Problemas asociados al muestreo y procedimiento para la aplicación de límites de tolerancia

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1 CUA~Tlm=ICACI()~ [)~ MIC()T()Xl~A~ ~~ f7[ 4,~()~ ~ U~l!IV AU()S Problemas asociados al muestreo y procedimiento para la aplicación de límites de tolerancia José Olavarría M Aspergillus flavus, especie de hongo productor de aflatoxinas creciendo sobre grano de trigo Las micotoxinas son compuestos orgánicos tóxicos de diversa estructura química considerados metabolitos secundarios Son producidos por varias especies de hongos sobre diferentes sustratos y bajo ciertas condiciones ambientales Estos hongos pertenecen principalmente a los géneros Aspergíllus, Penicillium y Fusarium que son saprófitos habituales del suelo y del aire Cuando las condiciones son adecuadas colonizan diversos sustratos, siendo habitual encontrarlos en granos, productos y alimentos destinados a consumo animal y humano La capacidad de producción de micotoxinas está condicionada por el tipo de hongo, las características del sustrato y las condiciones externas como humedad, temperatura y luz Esto signi fica que la presencia de un hongo en un producto no implica nece sariamente Ja presencia de mi cotoxinas Aunque se han identificado centenas de micotoxinas, las más conocidas y estudiadas, dada su pre valencia y toxicidad en diversos productos almacenados, son las aflatoxinas, siendo particularmente susceptibles el maní, la semilla de algodón y el maíz 18 IPA La Platina N 67

2 ANTECEDENTES El Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), ha venido realizando desde hace varios años un control de Ja presencia de aflatoxinas en insumos y productos importados para consumo animal, teniendo un notable incremento el número de análisis en los dos últimos años, especialmente con productos provenientes de Argentina, Bolivia y Paraguay (Cuadro 1) Un análisis de esta información indica que el mayor porcentaje de contaminación lo presentan los productos derivados del maní y algodón, alcanzando este último los niveles más altos de afiatoxinas totales Cuadro 1 Número de muestras de insumos y productos importados para alimentación animal sometidas a análisis de aflatoxinas (81, 82, G1 y G2) por el SAG durante 1989 y 1990 Nº de muestras Producto Procedencia Total Maní (pelle!) Argentina Sorgo Argentina 13 o 13 Soya (harina, pelle!) Argentina Bolivia Paraguay Maíz (grano, gluten) Argentina EEUU o 5 5 Suplemento alimenticio Argentina Algodón (pellet) Argentina 3 o 3 Paraguay Maravilla (pelle!) Argentina o 4 4 Total Fuente: Datos estractados de!os registros de análisis de laboratorio del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) Por otra parte, diversos países han establecido una normativa fijando niveles máximos tolerables de afiatoxinas B 1 y totales para diversos insumos y produc tos de consumo animal (Cuadro 2) como una forma de proteger la productividad de sus sistemas pecuarios Se puede observar una gran variabilidad en los límites tolerados por los diferentes países, debido entre otras razones a que no existe consenso sobre los métodos de muestreo y análisis y tampoco sobre los niveles de contaminación que no producen efectos adversos El muestreo de un lote es la mayor fuente de error en la determinación de micotoxinas 1 PA La Platina Nº 67 19

3 Cuadro 2 Niveles máximos tolerados de aflatoxinas en insumos y alimentos para animales en diversos países Máxima tolerancia B1 (81 +B2+G1 +G2) País Producto (ug/kg ó ppb) Vigencia Alemania 3 Ingredientes para alimentos 200 Argentina 2 Maíz, Maní y subproductos Harina de soya 30 Austria 1 Todos los alimentos Canadá 1 Alimentos para ganado Colombia 2 Alimentos para aves Alimentos para bovinos 50 CEE 1 Alimentos directos Alimentos balanceados: - vacunos, ovinos y caprinos 50 - porcinos y aves 20 - otros 10 Ingredientes (semilla de algodón, maíz y derivados, otros) Costa Rica 2 Maíz consumo animal 50 Cuba 2 Alimentos para animales 20; 30; 50' (según tipo animal) Dinamarca 3 Ingredientes para alimentos 50 El Salvador2 (Igual a Normas de la CEE) ',,, EEUU 1 Alimentos e ingredientes Harina de semilla de algodón para alimentación de ganado carne, cerdo, aves Maíz para ganado carne (de término) 300 Maíz para cerdos ( > 45 kg) 200 Maíz para crianzavacunos, cerdos y aves maduras 100 Francia 3 Ingredientes para alimentos 100 Israel (Iguala Normas de la CEE), ltalia 3 Ingredientes para alimel]tos IPA La Platina N 67

