SÍNDROME DE MARCHITAMIENTO DE LAS OREJAS DE MAR (INFECCIÓN POR XENOHALIOTIS CALIFORNIENSIS)

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1 CAPÍTULO SÍNDROME DE MARCHITAMIENTO DE LAS OREJAS DE MAR (INFECCIÓN POR XENOHALIOTIS CALIFORNIENSIS) 1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD La infección por Xenohaliotis californiensis causa una enfermedad (llamada síndrome de marchitamiento [ref. 11]) de la oreja de mar o abulón, Haliotis spp. (Arqueogasterópodos: moluscos [refs. 11, 13, 16, 17, 19, 20]) tanto en estado silvestre como cultivado. Aunque se ha demostrado que todas las fases postlarvarias son susceptibles a la infección por X. californiensis, la enfermedad clínica se observa típicamente en animales de edad superior a los 1 2 años. Los signos de la enfermedad incluyen atrofia del pie, glándula digestiva moteada, anorexia, debilidad y letargia. La enfermedad se caracteriza por inclusiones bacterianas intracitoplásmicas en el esófago posterior, en el intestino y en el epitelio de absorción y transporte de la glándula digestiva; las infecciones moderadas y graves se asocian con cambios degenerativos o metaplásicos de la glándula digestiva seguidos por atrofia del músculo del pie. La enfermedad clínica solo se ha observado en individuos infectados que están expuestos a temperaturas elevadas en el agua de mar (~18 C). Las pérdidas resultantes pueden suponer el 99% de la población y varían dependiendo de la temperatura del agua de mar y de la especie del hospedador. En la sección 5 de este capítulo se resumen criterios de diagnóstico confirmativo. 2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA a) Factores del agente Xenohaliotis californiensis es una bacteria intracelular de la familia Rickettsiaceae y está estrechamente relacionada con miembros de los géneros Ehrlichia, Anaplasma y Cowdria (5 7). La enfermedad causada por esta bacteria se conoce como síndrome fulminante (6) y puede designarse más apropiadamente como rickettsiosis del abulón. No existe información sobre la presencia de especies distintas de esta bacteria. La bacteria es dimórfica, de forma bacilar a esférica, y mide una media de nm en la forma bacilar y una media de 1405 nm en el morfotipo esférico. La bacteria se reproduce dentro de vacuolas intracitoplasmáticas de µm de diámetro en el epitelio gastrointestinal (10). Aunque se considera a X. californiensis como un organismo intracelular obligado, la bacteria puede sobrevivir fuera del hospedador por un tiempo indeterminado como se evidencia en estudios sobre su transmisión por el agua (3, 4). Comparando con la susceptibilidad de Escherichia coli a la lejía (0,09 ppm; 18), esta bacteria se inactiva rápidamente por inmersión en <10% de lejía. Además, el yodo al 1% en agua (por ejemplo, Prepodyne) durante 1 hora parece un desinfectante eficaz a la vista del uso de estos métodos de desinfección en un laboratorio marino con flujo de agua de mar y la ausencia de detección de este patógeno en poblaciones adyacentes de abulón (7, Friedman, obs. pers.). La bacteria se divide por fisión binaria (5) y la transmisión es directa y horizontal (3, 4, 6, 15). Aunque en el abulón cultivado no suele observarse la enfermedad hasta que alcanza el estado de crecimiento del tamaño del mercado (>2,5 cm de tamaño), un examen de ejemplares de abulón de 6 semanas de edad expuestos al agente mostró, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que pueden infectarse ejemplares de 1 2 mm de tamaño (Moore et al., observaciones no publicadas) b) Factores del hospedador Xenohaliotis californiensis infecta en instalaciones naturales y en cultivo a miembros del género Haliotis incluyendo el abulón negro (H. cracherodii), el abulón blanco (H. sorenseni), el abulón colorado (H. rufescens), el abulón amarillo (H. corrugata), y el abulón verde (H. fulgens), así como el 370 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

