1 Uso previsto. 2 Descripción del método. 4 Composición. 3 Especificaciones. 5 Estabilidad y almacenamiento. INOCVK-U INOCVK-G v.2.
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- Santiago Toro Pérez
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1 Formato UNIVERSAL INOCVK-U INOCVK-G v.2 1 Uso previsto RealCycler INOCVK-U / INOCVK-G es un kit de reactivos que permite la detección por PCR a tiempo real del gen metalobetalactamasa blaimp, del gen blandm (Nueva Delhi metalobetalactamasa), del gen de carbapenemasas blaoxa, del gen betalactamasa blactx-m, del gen de metalobetalactamasas blavim y de los genes de carbapenemasas blakpc en muestras clínicas. El sistema incluye un control interno CHIC (Competitive Heterologous Internal Control) para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibición de la reacción. 2 Descripción del método La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está basada en la amplificación de una región específica del ADN/ARN usando oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana. En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluoróforos que emiten fluorescencia en caso de amplificación. El ciclo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento significativo en la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN/ARN presente en la muestra. Este valor se denomina Ciclo umbral (Ct -Cycle Tresholdo Cq -Cycle Quantification-). En la amplificación de IMND, el gen blaimp se detecta en el canal correspondiente al fluoróforo FAM, CHIC en el correspondiente al fluoróforo Alx532 o HEX y el gen blandm en el correspondiente al fluoróforo TxR. En la amplificación de OCTVIK, el gen blaoxa se detecta en el canal correspondiente al fluoróforo FAM, el gen blactx-m en el correspondiente al fluoróforo Alx532 o HEX, el gen blavim en el correspondiente al fluoróforo TxR y los genes blakpc en el correspondiente al fluoróforo Alx647 o Cy5. 3 Especificaciones Sensibilidad blaimp: 10 copias/µl. blandm-1: 100 copias/µl. blaoxa-48: 10 copias/µl. blactx-m1: 1 copia/µl. blactx-m2: 10 copias/µl. blactx-m9: 1 copia/µl. blavim: 10 copias/µl. blakpc: 10 copias/µl. blaoxa: gen blaoxa (genes blaoxa-48, blaoxa-162, blaoxa-163, blaoxa-244, blaoxa-245, blaoxa-247 y blaoxa-370; no se descarta la detección de otras secuencias del grupo blaoxa). blactx-m: genes blactx-m (blactx-m1, blactx-m2, blactx-m8, blactx-m9 y blactx-m25; no se descarta la detección de otras secuencias del grupo blactx-m). blavim: genes blavim (blavim-1, blavim-2, blavim-3, blavim-4, blavim-5, blavim-6, blavim-8, blavim-9, blavim-10, blavim-11, blavim-12, blavim-15, blavim-16, blavim-17, blavim-18, blavim-19, blavim-20, blavim-23, blavim-24, blavim-25, blavim-26, blavim-27, blavim-28, blavim-29, blavim-30, blavim-31, blavim-32, blavim-33, blavim-35, blavim-36, blavim-37 y blavim-38; no se descarta la detección de otras secuencias del grupo blavim). blakpc: genes blakpc (blakpc-1, blakpc-2, blakpc-3, blakpc-4, blakpc-5, blakpc-6, blakpc-7, blakpc-8, blakpc-9, blakpc-10, blakpc-11, blakpc-12, blakpc-13, blakpc-14 y blakpc-15; no se descarta la detección de otras secuencias del grupo blakpc). La validación de la especificidad ha sido realizada mediante ensayos experimentales y el análisis BLAST ( 4 Composición RealCycler INOCVK-U / INOCVK-G incluye la mezcla de reacción AmpliMix IMND y AmpliMix OCTVIK, un Control Positivo ADN IMND, el cual contiene una mezcla de ADN de blaimp y blandm-1, y un Control Positivo ADN OCTVIK el cual contiene una mezcla de ADN de blaoxa-48, blactx-m1, blactx-m2, blactx-m9, blavim y blakpc. Cada muestra debe ser analizada simultáneamente con las dos AmpliMixes (IMND y OCTVIK). La AmpliMix OCTVIK no puede utilizarse individualmente, dado que no incluye CHIC. Todos los reactivos están listos para su uso sin añadir ni reconstituir ningún componente. Componente INOCVK-U Viales INOCVK-G Volumen AmpliMix IMND μl AmpliMix OCTVIK μl Control Positivo ADN IMND μl La sensibilidad analítica ha sido determinada por el método de dilución límite. La sensibilidad ha sido obtenida en ensayos repetitivos con una reproducibilidad superior al 95%. Control Positivo ADN OCTVIK μl Especificidad blaimp: genes blaimp (blaimp-1, blaimp-2, blaimp-6, blaimp-8, blaimp-10, blaimp-11, blaimp-15, blaimp-19, blaimp-20, blaimp-21, blaimp-22, blaimp-24, blaimp-25, blaimp-40, blaimp-41 y blaimp-42; no se descarta la detección de otras secuencias del grupo blaimp). blandm: gen blandm. Número de determinaciones: RealCycler INOCVK-U permite realizar determinaciones (12+12 para SmartCycler ). RealCycler INOCVK-G permite realizar determinaciones (24+24 para SmartCycler ). 