REPASO DE CONOCIMIENTOS PREVIOS ESTRUCTURA, ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DEL MATERIAL HEREDITARIO

Transcripción

1 REPAS DE CCIMIETS PREVIS ESTRUCTURA, RGAIZACIÓ Y FUCIÓ DEL MATERIAL EREDITARI LA QUÍMICA DEL GE Tema 0- EXPRESIÓ GÉICA: FLUJ DE IFRMACIÓ GEÉTICA Tema 0- EXPRESIÓ GÉICA: TRASCRIPCIÓ Y TRADUCCIÓ Tema 0- RGAIZACIÓ DEL MATERIAL EREDITARI E EUCARITAS Tema 0- REPLICACIÓ Tema 0- Facultad de Medicina Genética er Curso TEMA 0- LA QUÍMICA DEL GE El AD como sustancia genética.. Propiedades físico-químicas. Propiedades espectroscópicas y térmicas.

2 El AD como sustancia genética Apartados Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod 9 ershey y Chase 9 El AD como sustancia genética Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod El AD podía transformar una cepa de bacteria en otra Dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena) patógena, tiene una cápsula que causa la muerte del ratón AD de células patógenas codifican información para transformar células no patógenas

3 El AD como sustancia genética ershey y Chase AD, no proteína, es el agente infeccioso Bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias se unen a la superficie de la bacteria e inyectan su AD a las células bioquímicamente, es fácil separar el fago de la bacteria AD, no proteína, es el agente infeccioso El AD como sustancia genética ershey y Chase Claves para el experimento: azufre es exclusivo de proteínas (sólo en cisteína/metionina) fósforo es exclusivo de AD Inicialmente: crecer dos lotes de fagos marcar el AD con P marcar la proteína con S Seguidamente: infectar un cultivo de bacterias con los lotes radiactivos de fagos y determinar si las bacterias se han marcado con P ó S Conclusión: sólo la radiactividad de P entró a la bacteria. Por tanto, el AD fue el material transmisor

4 El AD como sustancia genética bjetivos Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod 9 El AD podía transformar una cepa de bacteria en otra. Trabajaron con dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena). La patógena tiene una cápsula que causa la muerte de ratones infectados. Vieron que el AD de células patógenas codifica información para transformar células no patógenas. ershey y Chase 9 AD, no proteína, es el agente infeccioso. Los bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias. Se unen a la superficie de la bacteria e inyectan su AD a las células. Bioquímicamente es fácil separar el fago de la bacteria. En sus experimentos utilizaron los isótopos radiactivos P ó S que marcan AD y proteínas, respectivamente. Apartados Clases Bases ucleósidos ucleótidos Uniones fosfodiéster Secuencia AD/AR Doble hélice del AD élices A, B y Z Estructura secundaria del AR

5 Clases AD un tipo, un propósito AR tipos, propósitos - AR ribosomal base de la estructura y función de los ribosomas - AR mensajero lleva el mensaje - AR transferente lleva los aminoácidos unidad monomérica Bases ácidos nucleicos almacenan información compuestos de una base (la parte de información) un armazón para sostener la base un conector (para unirlo todo) base esqueleto conector

6 Bases ay cuatro bases en el AD. adenina (A) timina (T) guanina (G) citosina (C) C G A C T purina pirimidina Bases hay cuatro bases en el AD. Timina es reemplazada por Uracilo (U) en el AR adenina (A) timina (T) uracilo (U) guanina (G) citosina (C) G A C U purina pirimidina

7 Bases hay cuatro bases en el AD todas tienen hidrógenos aceptores y dadores C G A C T Bases hay cuatro bases todas tienen hidrógenos aceptores y dadores pares de base AT tienen dos puentes de hidrógeno, pares de base GC tienen tres puentes de hidrógeno C G A C T

8 El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos) ribosa es el azúcar armazón del AR Bases C El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos) -desoxirribosa es el azúcar armazón del AD Bases C

9 la base se conecta a la posición (liberando agua) un conector de fosfato se añade a la posición Bases P C base Bases La base se conecta a la posición (liberando agua) un conector de fosfato se añade a la posición la estructura puede extenderse conectando el fosfato al de otro azúcar P C base