2 abulón plano (H. wallalensis) y el abulón japonés (H. discus-hannai) en ensayos de laboratorio (Friedman, observaciones no publicadas). No se han probado otras especies de abulón. Aunque se ha demostrado que todas las fases post-larvarias son susceptibles a la infección por X. californiensis, la enfermedad clínica se observa típicamente en animales más de 1 año de edad entre los abulones cultivados (Friedman, observaciones no publicadas) y en los abulones de todos los tamaños en las poblaciones silvestres analizadas hasta la fecha (por ejemplo, 3, 4, 8, 11, 20). La probabilidad de detección aumenta con el tamaño del abulón. Los animales menores de 10 mm tienen una probabilidad reducida de detección mediante histología, pero igual probabilidad de detección usando PCR. Xenohaliotis californiensis infecta las células epiteliales gastrointestinales del esófago posterior, la glándula digestiva y, en menor medida, el intestino. Las infecciones pueden persistir por mucho tiempo sin que se desarrolle la enfermedad clínica cuando el hospedador se mantiene en aguas de temperatura baja (por ejemplo, 15 C para el abulón rojo); la exposición en agua de mar a temperaturas superiores (por ejemplo, >17 C para el abulón rojo, negro y blanco) normalmente ocasiona la enfermedad clínica (7, 14). Pese a que no se han identificado hospedadores alternativos fuera del género, se ha sugerido que algunas ascidias coloniales pueden concentrar la bacteria (basándose en evidencias por PCR); por tanto, existe la posibilidad de que tales especies actúen como un vector de la bacteria, pero está justificada más investigación sobre posibles vectores (J.D. Moore, observaciones no publicadas). La enfermedad (el síndrome fulminante) ocurre a temperaturas elevadas del agua (~18 C y superiores) en abulones con infecciones moderadas y graves (5, 6, 14). El período de incubación del síndrome fulminante es prolongado y varía entre 3 y 7 meses (3, 4, 6, 8, 14, 15). La enfermedad clínica se caracteriza por cambios morfológicos en la glándula digestiva, que varía entre las especies y puede presentar degeneración (atrofia de túbulos, aumento en el tejido conectivo e inflamación) y/o metaplasia de los túbulos digestivos. La metaplasia supone el reemplazamiento de los fondos de saco terminales secretores/absorbentes (acini) por conductos de absorción/transporte de apariencia similar al esófago posterior. Estos cambios morfológicos se acompañan de anorexia, y consumo de las reservas de glucógeno seguido de uso del músculo del pie como fuente de energía, y la muerte (3, 4, 8, 10, 12, 14, 15). El pie de los abulones afectados contiene escasos haces musculares y menos organizados, un abundante tejido conectivo y más células serosas que los individuos no afectados (10, 14, 20). Los abulones supervivientes parecen quedar infectados, incluso en ambientes de baja temperatura del agua, como en el norte de California (7). c) Patrón de la enfermedad La transmisión de X. californiensis es horizontal y se supone que a través de la ruta oral-fecal. Especie Prevalencia por PCR Silvestre Cultivad o Prevalencia por histología Silvestre Cultivado Referencias Haliotis rufescens N.D % 1 75% % 2 7, 14, Friedman, observ. no publicadas. Haliotis cracherodii N.D. N.A % N.A. 7 Haliotis sorenseni % % Moore et al. observ. no publicadas, Friedman et al. observ. no publicadas. Haliotis fulgens N.D. N.D % N.D. 19 Haliotis corrugata N.D. N.D % N.D. 19 Haliotis walallensis N.A. N.A. 0 N.A. J.D. Moore, observ. no publicadas. Haliotis discus-hannai N.D C.S. Friedman, observ. no publicadas. 1 Se han observado prevalencias del 1 17% en el norte de California y hasta del 75% en el sur y centro de California. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