5 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler INOCVK-U / INOCVK-G deben ser almacenados a -20 C. El kit es estable a -20 C hasta la fecha de caducidad que consta en la etiqueta externa del kit. 1 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 2
2 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado - Equipo de PCR a tiempo real. - Sistema de purificación de ADN. - Guantes desechables. - Pipetas calibradas. - Puntas de pipeta con filtro. - Congelador (-20 C). - Control negativo (ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución). 7 Advertencias y precauciones - Todos los componentes del kit deben mantenerse en frío mientras se están manipulando. - Después de añadir el ADN, minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificación. - Los tubos con la mezcla de amplificación no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado. - Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit. - Usar guantes desechables. - Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro. - Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas prácticas de laboratorio. - Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un análisis. - No usar el kit después de la fecha de caducidad. - La presencia de polimorfismos en las secuencias de unión de las sondas u oligonucleótidos al ADN/ARN del patógeno puede generar resultados erróneos. En el caso de discordancia entre las observaciones clínicas y los resultados obtenidos se aconseja comprobar los resultados mediante métodos alternativos. - Los resultados obtenidos con este kit de diagnóstico deben utilizarse e interpretarse en el contexto de un cuadro clínico general y no deben ser el único criterio para la toma de decisiones clínicas. - Uso para diagnóstico in vitro. - Cepheid y SmartCycler son marcas registradas de Cepheid Corporation. - CFX96 es una marca registrada de Bio-Rad. - ABI 7500 es una marca registrada de Life Technologies. - QIAamp, QIAcube y BioRobot EZ1 son marcas registradas del Grupo QIAGEN. - Maxwell es una marca registrada de Promega Corporation. - NucliSENS easymag es una marca registrada de biomérieux. - Arrow/LIAISON IXT es una marca registrada de DiaSorin. 8 Muestras clínicas - Recoger las muestras en tubos estériles. - Almacenarlas y transportarlas congeladas a -20 C hasta su uso. - El kit es compatible con cualquier muestra en la cual el patógeno está presente y se pueda extraer un ADN de calidad. Muestras clínicas validadas: blaimp: cultivo, esputo, exudado anorrectal, exudado de vías altas y lavado blandm-1: exudado de vías altas. blaoxa-48: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado blactx-m1: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado blactx-m2: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado blactx-m9: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado blavim: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado blakpc: cultivo, esputo, exudado de vías altas y lavado 9 Procedimiento a) Purificación de los ácidos nucleicos El ADN debe purificarse a partir de las muestras clínicas utilizando un procedimiento adecuado. En el mercado se encuentran disponibles gran cantidad de sistemas de purificación de ácidos nucleicos. Realizar el procedimiento de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante y partir del volumen de muestra recomendado. Sistemas de purificación validados: QIAamp DNA Blood Mini kit (referencias 51104, 51106). QIAGEN. Arrow/LIAISON IXT (referencia Viral NA Extraction Kit). DiaSorin. Sistemas de purificación compatibles: Maxwell 16 Cell LEV DNA Purification kit. Promega Corporation. BioRobot EZ1. QIAGEN. QIAcube. QIAGEN. NucliSENS easymag. biomérieux. Procedimiento IMND b) Protocolo Programar el protocolo de amplificación IMND de acuerdo con las siguientes especificaciones: Tiempo Temperatura Ciclos Fluorescencia 15:00 95 C 1 OFF 0:15 95 C OFF 0:30 60 C 45 ON 0:30 72 C OFF Selección de fluoróforos: - FAM: detecta el gen blaimp. - Alx532/HEX: detecta CHIC. - TxR: detecta el gen blandm. 3 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 4
