MANUAL FAR 516 L DEL PERFIL

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1 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMAA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: FARMACIAA ÁREA ESPECÍFICA DE: FARMACIA NOMBRE DE LA ASIGNATURA: CÓDIGO: FECHA DE ELABORACIÓN: NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: TIPO DE ASIGNATURA: MANUAL DE LABORATORIO DE BIOFARMACIA FAR 516 L NOVIEMBRE 2003 FORMATIVO DEL PERFIL PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN: M.C BENJAMÍN SANDOVAL GUZMAN HORAS PRÁCTICA. 2

2 PRACTICAS DE BIOFARMACIA. PRACTICA 1 VOLUMETRIA Y GRAVIMETRIA. INTRODUCCION: Qué es volumétrica? Qué es precisión? Qué es exactitud? Qué es el análisis gravimétrico? Qué métodos se utilizan para el análisis gravimétrico? Cuáles son los rangos de error permitidos para las pipetas utilizadas en la práctica? MATERIAL Y REACTIVOS Pipeta automática de 1000µl. Pipeta graduada 5 ml Pipeta volumétrica 5 ml Pipeta volumétrica de 1 ml Pipeta volumétrica de 3 ml Balanza analítica 2 Vasos de precipitados de 50 ml 2 tubos de ensayo PROCEDIMIENTO: 1. Calibrar la balanza analítica 2. Colocar en un vaso de precipitado un tubo de ensayo vacío colocarlos en la balanza analítica y tararlo. 3. Con las pipetas volumétricas: de 5 ml aforar y agregar al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces 4. Con las pipetas volumétricas: de 3 ml aforar y agregar al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces 5. Con las pipetas volumétricas: de 1 ml aforar y agregar al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces 6. Con la pipeta graduada: de 5 ml aforar y agregar 1ml al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 7. Con la pipeta graduada: de 5 ml aforar y agregar 3ml al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3

3 8. Con la pipeta graduada: de 5 ml aforar y agregar 5 ml al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 9. Con la pipeta automática de 1000µl: Con la pipeta automática de 1000 µl agregar 1000µl al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces mas 10. Con la pipeta automática de 5000µl: Con la pipeta automática agregar 3000µl al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces mas 11. Con la pipeta automática de 5000µl: Con la pipeta automática agregar 5000µl al tubo de ensayo dentro del vaso de precipitado dentro de la balanza analítica, registrar su peso y repetir el procedimiento 5 Hacer lo anterior 3 veces mas RESULTADOS Una vez que se tienen todos los datos se grafican volumen (x) contra peso (y) para cada una de las pipetas usadas. De los datos se obtiene coeficiente de variación el coeficiente de relación, la media, la moda y la desviación estándar para cada pipeta. CONCLUSION: Para qué les sirvió la práctica?

4 LABORATORIO DE BIOFARMACIA. PRACTICA 2 CURVA DE CALIBRACIÓN INTRODUCCIÓN: Características físicas y químicas del acetaminofen Cuántas curvas de calibración existen? Resumen de la ley de Beer (no mayor a una cuartilla). MATERIAL Y REACTIVOS Pipeta graduada 5 ml (por persona) Pipeta volumétrica 5 ml (por persona) Balanza analítica 2 Vasos de precipitados de 50 ml (por persona) 11 tubos de ensayo (por persona) Matraz aforado de 250 ml (por persona) Fosfato dibásico de potasio Fosfato monobásico de potasio PROCEDIMENTO: 1. Preparar 250 ml de medio de disolución (ácido clorhídrico 0.1 N, buffer fosfatos ph 3.5 y 6.5) 2. Hacer 10 ml de una solución patrón de acetaminofen con una concentración de 300µg/ml, en cada uno de los medios de disolución 3. Con esa solución madre tomar 5ml y agregarles 5ml del medio de disolución (dilución de 1:2) y agregarle al tubo Del tubo 1 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 2) 5. Del tubo 2 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 3) 6. Del tubo 3 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 4) 7. Del tubo 4 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 5) 8. Del tubo 5 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 6) 9. Del tubo 6 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 7) 10. Del tubo 7 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml del medio de disolución de agua (tubo 8) 11. Del tubo 8 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml de agua (tubo 9) 12. Del tubo 9 tomar 5ml y colocarlo en otro tubo al cual se le van agregar 5ml de agua (tubo 10) 13. A cada tubo se mide su absorbancia a 250 nm utilizando el uv y el software de Quantitatyve Análisis 14. Obtener la curva de calibración y observar que el coeficiente de relación (r) sea mayor a 0.96 si no es mayor se deberá de repetir la práctica hasta que salga bien. RESULTADOS Una vez que se tienen todos los datos se grafican concentración (x) contra absorbancia (y).de los datos se obtiene coeficiente de variación el coeficiente de relación, la media, la moda y la desviación estándar para cada pipeta. CONCLUSIÓN: Cuál es el objetivo de efectuar procesos de calibración y cuál es la importancia estadística del análisis de los datos?

