Genética Médica Tema 2. Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA

Transcripción

1 Genética Médica Tema Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al. (000) pp-8; pp76-78 Tamarin RH (996) pp0-0, pp-9 Klug WS y Cummings MR (999) pp77-98, pp8-9 Inma Martín Burriel Genética Médica. Tema Curso Estructura y organización del genoma Tema Estructura y organización del Genoma Polimorfismos genéticos: Variaciones en el número de repeticiones Mutaciones puntuales Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicina

2 Estructura en doble hélice del DNA: 0pb /vuelta Destrógira Bases apiladas perpendicularmente Genoma DNA eucariótico Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales No codificantes Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Repeticiones heterocromatina Del centrómero VNTR Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones

3 Genoma Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA eucariótico DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales No codificantes Repeticiones heterocromatina Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) VNTR Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones Gen eucariota Genes de copia única Inicio transcripción Intrón Intrón Intrón Fin transcripción Promotor Exón Exón Exón Exón Región reguladora aguas arriba UTR Región reguladora interna Unidad de transcripción Región reguladora aguas abajo Codifican para una única proteína Se encuentran en una única posición del genoma (un individuo copias)

4 Genoma Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA eucariótico DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales No codificantes Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Repeticiones heterocromatina Del centrómero VNTR Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones Familias génicas Familia génica: grupo de genes de un genoma que derivan de un ancestro común Familia de las globinas (beta globina): loci en HSA Orden según la expresión en el desarrollo Posición y longitud de intrones similar Evolución concertada

5 Familias de genes en tándem Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades: Organizador Nucleolar (NO): Localizado en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (,,, y ) aunque pueden traslocarse Contiene hasta 800 copias del gen del rrna (8S + 8S) Genes del RNAt: 0 sitios cromosómicos 0 a 00 copias/sitio Genes de las Histonas Se mantiene la identidad de secuencia

6 Familia de genes dispersos Familias de genes dispersos: Actinas: de a 0 genes Queratinas: + de 0 Cadena pesada de la Miosina: -0 Tubulinas: - Globinas: hasta Región variable de las inmunoglobulinas: 00 Histonas: Las secuencias entre genes pueden variar Genes homólogos pueden tener funciones diferentes Algunos pierden la función pseudogenes Genoma DNA eucariótico Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales No codificantes Repeticiones heterocromatina Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) VNTR Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones 6

7 DNA repetido Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem DNA basura? - Regulación de la expresión? - Mecanismo de reparación? - Puntos de recombinación? Variación en el número de repeticiones Entrecruzamiento desigual Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación 7

8 DNA repetido en tándem DNA satélite: repeticiones de formaciones muy grandes (00 kb y algunas Mb) DNA no transcrito Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide) Modelos de organización centromérica DNA repetido en tándem DNA minisatélite (VNTR) Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: DNA minisatélite hipervariable DNA telomérico Función DNA telomérico: Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma 8

9 DNA repetido en tándem DNA microsatélite (STR): Short TandemRepeat Pequeñas formaciones (generalmente < 0pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de a nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 0) Herencia mendeliana codominante Alelo CA CA CA CA CA CA Alelo CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA DNA repetido en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites (VNTR) 0, pb Elec. agarosa Microsatélites (STR) pb -pb Elec. Acrilamida Secuenciación 9

10 DNA repetido en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites (VNTR) 0, pb -00 pb Elec. agarosa Microsatélites (STR) pb -pb Elec. Acrilamida Secuenciación Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población Genética Médica Polimorfismo genético: Cuando un locus presenta al menos alelos y la frecuencia alélica del más raro es > % locus polimórfico. El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad. 0

11 DNA minisatélite hipervariable Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,-0 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG Son muy polimórficas Se encuentran en intrones Estas secuencias se han empleado como huellas dactilares DNA minisatélite hipervariable Detección del polimorfismo: RFLP + Southern (hibridación con sonda)

12 0 6 8 INDIVIDUO 7 9 INDIVIDUO INDIVIDUO INDIVIDUO VNTRs

13 DNA minisatélite hipervariable Funciones de los VNTRs: Regulación de puntos activos de recombinación Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) Podrían dar estabilidad a los cromosomas Aplicaciones: Identificación individual (medicina forense)

