TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD.

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1 AÑO 2010 PRIMER SEMESTRE LABORATORIO ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA. PLAN COMÚN AGRONOMÍA E INGENIERÍA FORESTAL FACULTAD CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD. INTRODUCCIÓN La palabra Proteína fue propuesta por Jöns Berzelius en 1838, proveniente del griego Proteios que significa lo primero, de primera clase, para aludir a un tipo de biomoléculas (mayor a dalton) de enorme importancia en los tejidos vegetales y animales. Las proteínas están formadas por secuencias de aminoácidos unidos por enlaces químicos que los mantienen unidos. Esta unión entre aminoácidos se conoce como enlace peptídico, de ahí que las cadenas de aminoácidos que constituyen una proteína se denominen cadenas polipeptídicas. El enlace peptídico tiene lugar mediante la pérdida de una molécula de agua entre el grupo amino de un aminoácido y el carboxilo de otro: Figura 1.- Formación del enlace péptidico. El resultado es un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir añadiendo aminoácidos al péptido, porque siempre hay un extremo NH 2 terminal y un COOH terminal. El grado de organización estructural de las proteínas es muy complejo e involucran a lo menos cuatro niveles, cada uno de ellos dependiente del que lo precede. Brevemente: 1.- La configuración ó estructura primaria (estructura covalente); determinada por el orden ó secuencia de unión de los aminoácidos. 2.- La configuración ó estructura secundaria; describe el primer grado de plegamiento de la cadena polipeptídica, considerando la disposición en el espacio sin tomar en cuenta la disposición de las cadenas laterales (R) de los residuos de aminoácidos. 3.- La configuración ó estructura terciaria; descripción del segundo grado de plegamiento de la cadena polipeptídica, otorgándole a la proteína forma tridimensional en el espacio y una superficie exterior característica. Está condicionada por la configuración secundaria y la naturaleza de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos (α hélice, hoja plegada β). 1

2 4.- La configuración ó estructura cuaternaria; reservada a las proteínas que poseen más de una cadena polipeptídica (denominada subunidad) y se refiere al ordenamiento espacial de tales cadenas polipeptídicas y a la naturaleza de sus contactos mutuos. Figura 2.- Organización en niveles de estructura de las proteínas. Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de la integridad de sus estructuras. Cuando éstas son alteradas, aunque no haya ruptura de los enlaces peptídicos y puentes disulfuro, la proteína pierde sus propiedades funcionales, físicas y químicas que las caracterizan. Este proceso se denomina desnaturalización, y corresponde básicamente, a la perdida parcial o total de su configuración terciaria. Los agentes desnaturalizantes como los ácidos fuertes (clorhídrico, tricloroacético, perclórico.), álcalis fuertes (hidróxido de sodio, potasio.), el calor mantenido por sobre 50 ºC y una serie de agentes químicos más específicos (urea, β-mercaptoetanol, Dodecil sulfato de sodio, etc.) alteran las configuración secundarias y terciarias de las proteínas. Las proteínas desnaturalizadas presentan una menor solubilidad y habitualmente originan un precipitado. 2.- Métodos de Cuantificación El conocimiento del proteoma, conjunto de proteínas de un organismo, ha pasado a ser el reto de la comunidad científica y de las empresas biotecnológicas, una vez que ya se ha completado la secuenciación del genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor, si no se identifica cual es la función de dichos genes, en su caso, para que proteínas codifiquen. Las investigaciones de las propiedades y funciones de las proteínas a través del uso de técnicas químicas y físicas, han aumentado los conocimientos sobre las bases moleculares de la vida. La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos parcial, de la proteína a estudiar. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la proteína a purificar puede ser extremamente inestable ó encontrarse en concentraciones muy bajas. 2

