeabilización de las membranas que permita el acceso al ADN diana. Para esto, los cortes se tratan con proteinasa K (100 µg/ml) en tampón TE (Tris [50 mm], EDTA [10 mm]), a 37 C durante 30 minutos. 306 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

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