3 2 Los abulones mayores suelen tener una mayor prevalencia de infección. ND = no hay datos; NA = no aplicable. Xenohaliotis californiensis ocurre a lo largo de la costa del suroeste de Norteamérica en California, EE.UU. y en Baja California, México. Sin embargo, como se han transportado abulones infectados a Chile, Japón, Israel, Islandia y posiblemente a otros países, se sospecha que el área geográfica del agente etiológico se ha extendido donde se cultiva el abulón rojo de California, Haliotis rufescens. La susceptibilidad varía según la especie; se sabe que la bacteria causa la muerte del abulón negro (hasta 99% de mortalidad; 16), blanco (hasta 100% de mortalidad; Friedman & McCormick, observaciones no publicadas), rojo (hasta 35% de mortalidad; 14, 15), rosado (también llamado amarillo) y verde (también llamado azul) (20). A diferencia de otras especies de abulón estudiadas hasta la fecha, la magnitud de la mortalidad en los abulones rosados y verdes no está bien documentada. Sin embargo, en Baja California, México, pueden estar infectados hasta el 100% del abulón verde (azul) y el 63% del abulón rosado (amarillo), con hasta el 43% del abulón verde y el 71% del rosado con signos microscópicos de enfermedad (glándula digestiva degenerada o metaplásica; 19). El período de incubación varía con la temperatura pero por lo general supone un período prolongado de 3 7-meses. Típicamente, la mortalidad aparece entre meses después del inicio de los síntomas clínicos visibles (8). Las infecciones por Xenohaliotis californiensis ocasionan un grave impacto en la acuicultura del abulón en la costa oeste de Norteamérica y en otras zonas donde se encuentra. La reducción de beneficios se ha acompañado del cierre de instalaciones y ha contribuido al fin de las industrias comerciales del abulón en California. Dos instalaciones en California declararon pérdidas superiores a 1,5 millones de dólares estadounidenses a causa de esta enfermedad. Los episodios recurrentes de enfermedad también son causa del fracaso de la repoblación de los hábitats históricos por abulones silvestres. d) Control y prevención El patógeno y la enfermedad (síndrome fulminante) pueden ocurrir todo el año, pero las pérdidas debidas a la enfermedad en el abulón rojo cultivado ocurren con más frecuencia en el verano y el otoño, después de un período de 3 4-meses en que la temperatura es elevada (~18 C o superior). La reducción de la densidad de población y la aplicación de una dieta medicada con oxitetraciclina pueden reducir las pérdidas (9). La administración oral de 12 19% TM-100 en una dieta medicada durante 10 o 20 días suministra protección contra la reinfección bacteriana durante varios meses. Datos recientes sugieren que la administración oral de 12% TM-100 un solo día puede reducir las infecciones bacterianas de un 80% a un 10% de prevalencia y la intensidad media de la infección de 1,4 a 0,1 en una escala de 0 3 (5). El interés en seleccionar abulones resistentes está aumentando, particularmente con vistas a la restauración. El abulón negro silvestre se está recogiendo por las Channel Islands de California y algunas muestras sobreviven, lo que sugiere que estos individuos pueden ser más resistentes a esta enfermedad producida por la rickettsia (Van Blaricom, obs. pers.). Las prácticas de manejo para reducir los problemas causados por X. californiensis son las típicas de cualquier enfermedad bacteriana e incluyen la compra de ejemplares de siembra inspeccionados (carentes de evidencia de infección), el mantenimiento por separado de familias o grupos (es decir, evitar mezclar grupos distintos), el lavado de las manos y el equipo con agua fresca o yodada y el secado entre los usos. Si es posible, se recomienda el aislamiento de los grupos infectados. Cuando se emplee tratamiento con oxitetraciclina, la aplicación terapéutica bajo las directrices federales (esto es, las de la FDA-CVM 1 en EE.UU.) antes de una estación de agua caliente puede reducir las pérdidas y la infección. Por lo general, solo se necesita una única aplicación durante el segundo o tercer año de crecimiento durante un ciclo típico de cultivo de 3 4 años. 1 United States Food and Drug Administration Center for Veterinary Medicine 372 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