3 En la práctica bioquímica se requiere la rápida medida de pequeñas cantidades de proteína. La literatura se encuentran diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son: - Reacción del Biuret. - Método de Lowry. - Método de Bradford. - Método del ácido Bicincónico. - Absorción en el ultravioleta. - Métodos inmunológicos. En la práctica se va a ensayar el método colorimétrico de Bradford, pero es importante conocer sobre el método de Biuret, por ser simple, barato y rápido Método de Biuret: La presencia de dos ó más enlaces peptídicos pueden reaccionar con sulfato de cobre en medio alcalino, formando un complejo de color púrpura con registros de absorbancia a 540 nm. El color es aparentemente causado por el complejo de coordinación formado entre el átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno, dos de cada enlace peptídico (figura 3). La cantidad de producto formado (complejo de cobre) genera una intensidad de color que está determinada por la concentración de proteína. Figura 3.- Violeta-púrpura - Complejo proteína-cu(ii). El método de Biuret tiene varias ventajas incluyendo la reproducibilidad, la velocidad, el similar color desarrollado con distintas proteínas y las pocas sustancias interferentes que existen. La principal desventaja de este método es su sensibilidad, ya que requiere concentraciones de proteína relativamente altas (alrededor de 1 a 20 mg/ml) para la formación del color. 3

4 2.2.- Método de Bradford. Las limitaciones del método de Biuret, han estimulado a investigadores a buscar mejores métodos de cuantificación de proteínas en solución.: se emplea un colorante hidrofóbico (cromógeno azul brillante de Coomasie) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm. Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina. El complejo formado entre el cromógeno (azul brillante de Coomasie) y una solución ácida de proteína causa un cambio en la longitud de onda máxima (λ max ) desde 465 nm a 595 nm. La absorción a 595 nm está directamente relacionada en forma lineal con la concentración de proteína. Entre las ventajas de este ensayo destacan que requiere solamente un reactivo (una solución de azul brillante de Coomasie G-250), el desarrollo de color es completo en 2 minutos y su estabilidad es más de 1 hora. La sensibilidad del método es alrededor de 10 a 20 µg de proteína por ml de muestra. En la práctica, una curva de calibración es preparada utilizando una proteína estándar como albúmina sérica de bovino (BSA). El ensayo requiere solamente un reactivo, una solución de Azul Brillante de Coomasie G-250. Posteriormente a la adición del cromógeno a la muestra de proteína, el desarrollo de color es completo en 2 minutos y permanece estable por más de 1 hora. La sensibilidad del método es alrededor de 10 a 20 µg de proteína por ml de muestra. Figura 4.- Curva de calibración con el Método de Bradford. 4

5 II. OBJETIVOS Objetivo general: Cuantificación de Proteínas. Objetivos específicos: 1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas. 2. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino como proteína patrón para el método Bradford. 3. Determinar la concentración de una muestra problema de proteína mediante el método de Bradford (curva de calibración). III. PARTE EXPERIMENTAL Cuantificación proteínas por el método de Bradford. 1.- Curva de calibración: 1.1 Preparar los siguientes tubos a partir de la solución estándar de albúmina sérica de bovino (BSA) 1 µg/µl, según la siguiente tabla: Tubo BSA µl Agua µl Posteriormente adicionar 3 ml de reactivo de Bradford a cada tubo, mezclar cuidadosamente por agitación. Realizar la lectura en espectrofotómetro 595 nm empleando como blanco el tubo 1. 5

6 2.- Determinación de la concentración de diferentes extractos proteicos: Tomar 100 µl de solución problema de proteína y adicionar 3 ml de reactivo de Bradford, luego proceder de igual forma que con las soluciones de proteína estándar. Si la absorbancia es muy alta, entonces se deben realizar diluciones de la muestra. REPETIR PROCEDIMIENTO 2. IV.- REFERENCIAS Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular Clonning, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press., Lehninger, A. L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Principles of Biochemistry 2nd ed., Worth Publishers., Mathews, C. K.; Van Holde, K. E. Bioquímica 2nd ed., McGraw-Hill., Clark, J. M.; Switzer, R. L. Experimental Biochemistry, 2nd ed., Freman and Co., Stryer, L. Bioquímica, 3 era edición, De. Reverté S.A., Bradford, M A Rapid & sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding 6