3 c) Preparación de la reacción c.1) Equipos que requieren un volumen de reacción de 20 µl (ej.: CFX96 de Bio-Rad). - Descongelar la AmpliMix IMND y el Control Positivo ADN IMND. Utilizar como control negativo ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución de ADN (no proporcionados). - Preparar los tubos de amplificación necesarios para muestras y controles. - Pipetear 14 μl de AmpliMix en cada tubo de amplificación. - Añadir 6 μl del ADN de cada muestra o control a cada tubo. - Colocar los tubos en el equipo. - File > New > Plate > Unknown > Seleccionar los fluoróforos (FAM, HEX y TxR) > OK > Save. - Seleccionar el protocolo IMND. - Iniciar el programa de amplificación: Start Run > Close lid > Start Run. c.2) Equipos que requieren un volumen de reacción de 25 µl (ej.: SmartCycler de Cepheid ). - Descongelar la AmpliMix IMND y el Control Positivo ADN IMND. Utilizar como control negativo ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución de ADN (no proporcionados). - Preparar los tubos de amplificación necesarios para muestras y controles. - Pipetear 17,5 μl de AmpliMix en cada tubo de amplificación. - Añadir 7,5 μl del ADN de cada muestra o control a cada tubo. - Colocar los tubos en el equipo. - Seleccionar el protocolo IMND. - Iniciar el programa de amplificación. - Deseleccionar Automatic Threshold. - Indicar Threshold Target a Target: Target 1 (blaimp): Target 2 (CHIC): Target 3 (blandm): Hacer click en Save Changes. - Hacer click en Apply Analysis Settings. e) Interpretación del resultado de los controles - Resultados válidos de los controles d) Ajustar el umbral de fluorescencia Canales d.1) CFX96 de Bio-Rad Ajustar el umbral de fluorescencia para cada canal: Control Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 CHIC TxR Alx647 Interpr. - FAM: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. - HEX: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. - TxR: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. POS POS Indiferente POS - VÁLIDO NEG NEG POS NEG - VÁLIDO d.2) SmartCycler de Cepheid - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > d.3) ABI 7500 de Life Technologies - Select the dye to use as passive reference > None. - En la ventana de Analysis hacer click en Analysis Settings. - Resultados inválidos de los controles En el caso de obtener en algún canal del Control Positivo (excepto en CHIC) un resultado negativo, se considera que ese control es inválido. Los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). En el caso de obtener en algún canal del control negativo (excepto en CHIC) un valor de Ct > 0, los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). - En la ventana que aparece hacer click en Edit Default Settings. 5 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 6
4 f) Interpretación de los resultados de las muestras Interpretar el resultado obtenido en cada muestra o control según la combinación de señales indicadas en la siguiente tabla: Canales Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 CHIC TxR Alx647 POS Indiferente NEG - Interpretación blaimp NEG Indiferente POS - POS Indiferente POS - blandm blaimp y blandm Gráfica 3 (Canal TxR: blandm-1): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo: ausencia de NEG POS NEG - NO SE DETECTA g.2) SmartCycler (Cepheid ) NEG NEG NEG - NO VALORABLE g) Ejemplo de resultado g.1) CFX96 (Bio-Rad) Gráfica 1 (Canal FAM: blaimp): Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos, un control positivo blaimp y un control positivo blandm-1. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control negativo (A10 en gris): ausencia de señal. Control positivo blaimp (A11 en naranja): se observa señal con Ct=30,43. Control positivo blandm-1 (A12 en verde): ausencia de señal. Gráfica 1 (Canal FAM: blaimp): Resultado obtenido al amplificar un Gráfica 2 (Canal HEX: CHIC): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo: se observa señal de amplificación. Control positivo: se observa señal de amplificación. Gráfica 2 (Canal Alx532: CHIC): Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos, un control positivo blaimp y un control positivo blandm-1. Control negativo (A9 en azul): se observa señal con Ct=31,08. Control negativo (A10 en gris): se observa señal con Ct=30,25. Control positivo blaimp (A11 en naranja): se observa señal con Ct=30,38. Control positivo blandm-1 (A12 en verde): se observa señal con Ct=30,35. 7 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 8
5 Gráfica 3 (Canal TxR: blandm-1): Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos, un control positivo blaimp y un control positivo blandm. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control negativo (A10 en gris): ausencia de señal. Control positivo blaimp (A11 en naranja): ausencia de señal. Control positivo blandm-1 (A12 en verde): se observa señal con Ct=30,43. g.3) ABI 7500 (Life Technologies TM ) Gráfica 3 (Target 3: blandm-1): Resultado obtenido al amplificar un Procedimiento OCTVIK b) Protocolo Cada muestra debe ser analizada simultáneamente con las dos AmpliMixes (PACISA y OCTVIK). La AmpliMix OCTVIK no puede utilizarse individualmente, dado que no incluye CHIC. Programar el protocolo de amplificación OCTVIK de acuerdo con las siguientes especificaciones: Tiempo Temperatura Ciclos Fluorescencia 15:00 95 C 1 OFF 0:15 95 C OFF 0:30 60 C 45 ON 0:30 72 C OFF Gráfica 1 (Target 1: blaimp): Resultado obtenido al amplificar un Selección de fluoróforos: - FAM: detecta el gen blaoxa. - Alx532/HEX: detecta el gen blactx-m. - TxR: detecta el gen blavim. - Alx647/Cy5: detecta el gen blakpc. c) Preparación de la reacción c.1) Equipos que requieren un volumen de reacción de 20 µl (ej.: CFX96 de Bio-Rad). Gráfica 2 (Target 2: CHIC): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo: se observa señal de amplificación. Control positivo: se observa señal de amplificación. - Descongelar la AmpliMix OCTVIK y el Control Positivo ADN OCTVIK. Utilizar como control negativo ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución de ADN (no proporcionados). - Preparar los tubos de amplificación necesarios para muestras y controles. - Pipetear 14 μl de AmpliMix en cada tubo de amplificación. - Añadir 6 μl del ADN de cada muestra o control a cada tubo. - Colocar los tubos en el equipo. - File > New > Plate > Unknown > Seleccionar los fluoróforos (FAM, HEX, TxR y Cy5) > OK > Save. - Seleccionar el protocolo OCTVIK. - Iniciar el programa de amplificación: Start Run > Close lid > Start Run. 9 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 10
6 c.2) Equipos que requieren un volumen de reacción de 25 µl (ej.: SmartCycler de Cepheid ). - Descongelar la AmpliMix OCTVIK y el Control Positivo ADN OCTVIK. Utilizar como control negativo ADN de muestras negativas, agua o tampón de elución de ADN (no proporcionados). - Preparar los tubos de amplificación necesarios para muestras y controles. - Pipetear 17,5 μl de AmpliMix en cada tubo de amplificación. - Añadir 7,5 μl del ADN de cada muestra o control a cada tubo. - Colocar los tubos en el equipo. - Seleccionar el protocolo OCTVIK. - Iniciar el programa de amplificación. d) Ajustar el umbral de fluorescencia d.1) CFX96 de Bio-Rad Ajustar el umbral de fluorescencia para cada canal: - Deseleccionar Automatic Threshold. - Indicar Threshold Target a Target: Target 1 (blaoxa): Target 2 (blactx-m): Target 3 (blavim): Target 4 (blakpc): Hacer click en Save Changes. - Hacer click en Apply Analysis Settings. e) Interpretación del resultado de los controles - Resultados válidos de los controles Control Canales Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 TxR Alx647 Interpr. - FAM: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. - HEX: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. - TxR: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. - Cy5: Settings > Baseline Threshold > User defined > 250 > OK. POS POS POS POS POS VÁLIDO NEG NEG NEG NEG NEG VÁLIDO d.2) SmartCycler de Cepheid - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > Dado que la AmpliMix OCTVIK no incluye CHIC, considerar el valor de CHIC de la AmpliMix IMND. d.3) ABI 7500 de Life Technologies - Select the dye to use as passive reference > None. - En la ventana de Analysis hacer click en Analysis Settings. - Resultados inválidos de los controles En el caso de obtener en algún canal del Control Positivo un resultado negativo se considera que ese control es inválido. Los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). En el caso de obtener en algún canal del control negativo un valor de Ct > 0, los resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no valorables). - En la ventana que aparece hacer click en Edit Default Settings. 11 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 12
7 f) Interpretación de los resultados de las muestras Interpretar el resultado obtenido en cada muestra o control según la combinación de señales indicada en la siguiente tabla: g) Ejemplo de resultado g.1) CFX96 (Bio-Rad) Canales Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 Interpretación FAM Alx532 TxR Alx647 POS NEG NEG NEG blaoxa NEG POS NEG NEG blactx-m NEG NEG POS NEG NEG NEG NEG POS POS POS NEG NEG blavim blakpc blaoxa y blactx-m Gráfica 1 (Canal FAM: blaoxa-48): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo: ausencia de POS NEG POS NEG POS NEG NEG POS NEG POS POS NEG NEG POS NEG POS NEG NEG POS POS POS POS POS NEG POS POS NEG POS POS NEG POS POS NEG POS POS POS POS POS POS POS blaoxa y blavim blaoxa y blakpc blactx-m y blavim blactx-m y blakpc blavim y blakpc blaoxa, blactx-m y blavim blaoxa, blactx-m y blakpc blaoxa, blavim y blakpc blactx-m, blavim y blakpc blaoxa, blactx-m, blavim y blakpc Gráfica 2 (Canal HEX: blactx-m): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo: ausencia de NEG NEG NEG NEG NO SE DETECTA Gráfica 3 (Canal TxR: blavim): Resultado obtenido al amplificar un 13 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v.2 14
8 Gráfica 4 (Canal Cy5: blakpc): Resultado obtenido al amplificar un Gráfica 3 (Canal TxR: blavim): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control positivo (A10 en gris): se observa señal con Ct=29,88. g.2) SmartCycler (Cepheid ) Gráfica 1 (Canal FAM: blaoxa-48): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control positivo (A10 en gris): se observa señal con Ct=31,99. Gráfica 4 (Canal Alx647: blakpc): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control positivo (A10 en gris): se observa señal con Ct=31,34. g.3) ABI 7500 (Life Technologies ) Gráfica 2 (Canal Alx532: blactx-m): Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo. Control negativo (A9 en azul): ausencia de señal. Control positivo (A10 en gris): se observa señal con Ct=23,80. Gráfica 1 (Target 1: blaoxa-48): Resultado obtenido al amplificar un 15 7 RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v
9 10 Control de calidad Cada lote del kit RealCycler INOCVK-U / INOCVK-G ha sido testado según las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler (Cepheid ). 11 Observaciones a) Tabla de compatibilidad de fluoróforos Gráfica 2 (Target 2: blactx-m): Resultado obtenido al amplificar un Fluoróforo utilizado Emisión (nm) FAM 519 HEX 556 Texas Red 610 ATTO 647N 669 Fluoróforos alternativos JOE, VIC, CAL Fluor Orange 560, Alexa 532 ROX, LC Red 610, CAL Fluor Red 610 Cy5, Alexa 647, LC Red 670, Quasar 670, Oyster 645 b) Señales lineales Gráfica 3 (Target 3: blavim): Resultado obtenido al amplificar un En algunos casos pueden aparecer señales lineales en el equipo CFX96 de Bio-Rad. Las curvas lineales son resultados no valorables que deben descartarse. Fecha de publicación: Septiembre, Gráfica 4 (Target 4: blakpc): Resultado obtenido al amplificar un Progenie Molecular Edificio Progenie. Valle de la Ballestera Spain T: F: RealCycler INOCVK-U INOCVK-G v
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