10 un nucleósido es la combinación química de base y azúcar ucleósidos P C base nucleósido ucleótidos un nucleótido es la combinación química de base, azúcar y fosfato P C base nucleótido

11 Uniones fosfodiester Cada fosfato se une a la posición de un azúcar y a la del siguiente: enlace fosfodiester Unión fosfodiéster - { el AD es un polímero altamente cargado, con una carga negativa en cada fosfato Uniones fosfodiester y estructura covalente de una cadena de AD Secuencia AD/AR la secuencia corresponde con la secuencia de bases A,C,G,T/U de la cadena dirección cadenas antiparalelas

12 Secuencia AD/AR Doble hélice del AD doble hélice enrollamiento a derechas esqueleto, azúcar + fosfato hacia fuera bases en el interior; unidas por puentes de hidrógeno complementariedad de cadenas: A = T G C

13 Doble hélice del AD Surco menor Surco principal Doble hélice del AD En este gráfico se observa AD adsorbido en una superficie altamente cargada. Se aprecia claramente el surco principal. Una medida sobre el plano indica alrededor de. nm, de modo que el AD se encuentra en la forma B.

14 Doble hélice del AD Características puentes de hidrógeno para emparejar bases apilamiento de los anillos aromáticos de la bases confieren estabilidad los fosfatos en la cara externa están asequibles para interaccionar con cationes surco principal y surco menor el grupo - del azúcar en el AR hace que la doble cadena de AR se una menos fuertemente Atributos funcionales los puentes de hidrógeno de las hebras hacen más fácil el desenrollarse (separarse) las bases aun permanece accesibles (leíbles) desde el borde ay suficiente flexibilidad en en el armazón y las bases para formar una doble hélice élices A, B y Z Comparación del AD A, B y Z A: a derechas, corta y ancha,. A, pb por vuelta B: a derechas, más larga, más fina,. A, 0 pb por vuelta Z: a izquierdas, la más larga, la más fina,.8 A, pb por vuelta : triple hélice, estructura muy poco usual

15 élices A, B y Z élices A y B

16 Diferencias entre AD y AR AD Estructura secundaria del AR AR ácido desoxirribonucleico ácido ribonucleico no hidroxilo en del azúcar hidroxilo en del azúcar A, C, G, T A, C, G, U timina lleva un grupo metil (C ) uracilo tiene un átomo de hidrógeno en la posición en la posición doble cadena cadena simple o doble cadena El AR adopta conformaciones globulares en las que se forman regiones locales en hélice mediante puentes de hidrógeno intramoleculares y apilamiento de bases dentro de la única cadena de ácido nucleico Estas regiones se forman por complementariedad de una parte de la cadena con otra. De ahí, la gran variedad de funciones del AR en la célula Estructura secundaria del AR

17 bjetivos Bases (I) AD: bases, purinas -adenina (A) y guanina (G)- y pirimidinas -citosina (C) y timina (T)-. AR: la timina se sustituye por el uracilo (U). ucleósidos ucleótidos Uniones fosfodiester Base + azúcar. AD: desoxirribosa desoxirribonucleósidos. AR: ribosa ribonucleósidos Base + azúcar + fosfato. TPs & dtps: monómeros AR & AD En polímeros de ác. nucleicos, los azúcares están unidos mediante un fosfato entre la posición de uno y la del siguiente, formando una unión fosfodiester,. Los ácidos nucleicos consisten en un esqueleto direccional azúcar-fosfato con una base unida en de cada azúcar. La unidad de repetición es un nucleótido. Los ác. nucleicos son polímeros altamente cargados con una carga negativa en cada fosfato. Secuencia AD/AR La secuencia de ác. nucleios es la secuencia de bases A, C, G, T/U en la cadena de AD o AR. La secuencia se escribe convencionalmente desde el libre al libre final de la molécula ( -ATAGTC- (AD) o -AUAGUC- (AR). Doble hélice del AD El AD se presenta fundamentalmente como doble hélice. Dos cadenas separadas y antiparalelas de AD se enrollan una alrededor de la otra en una hélice a derechas con el esqueleto azúcar-fosfato hacia fuera y las bases, unidas por puentes de hidrógeno y apiladas una sobre otra, en el interior. A=T, G C. Las dos cadenas son complementarias; una especifica la secuencia de la otra. (y II) bjetivos élices A, B y Z La hélice de AD estándar (Watson-Crick) se conoce como la forma B, y es la estructura predominante in vivo. Existen otras formas de hélice a derechas, como la forma A, adoptada por secuencias de AR in vivo; y formas a izquierdas, denominadas hélice Z, que sólo se forma en secuencias de bases especificas alternantes y no es importante in vivo. Estructura secundaria del AR La mayoría de moléculas de AR son de simple cadena. Pueden plegarse en una conformación compleja, involucrando regiones locales de emparejamiento de bases intramoleculares y otras interacciones de puentes de hidrógeno. Esta complejidad se refleja en la variedad de funciones del AR en la célula.