4 Continuación Cuadro 2 Máxima tolerancia 81 (B1+B2+G1+G2) País Producto (ug/kg ó ppb) Vigencia Japón 1 Afrecho maní importado 1000 No más de 2% de alimentos para ganado lechero; no más de 4% en alimentos para pollos (sobre 4 semanas), cerdos (sobre 2 meses) Noruega 1 Alimentos completos (dependiendo del tipo de animal) Países Bajos 3 Ingredientes para alimentos 1000 Polonia 1 Ingredientes para alimentos 50 Alientos completos para: - cerdos, aves, vacas lecheras 20 - vacunos, ovinos, cabras 50 - otros alimentos 50 Portugal1 Ingredientes para alimentos 50 Afrecho maní 500 Reino Unido 1 Maní y derivados Suecia 1 Materias primas Alimentos mezclados Alimentos completos para: - vacunos, ovinos y cabras - cerdos y aves - otros alimentos Fuentes: 1 Segunda Conferencia Internacional Conjunta FAO/OMS/PNUMAsobre Micotoxinas Documento MYC 87 /92 Current Limit and Regulations on Mycotoxins Abril Jnforme de países participantes en el "Taller Conjunto F AO/OPS sobre prevención y control de Micotoxinas en América Latina y el Caribe" San José, Costa Rica Febrero Segunda Conferencia Internacional Conjunta FAO/OMS/PNUMA sobre Micotoxinas Documento MYC 87 /6 Aspectos económicos y comerciales de las m1cotox1nas Abril 1987 Frente a esta situación y considerando antecedentes de la normativa de otros países, el SAG ha fijado niveles máximos de aceptación para partidas de alimentos e ingredientes de uso animal que presenten contaminación por aflatoxinas a través de la Resolución Exenta Nº 707 del 14 de mayo, (Cuadro 3) que reemplazó la N 54 del 14 de enero Esta última estaba vigente desde el primero de abril Esta normativa ha sido motivo de controversia debido a la rigidez de su aplicación y a la falta de consideración en aspectos fundamentales como el muestreo y la interpretación de los resultados analíticos correspondientes Actualmente esta normativa está siendo estudiada en conjunto con el Reglamento de Alimentos para Animales por diversos IPA La Platina N 67 21

5 especialistas convocados por la División de Protección Pecuaria del SAG, para actualizar la legislación vigente que dice relación con la fabricación y comercialización de alimentos, suplementos, aditivos e ingredientes de uso en alimentación animal y de posibles contaminantes; entre éstos, las micotoxinas Cuadro 3 Limites máximos de contaminación por aflatoxinas (en ug/kg ó ppb) en alimentos e ingredientes de uso animal (Resolución Exenta del SAG Nº 707 del 14 de Mayo de 1991) Tolerancia máxima de aflatoxinas Producto 81 (B1+B2+G1+G2) Alimentos Ingredientes 5 20 (ug/kg ó ppb) Los antecedentes que se entregan a continuación corresponden a la proposición planteada por el INIA, para establecer un procedimiento que minimice los errores asociados a la determinación de micotoxinas, considerando un balance entre los riesgos del vendedor y del comprador FUENTES DE ERROR El error total asociado a la cuantificación de micotoxinas está relacionado con cada uno de los pasos siguientes: a) Muestreo del lote o error de muestreo ppb : partes por billón b) Submuestreo del material molido (molienda gruesa) o error del primer submuestreo c) Submuestreo del material finamente molido (molienda fina) o error de submuestreo fino y d) Determinación de la concentración de micotoxinas sobre una submuestra de 50 g o error analítico La información bibliográfica de diversos ensayos demuestra que, en general, el muestreo del lote constituye la mayor fuente de error y habitualmente no se le da la importancia que tiene, le sigue el submuestreo (grueso y fino) y luego el error asociado al análisis químico Un diagrama de las fuentes de error asociadas a la estimación de la concentración de la micotoxina se esquematiza en la Figura 1 Según esto, el resultado analítico x de una muestra está afectado por diferentes errores que se pueden representar por la ecuación: - ~ 'E- ERROR DE MUESTREO ', ERROR ~ DE 'SUBMUESTREO ERROR TOTAL _ ~ / ERROR ERROR / DE - ANALITICO ' SUBMUESTREO / "' {TLC) FINO - ;;_: ' LOTE - MUESTRA - SUBMUESTRA, SUBMUESTRA - ANALISIS, FINA - TLC Figura 1 Etapas utilizadas en la cuantificación de micotoxinas a partir de un lote de productos agrícolas 22 IPA La Platina N' 67