4 3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO a) Métodos de diagnóstico de campo Los abulones con infecciones por X. californiensis pueden estar subclínicamente infectados durante el período anterior a que la enfermedad se haga patente o a temperaturas del agua 15 C o gravemente consumidos (atrofiados) bajo condiciones de temperatura permisiva. Durante una epidemia, los abulones se cuelgan con frecuencia de substratos horizontales (en vez de en verticales o invertidos) y parecen débiles (fácilmente separados del substrato con la mano) y atrofiados (marchitos) (11). Los abulones cultivados también estarán anoréxicos. Además, la presencia de un número anormalmente alto de conchas nuevas también puede indicar enfermedad. Si se encuentran abulones moribundos, la observación de las glándulas digestivas moteadas (tejido marrón oscuro con focos pequeños de color bronce), que son indicativas de cambios metaplásicos, constituye una evidencia presuntiva adicional de esta enfermedad. b) Métodos clínicos La caracterización clínica de la enfermedad producida por X. californiensis depende de una combinación de cambios morfológicos de los tejidos junto con la presencia del agente. Los cambios morfológicos incluyen un músculo del pie atrofiado que es visible a nivel macro y microscópico (histología). Los individuos afectados contienen menos glucógeno en el pie y menos haces musculares que los no afectados (3, 4, 10). Como resultado directo del catabolismo del pie, los abulones infectados excretan niveles de amoníaco muchos mayores que los no afectados (12). En algunos abulones, se puede observar un aumento de las células serosas en el músculo del pie (20). Estas lesiones no son patognomónicas de esta enfermedad. Sin embargo, los cambios metaplásicos de la glándula digestiva que incluyen la transformación de los fondos terminales secretores (acinos) en epitelios de absorción/transporte se amplifican en los abulones infectados por X. californiensis (3, 4, 6, 14, 15). Aunque se ha observado metaplasia en todas las especies examinadas hasta la fecha, la respuesta a la infección puede variar entre hospedadores. El abulón rojo y el blanco, por ejemplo, responden típicamente con un cambio metaplásico (3, 4, 14), mientras que abulón negro generalmente responde con una combinación de metaplasia, degeneración de túbulos digestivos e inflamación (6, 8). c) Detección del agente y métodos de identificación Métodos de detección directa i) Métodos microscópicos Examen citológico: frotis tisulares Los frotis de tejidos pueden usarse para detectar infecciones por X. californiensis de intensidad moderada a alta. Sin embargo, la histología es más sensible que los frotis tisulares. a) Método de tinción: se realiza un corte del esófago posterior y se coloca en un porta. Se fija el frotis con metanol y se tiñe con Giemsa modificado (por ejemplo, Hemacolor [Merck] o Diff Quik [Dade Behring]). Se seca y se observa con aceite de inmersión para ver inclusiones de rickettsias o se tapa con un cubre y se examina a aumentos. b) Método de fluorescencia: se realiza un corte del esófago posterior, se trocea y se deposita en un porta, secando con un secador de pelo durante ~20 minutos. Se tiñen los portas con un colorante fluorescente para ácidos nucleicos como el yoduro de propidio o el Hoechst (13). Se incuba en la oscuridad durante 3 minutos y se observa por epifluorescencia a 200 aumentos. Las inclusiones bacterianas se diferencian de los núcleos del hospedador por el tamaño y la Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