18 Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos Apartados Estabilidad Viscosidad Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos Estabilidad especificidad puentes de estabilidad interacciones hidrofóbicas y dipolo-dipolo entre las bases apiladas

19 Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos Viscosidad El AD celular es largo y fino nm de diámetro longitud de μm, mm, cm (cromosomas eucarióticos) si el diámetro fuera el de un spaghetti el cromosoma de E. coli (. millones de pb) mediría un km de largo es rígido, como un spaghetti poco cocido Las soluciones de AD son altamente viscosas Las moléculas largas de AD pueden romperse fácilmente: mecánicamente o por sonicación bjetivos Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos Estabilidad Aunque podría parecer obvio que la doble cadena del AD y la estructura del AR se estabiliza por puentes de hidrógeno, no es así. Las uniones de hidrógeno determinan la especificidad del emparejamiento de bases, pero la estabilidad es el resultado de interacciones hidrofóbicas y dipolo-dipolo entre los pares de bases. Viscosidad El AD es muy largo y fino, y las soluciones de AD son muy viscosas. Moléculas largas de AD en solución pueden romperse mecánicamente. Este proceso puede utilizarse para obtener AD de una longitud media específica.

20 Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Apartados Absorción UV Cuantificación Pureza del AD Desnaturalización térmica Renaturalización Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Absorción UV Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz UV a λ max de 0 nm; las proteínas absorben a 80 nm El esqueleto azúcar-fosfato no contribuye apreciablemente Esta propiedad se utiliza para la detección, cuantificación y cálculo de la pureza del AD

21 Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Cuantificación mg/ml: AD de doble cadena tiene A 0 AD de cadena simple tienen A 0 = 0; AR y Estos últimos valores son aproximados porque: -son la suma de las absorbancias de las diferentes bases (purinas tienen mayor coeficiente de extinción que las pirimidinas) - el coeficiente de extinción depende del ambiente que rodea a las bases de manera que: A 0 nucleótidos aislados > A 0 AD cadena simple o AR > A 0 AD doble cadena - dependen del número de regiones de doble cadena (estructura secundaria) Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Pureza del AD

22 Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Desnaturalización térmica Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Desnaturalización térmica

23 Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Renaturalización La renaturalización tiene lugar enfriando la solución de AD Enfriamiento rápido sólo permite la formación de regiones locales de doble cadena formadas por la unión de regiones cortas complementarias Enfriamiento lento permite la complementariedad completa de las cadenas de AD, ya que da tiempo a que cada cadena encuentre a la otra La renaturalización de regiones complementarias entre cadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos Renaturalización

24 Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos bjetivos Absorción UV Cuantificación Pureza del AD Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz a λ max de 0 nm Absorbancia a 0 nm se utiliza para determinar la concentración de los ác. ucleicos. mg/ml y cm de paso de luz: AD de doble cadena tiene A 0 = 0; AR y AD de cadena simple tienen A 0. Estos últimos valores dependen de la composición de bases y de la estructura secundaria La relación A0/A80 de una muestra de AD de doble cadena puede usarse para calcular su pureza. AD puro.8. Valores mayores de.8 sugieren contaminación de AR, y menores, contaminación de proteínas Desnaturalización térmica Renaturalización El aumento de temperatura conlleva la desnaturalización del AD y AR. El AR se desnaturaliza gradualmente, mientras que el AD de doble cadena se funde cooperativamente para dar cadenas simples a una temperatura determinada, Tm, la cual está en función del contenido G+C. El AD renaturaliza por enfriamiento, pero sólo se formará completamente la doble cadena nativa si se enfría lentamente para permitir la unión de las cadenas complementarias