6 x = u + e1 + e2 + e3 + e4 donde: u = concentración real de la micotoxina e1 = error de muestreo e2 = error de submuestreo grueso e3 = error de submuestreo fino e4 = error analítico MUESTREO Dada la naturaleza heterogénea de la contaminación por una micotoxina dentro de un lote, especialmente en productos granulados (cereales u oleaginosas), y la 1) gran diferencia de concentración que se puede presentar en los sistemas de almacenamiento (silos y bodegas), la problemática de la obten- 2) ción de una muestra representativa del lote es mayor 3) El método más efectivo y práctico es obtener muestras primarias pequeñas del producto en flujo, tantas veces como sea posible sin acumular mayor cantidad que lo necesario Las muestras estacionarias de un silo o bodega probablemente no son representativas del lote, pero esta situación puede mejorarse obteniendo la muestra después de un transilaje Además, es importante considerar el número de muestras a tomar, los lugares donde hacer el muestreo y la forma de realizarlo Esta metodología difiere si el producto está a granel o ensacado IPA La Platina N 67 En función de estas consideraciones, se sugiere utilizar en los planes de muestreo para micotoxinas la Norma COPANT 989/78 Cereales Muestreo de Granos o la Norma Chilena NCh 531, of 1985 del INN Granos Alimenticios Extracción de Muestras, que son equivalentes, con algunas modificaciones orientadas a disminuir el error en la determinación de la micotoxina Otros antecedentes señalan que las alternativas para reducir el error de muestreo son: Recolectar muestras representativas mayores ó, en otras palabras, aumentar el número de muestras primarias Realizar el análisis de varias muestras del lote Reducir el nivel de contaminación aceptado de un lote o tolerancia máxima permitida Otro factor que influye en el error de muestreo es el tamaño del lote A mayor tamaño corresponde una muestra representativa mayor, pero es conveniente delimitar este tamaño (menor a 500 ton) para facilitar la inspección Tomando en cuenta que el aumento del tamaño de muestra reduce el error de muestreo, pero aumenta el tiempo y los costos de muestreo, se sugiere obtener una muestra para laboratorio, a partir de la homogeneización de la muestra global, de aproximadamente 6 kilogramos como mínimo, la cual debe quedar debidamente sellada e identificada Esto no hace variar sustancialmente el procedimiento de muestreo descrito en las Normas Posteriormente se sugiere secarla hasta 13 por ciento de humedad (BH) o menos, y colocarla en envase sellado y en refrigeración para evitar el desarrollo posterior de hongos y posibles micotoxinas De esta forma se almacena hasta su análisis TRATAMIENTO DE LA MUESTRA Como el error de submuestreo se reduce al aumentar el número de partículas, el paso siguiente será moler la muestra de modo que pase por malla 14 Mesh o de abertura de 1, 17 mm (molienda gruesa), homogeneizar y dividir en dos submuestras de alrededor de 3 kg cada una mediante un divisor de muestras (tipo Boerner) Una de las submuestras se guarda para un eventual segundo análisis y la otra se vuelve a moler, de modo que todo el material pase por malla 20 Mesh o abertura de 0,85 mm (molienda fina), se homogeneiza y se vuelve a dividir hasta obtener una submuestra de 50 g, que es la cantidad requerida para el análisis químico por cromatografía en capa fina (TLC) 23