5 LABORATORIO DE BIOFARMACIA. PRACTICA 3 DISOLUCIÓN DISOLUCIÓN DE TABLETAS DE ACETAMINOFEN INTRODUCCIÓN Investigar la prueba de disolución de acetaminofen (no más de una cuartilla). MATERIAL Y REACTIVOS Disolutor de paletas Vaso de precipitados de 1 litro (por equipo) Marcas diferentes de tabletas de acetaminofen 2 jeringas de 5ml (por equipo) Papel filtro Fosfato dibásico de potasio Fosfato monobásico de potasio Acido clorídrico Acetaminofen PROCEDIMIENTO: 1. preparar 1 litro de medio de disolución (ácido clorhídrico 0.1 N, buffer fosfatos ph 3.5 y 6.5) 2. agregar 900 ml del medio de disolución al vaso del disolutor y prender el baño maria esperar a que el medio este a 37grados. 3. agregar la tableta de acetaminofen prender el equipo a 50rpm 4. esperar 3 minutos para la primera toma de muestra (5ml) mientras que al mismo tiempo con la otra jeringa se agregan 5ml de medio fresco esto es para mantener el volumen constante. 5. así sucesivamente se toman las muestras durante 30 minutos (en total son 10 muestras) 6. después a estas muestras hay que diluirlas 1: leer al uv a 254nm ocupando el software de fixed para medir su absorbancia de cada muestra 8. una vez que se tiene la absorbancia de cada muestra se traslapa a la curva de calibración construida en la practica 2 y se deberá obtener la concentración gráficamente y matemáticamente ocupando la ecuación de línea recta y=mx+b para esto ya tenemos los datos de pendiente e intercepto de nuestra curva de calibración. RESULTADOS Teniendo las concentraciones de cada muestra se hace la siguiente tabla por tableta tiempo Concentración de la curva de calibración mcg/ml Concentración después de multiplicar por el factor de dilución 10 tubo Concentración después de multiplicar por el factor de dilución 900 vaso Concentración total mg mcg/ml 45 mcg/ml mcg 40.5 mcg mcg/ml 450 mcg mcg 405 mg En concentración total colocar la primera concentración más la segunda y en la siguiente fila la segunda más la tercera y asi sucesivamente el valor final deberá ser aproximado a la cantidad reportada en cada tableta.

6 De los cuadros para cada tableta comparar los perfiles de disolución y si cumplen o no con la norma de disolución vista en clase (Q). CONCLUSION: Cuál es el comportamiento con respecto al valor de Q de la prueba de disolución.?

7 LABORATORIO DE BIOFARMACIA. PRACTICA 4 INTESTINO INVERTIDO INTRODUCCIÓN: Cómo se da el proceso de absorción? Mencionar los mecanismos de transporte existentes. Cómo afecta el ph a la absorción intestinal de fármacos en general y del acetaminofen? MATERIAL Y REACTIVOS Pipeta graduada 5 ml (por equipo) Pipeta volumétrica 5 ml (por equipo) Balanza analitica 2 Vasos de precipitados de 50 ml (por equipo) 11 tubos de ensayo (por equipo) Matraz aforado de 250 ml (1 por equipo) Fosfato dibásico de sódio Fosfato monobásico de sódio Probetas de 25 ml (1 por equipo) Acetonitrilo Grado HPLC Tetrahidrofurano Grado HPLC Fosfato dibásico de potasio Fosfato monobásico de potasio Hidróxido de sódio lentejas Acetona grado analítico. Solución glucosada al 50% Ácido perclórico PROCEDIMIENTO: Lavar perfectamente el material de vidrio y secar con acetona. 1. Preparar 100 ml de medio de disolución (ácido clorhídrico 0.10 N). 2. Preparar 100 ml de medio de disolución (buffer de fosfatos ph 6) 3. Preparar 100 ml de medio de disolución (buffer de fosfatos ph 3.5) 4. Preparar 50 ml de una solución de acetaminofen 300 mcg/ml en los medios de disolución manteniendo a 37 C. 5. Desnucar al conejo y obtener una sección de intestino delgado de 10 cm de largo aproximadamente, lavarlo bien con agua destilada para retirar el excremento cuidando de no frotar demasiado el intestino, voltearlo quedando la luz del intestino en la parte exterior. 6. Lavar el intestino con solución glucosada 7. Cerrar un extremo del intestino sujetándolo a un tornillo pesado y el otro extremo sujetarlo bien a una punta de pipeta conectada a la tapa de un tubo cónico falcón de 50 ml. 8. Llenar el intestino con un volumen aproximado de 10ml de medio de disolución sin fármaco e introducir en la probeta que contendrá 20 ml de medio de disolución con fármaco. 9. Esperar 2 minutos y obtener la primera muestra de 4 ml aprox. con una aguja intravertebral cuidando de no perforar el intestino y de reponer el volumen con medio sin fármaco. 10. Tomar 7 muestras ya que el intestino comienza a degenerar a los 20 min. después de cortado. 11. Filtrar las muestras 12. Leer al espectrofotómetro a 254nm ocupando el software de fixed para medir su absorbancia de cada muestra 13. Teniendo la absorbancia de cada muestra se traslapa a la curva de calibración construida en la practica 2 y se deberá obtener la concentración gráficamente y matemáticamente ocupando la ecuación de línea recta y=mx+b para esto ya tenemos los datos de pendiente e intercepto de nuestra curva de calibración.

