Proceso para transformación de células de plantas con Agrobacterium tumefaciens

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1 Proceso para transformación de células de plantas con Agrobacterium tumefaciens Transformar Agrobacterium con plásmidos (vectores) conteniendo los genes vir y el T-DNA con los genes deseados. Cocultivar Agrobacterium con células de las plantas. Eliminar Agrobacterium con antibióticos (Timentina). Seleccionar plantas transgénicas mediante antibióticos (kanamycina o geneticina para el gene de selección nptii). Regeneración de células transgénicas de plantas.

2 Modificación del plásmido (vector) Remover los genes que se encuentran entre los bordes derecho e izquierdo del T-DNA. Inserción de los genes deseados. Inserción de los genes para selección de células transformadas. Presencia de un plásmido adicional en el Agrobacterium que contiene los genes vir (vector binario).

3 Vectores binarios En vez de poseer el plásmido natural Ti, la mayoría de las cepas de Agrobacterium que se encuentran en los laboratorios para transformación usan un sistema binario que consiste en dos plásmidos (vectores). Los gene virulentos (vir) y el T-DNA están ubicados en diferentes plásmidos.

4 Construcción de un vector binario Un plásmido contiene los genes vir y el otro contiene el T-DNA. Los oncogenes son removidos del T-DNA y en se insertan en su lugar cassettes de expressión que consisten en gen(es) con su respectivo promotor y terminador. Un vector binario contiene los bordes del T-DNA, sitio de clonación múltiple (MCS), regiones de replicación para Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, cassette del gene selectivo, gen reportero y otros elementos accesorios.

5 Sitio de clonación múltiple/ multiple cloning site (MCS) Multiple cloning site (MCS) or polylinker

6 Cosntrucción de genes para transformación de plantas

7 Biolistica (bombardeo de partículas)

8 Biolistica (bombardeo de partículas) Desarrollado para transformar plantas que son recalcitrantes a la transformación con Agrobacterium Sanford y colegas en la Universidad de Cornell. Principio. Bombardeo de microproyectiles tungsteno u oro recubierto con ADN- propulsado hacia las células mediante aceleración.

9 Proceso de bombardeo de ADN ADN se usa como recubrimiento de partículas microscópicas de oro o tungsteno. Una vez dentro de las células el ADN se diluye de las partículas. Si el ADN alcanza el núcleo de la célula de la planta, el transgene puede ser incorporado de manera estable en los cromosomas de la célula hospedera.

10 Procedimiento de la Biolistica El disco de ruptura es roto mediante presión (helio). Las ondas de choque lanza los macrocarrier con las partículas cubiertas con ADN (microcarriers). El Macrocarrier impacta una pantalla de parada mientras los microcarriers continúan hacia abajo para impactar e introducirse en la células a transformar.

11 Comparación de métodos de transformación Agrobacterium tumefaciens. Una o pocas copias del T- DNA en el genoma de la célula. Numerosos sistemas de vectores disponibles. Transfiere fragmentos largos de ADN (> 150 kb). Transformación in planta (Arabidopsis-floral dip method). Biolistica. Múltiples copias del transgen. Variedad de explantes a transformar. No necesita de vectores especializados. Aplicable para la transformación de cloroplastos.

12 Comparación de métodos de transformación Células embriogénicas de banano transformadas después de la selección de líneas transformadas. Agrobacterium Biolistica

13 Agrobacterium-mediated transformation with particle bombardment First report of Agrobacterium-mediated transformation in banana. (May et al. 1995)

14 Transformación de células de plantas por electroporación Electroporación es una técnica que utiliza campos eléctricos cortos pero de alta intensidad para permeabilizar reversiblemente las capas lipídicas de la membrana celular. Formación temporal de poros durante la electroporación de protoplastos permite la difusión libre de varias clases de macromoléculas incluyendo anticuerpos, ARN y ADN.

15 Transformación con (PEG) Este método requiere la preparación de protoplastos. Protoplastos obtienen del ADN en presencia de glicol poli etileno (PEG, Polyethylene glicol) permitiendo cambios en la membrana logrando que el ADN ingrese en la célula y a su vez al núcleo para luego integrarse en los cromosomas.

16 Transformación de cloroplastos Cientos-miles de cloroplastos en células fotosintéticas. 50 veces mayor expresión del transgen. Transgenes no sufren de silenciamiento de efectos de posición. Transgene no se puede transmitir por el polen. ARNm policistrónico (expresión de múltiples genes a partir de un ARNm policistrónico).

17 Transformación de cloroplastos El T-DNA del Agrobacterium es enviado hacia el núcleo, no al cloroplasto. Biolistica es usado ampliamente para la transformación de cloroplasto.

18 Genoma del cloroplasto ~120 kb. Arreglado en forma circular o linear con una a cuatro copias por genoma. Una planta posee ~ 100 cloroplasto, y un cloroplasto contiene 100 copias del mismo genoma (un solo gene es representado por lo menos 10,000 veces). Genoma contiene regiones de repetición invertida (20,000 copias).

19 Transformación de cloroplastos Transgenes de los cloroplastos so integrados a través de recombinación homóloga. Vectores para transformación contiene regiones homólogas permitiendo la integración dirigida en el genoma del cloroplasto. Un poco más de 400 pb de secuencias homólogas en cada lado es usado para obtener transformación de cloroplastos a una rasonable frecuencia.

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