14 DNA microsatélite Localización dispersa en todos los cromosomas Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante. A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES). Secuencia repetida de a pb. Las secuencias flanqueantes a la repetición son únicas. Son muy polimórficas. Detección del polimorfismo: PCR

15 DNA microsatélite Visualización de los microsatélites: Secuenciación: Genotipado: ACGT DNA microsatélite Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM Expansión de pentanucleótidos: SCA0

16 DNA microsatélite Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: Enfermedades de herencia recesiva ligada al X expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) Enfermedades con herencia dominante expansión de tripletes produce una proteína alterada Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes expansiones en el ARN función celular alterada? DNA microsatélite Aplicaciones: Identificación individual Análisis evolutivo de poblaciones Diagnóstico directo en enfermedades genéticas causadas por expansión de trinucleótidos Diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas: Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad. 6

17 Diagnóstico individual Análisis de marcadores microsatélites Diagnóstico directo Ejemplo: Diagnóstico corea de Huntington Nº repet < >9 Clasificación Normal Intermedio Penetrancia I Penetrancia T E.H. No No +/- Si

18 Diagnóstico indirecto HSA7 Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas Fibrosis quística Ms CFTR Ms Ms ?? CFTR* CFTR* CFTR* CFTR*?????? Resumen de polimorfismos genéticos Etiología Detección Frecuencia genómica Microsatélites errores de DNAp PCR /0.000 bp (short tandem slippage repeats) STRs Minisatélites entrecruzamiento Southern variable, baja (variable no of no equilibrado tandem repeats) unequal crossing over VNTRs RFLPs mutaciones Southern-PCR baja (restriction fragment length polymorphisms) SNPs mutaciones PCR /000 bp (Single nucleotide Polymorphisms) 8

19 Mutaciones Puntuales Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales: Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:/000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Alelo Alelo TACGAGCTA TACGGGCTA En regiones codificantes: Mutaciones con cambio aminoacídico GCA (Ala) GTA (Val) Mutaciones sin sentido AAA (Lys) TAA (stop) Mutaciones silentes GCA (Ala) GCC (Ala) Mutaciones: - Cambio de base -Inserción - Deleción Metodología para determinar mutaciones puntuales RFLPs: Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting PCR + enzima de restricción Baja variabilidad ( alelos). Localización: Exones Genes de copia única SNP: Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real Baja variabilidad ( alelos) Localización: Exones DNA de copia única 9

20 RFLPs Determinación mediante Southern Diagnóstico genético por RFLPs A RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) RE RE RE RE RE aa A a Aa Aa Ms t I I Aa AA aa aa Aa AA aa a AA Aa aa Polimorfismo debido a mutaciones puntuales En el gen de la globina normal la secuencia correspondiente al th- 7th aminoácido del péptido betaglobina es CCTGAGGAG que es reconocida por la enzima de restricción MstII. En la variable patológica de la anemia falciforme, eritrocitos en hoz-sickle, se produce una mutación puntual de A a T, lo que invalida el reconocimiento por MstII. En la correspondiente digestión enzimática se genera un único fragmento de, kb en lugar de los dos fragmentos de 0, kb y, kb propios del gen normal. Los diferentes fragmentos se detectan por técnica de Southern blotting 0

21 Determinación de PCR-RFLPs Mutación: Alelo Alelo PCR: Aat II TGGACGTCT TGGATGTCT TGGACGTCT TGGAGGTCT Fragmento PCR Electroforesis PCR Alelo Alelo RFLPs: Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting PCR + enzima de restricción Baja variabilidad ( alelos). Localización: Exones Genes de copia única Genética Médica Según metodología de detección SNP: Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real Baja variabilidad ( alelos) Localización: Exones DNA de copia única

22 SNPs SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: Presentación muy frecuente (/00 pb) 0 a 0 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 0-6 vs 0 - de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética Secuenciación: MCL Determinación de SNPs PCR en tiempo real con sondas alelo específicas: Minisecuenciación:

23 Mutaciones puntuales Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina: Pueden originar diferencias muy sutiles o provocar la muerte Mutaciones en líneas germinales: Neurofibromatosis (dominante) Acondroplasia (dominante) Hemofilia (Factor VII, ligado al X) Mutaciones somáticas: Cáncer: mutaciones de protooncogenes Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos Genética Médica Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: Identificación individual (Medicina forense) Construcción de los mapas génicos Ligamiento con fenotipos

24 Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (00). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 00; : 68-6