8 14. Preparar una curva patrón e inyectarla al HPLC, la fase móvil estará compuesta de 43% Acetonitrilo, 2% Tetrahidrofurano y 55 Buffer fosfatos 0.01 M, leer a 278 nm 15. Precipitar proteínas con una solución de ácido perclórico al 10%, cerntrifugar a 3000 rpm durante 3 min, pasar la fase acuosa a un tubo 16.- Efectuar la extracción de la muestras por medio de una mezcla de Cloroformo/alcohol isopropilico 95/5, y Cloroformo/Diclorometano 95/5, 17. Efectuar las inyecciones de las muestras e interpolar en la curva patrón RESULTADOS Una vez que se tienen todos los datos se grafican concentración (x) contra absorbancia (y).de los datos se obtiene coeficiente de variación el coeficiente de relación, la media, y la desviación estándar. Comparar los resultados de los 3 medios de disolución de la sulfametazina, por medio de las graficas de cantidad acumulada permeada vs tiempo. CONCLUSIÓN: Comparar los resultados con los obtenidos al cuantificar las muestras por medio de HPLC Los datos obtenidos en la práctica justifican la teoría ph-partición, de ser así demuéstrelo

9 LABORATORIO DE BIOFARMACIA. PRACTICA 5 LIGAMIENTO A PROTEÍNAS PLASMÁTICAS INTRODUCCIÓN: Importancia del ligamiento a proteínas plasmáticas Métodos para determinarla Representación de los datos MATERIAL Y REACTIVOS 3 Pipetas volumétricas 1 ml (por equipo) Balanza analitica 3 Vasos de precipitados de 50 ml (por equipo) 11 tubos de ensayo (por equipo) Matraz aforado de 250 ml (1 por equipo) Fosfato dibásico de sódio Fosfato monobásico de sódio Probetas de 25 ml (1 por equipo) Acetonitrilo Fosfato dibásico de potasio Fosfato monobásico de potasio Hidróxido de sódio lentejas Acetona grado analítico. Ácido perclórico Dexametasona 21-acetato Metilprednisolona Acetona Alcohol etílico Fenitoína o Difenilhidantoina PROCEDIMIENTO: Lavar perfectamente el material de vidrio y secar con una mezcla acetona/alcohol etílico 1. Preparar 1 L de una solución de albúmina al 4%, agitar suavemente 2. Agregar 200 µl de una solución de metilprednisolona (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 3. Agregar 200 µl de una solución de fenitoína (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 4. Agregar 200 µl de una solución de Dexametasona 21 acetato (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 5. Agregar 100 µl de una solución de metilprednisolona (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 6. Agregar 100 µl de una solución de fenitoína (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 7. Agregar 100 µl de una solución de Dexametasona 21 acetato (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 8. Agregar 50 µl de una solución de metilprednisolona (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min

10 9. Agregar 50 µl de una solución de fenitoína (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 10. Agregar 50 µl de una solución de Dexametasona 21 acetato (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 11. Agregar 25 µl de una solución de metilprednisolona (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 12. Agregar 25 µl de una solución de fenitoína (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 13. Agregar 25 µl de una solución de Dexametasona 21 acetato (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 14. Agregar 10 µl de una solución de metilprednisolona (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 15. Agregar 10 µl de una solución de fenitoína (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 16. Agregar 10 µl de una solución de Dexametasona 21 acetato (200 mcgr/ml) en un vaso que contenga 25 ml de la solución de albúmina al 4%, calentar a 37 C durante 20 min 17 En cada caso Tomar 1ml y pasarlo por una membrana de 0.45 µ, añadir 2 ml de agua HPLC 18 Preparar una curva patrón de cada uno e los fármacos empleando concentraciones desde 2 a 150 mcgr/ml Resultados 1.- Extrapolando los datos de ligamiento en cada una de las curvas patrón determinar las concentraciones libres, para cada fármaco. 2.- A partir de los datos de cada fármaco libre determinar el % ligado 3.- Graficar para cada fármaco las diferentes formas de expresión de datos de ligamiento