7 24 Si consideramos un valor propone como procedimiento límite de tolerancia para la práctico fijar un límite de hasta contaminación por aflatoxinas 40 ppb para aceptar un lote totales de 50 ppb, (partes por con el primer análisis Si este billón) en granos y derivados primer análisis presenta nipara alimentación animal, que veles superiores a 70 ppb se es el valor vigente en la le- rechaza inmediatamente la gislación del SAG, debemos partida, y si el resultado se aceptar que los resultados encuentra entre 40 y 70 ppb, analíticos de una muestr'\ entonces debe realizarse un proveniente de un lote con- \segundo análisis a partir de laminado con un nivel medio la segunda submuestra de real de 50 ppb puede presen- más o menos 3 kg, siguiendo tar una gran variabilidad Un el mismo procedimiento que estudio realizado en EEUU para la primera muestra en maní, en que se realizaron diez análisis para cada lote El resultado promedio de evaluado, se encontró que un ambos análisis no debe ser valor medio de 46,8 ppb pre- superior a 55 ppb para acepsentaba valores medidos tar el lote considerado; en desde O a 134 ppb con un caso contrario debe recha Coeficiente de Variación de zarse (ver flujo en Figura 2) 84,5 por ciento Para niveles Un procedimiento similar se promedio de contaminación ha propuesto en Argentina menores el Coeficiente de con un límite de tolerancia de Variación (por ciento) fue 20 ppb mayor El procedimiento descrito Otra forma de reducir el ries- puede adaptarse a otros go de rechazo de lotes con- límites de tolerancia que siderados buenos o de acep- puedan fijarse a futuro con el tación de lotes con niveles objeto de minimizar los efecsobre lo tolerado (riesgo de tos adversos de diversos inconsumidor) es aumentado el sumos y productos emnúmero de análisis En con- pleados en producción pecordancia con los niveles es- cuaria Estos límites deben tablecidos por el SAG y basarse en antecedentes biconsiderando antecedentes bliográficos hoy disponibles, bibliográficos, se piensa razo- y en estudios prospectivos de nable el límite de tolerancia incidencia a nivel nacional de 50 ppb en ingredientes que, dada la magnitud de los para alimentación animal, y se recursos requeridos, aún no es posible realizar en el país Estudios preliminares llevan a considerar la necesidad de evaluar el grado de incidencia, niveles y posibles efectos en el sector agropecuario de otras micotoxinas como Zearalenona, Tricotecenos, Moniliformina y Esporidesmina También surge la necesidad de estandarizar y oficializar métodos y capacitar personal dedicado a actividades especfficas dentro del sistema para la cuantificación de micotoxinas Finalmente hay que destacar que para poder garantizar con cierta certeza que la importación de granos y derivados para alimentación animal no presenta niveles de contaminación por micotoxinas que produzcan daño económico en la producción pecuaria, el establecimiento de un procedimiento como el descrito es fundamental, con particular énfasis en la operación de muestreo y en la práctica de técnicas analíticas de alta precisión (Cromatografía en Capa Fina (TLC) o Anticuerpos Monoclonales) previamente evaluadas y desarrolladas por personal calificado en laboratorios controlados IPA La Platina N 67

8 ARTICULO DE CONSUMO (LOTE) MUESTRA DE LABORATORIO (± 6 KG mínimo) MUESTREO NORMA COPANT 989/78 o NORMA CHILENA NCh 531of1985 (MODIFICADAS) MOLIENDA (MALLA 14) MEZCLA (HOMOGENIZADOA) SUBMUESTRA 1 (M1) (± 30 KG) SUBMUESTRA 2 (M2) (± 30 KG) MOLIENDA (MALLA 20) A l--+h----1 MOLIENDA (MALLA 20) ANALISIS TLC (M1) (50 g) ANALISIS TLC (M2) (50 g) l---4o< B NO ACEPTO RECHAZO RECHAZO SI NO Figura 2 Procedimiento para la aceptación o rechazo de lotes contaminados por aflatoxinas Límite de tolerancia: m t IPA La Platina N 67 25

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