5 frecuencia. Sin embargo, si se quieren guardar los portas con muestra para un examen posterior, se deben secar cuidadosamente y mantenerse desecados hasta la tinción. Las inclusiones del parásito, de µm de diámetro, aparecen entremezcladas con los núcleos más pequeños del hospedador. Un tiempo de observación de 5 minutos por porta es suficiente a 200 aumentos (13). Este método es menos sensible que el histológico y no permite diferenciar la morfología bacteriana. Se emplea más bien como un método de examen rápido en el rango conocido de esta enfermedad. Esta prueba no está comercialmente disponible. Histología El procedimiento histológico se detalla en el capítulo I.2 de este Manual de animales acuáticos. Se elimina la concha y se realizan varios cortes transversales de 3 5 mm que contengan la parte posterior del esófago (post-esófago), la glándula digestiva, y el músculo del pie, y se colocan durante 24 horas en solución de Davidson o de Carson (véase el capítulo I.2 de este Manual de animales acuáticos); después se procesan para histología rutinaria con inclusión en parafina. Los cortes finos se manejan mejor cuando se colocan en casetes antes de la fijación. La relación debe ser menor de un volumen de tejido por cada diez volúmenes de fijador. Los cortes de 3 5 µm desparafinados se tiñen con hematoxilina y eosina y se ven por microscopía óptica para detectar inclusiones bacterianas (oblongas, basófilas, en vacuolas intracitoplásmicas de µm de diámetro [5]) en el post-esófago y en la glándula digestiva, y cambios morfológicos en la glándula digestiva y en el pie. Se recomienda examinar los cortes a aumentos. Xenohaliotis californiensis puede ser morfológicamente similar a otras bacterias marinas de tipo rickettsia. El diagnóstico definitivo de la bacteria puede incluir técnicas moleculares (como hibridación in-situ). El diagnóstico definitivo del síntoma fulminante mediante histología debe comprender la presencia de la bacteria y los cambios morfológicos de la glándula digestiva, metaplasia y/o degeneración, y aquellos relativos al músculo del pie. Cuando se observan pérdidas dentro de un área geográfica conocida con síndrome fulminante, debe tenerse en cuenta que la visualización por examen histológico de focos bacterianos intracelulares en el epitelio digestivo puede considerarse un método confirmativo y es la prueba de referencia para esta enfermedad. No obstante, se recomienda la confirmación mediante histología junto con PCR y análisis de secuencia o hibridación in-situ para verificar la identidad de la rickettsia en la especie de abulón, si previamente no se conoce que tal especie es susceptible a la bacteria, o se trata de una nueva localización geográfica. Esta prueba no está disponible comercialmente. Examen por microscopía electrónica de transmisión En el capítulo I.2 de este Manual de animales acuáticos se describen procedimientos para microscopía electrónica de transmisión. En el citoplasma de las células epiteliales gastrointestinales, se observan procariotas bacilares con muchos ribosomas y paredes celulares trilaminares acumuladas en colonias intracelulares dentro de vacuolas limitadas por una membrana. La bacteria dimórfica bacilar y esférica mide aproximadamente nm en su forma bacilar y una media de 1405 nm en el morfotipo esférico. La bacteria se reproduce dentro de vacuolas citoplásmicas de µm de diámetro (5). Esta prueba no está disponible comercialmente. 374 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

6 ii) Aislamiento e identificación del agente Reacción en cadena de la polimerasa Una amplificación positiva por PCR es solo un diagnóstico presuntivo porque detecta ADN y no necesariamente un patógeno viable. Deben emplearse otras técnicas para visualizar al patógeno, preferentemente histología e hibridación in-situ. Cuando se usa conjuntamente con la histología, la PCR es confirmativa. El examen de la secuencia amplificada es recomendable cuando se trata de una nueva especie de hospedador o un área geográfica nueva. Las secuencias deben coincidir con la secuencia conocida del radn de esta bacteria (acceso en GenBank, AF133090; ref. 1). Las muestras para PCR deben ser cortadas del post-esófago o de la glándula digestiva y deben procesarse según el método clásico de extracción con fenol-cloroformo o con el kit comercial Qiagen QIAmp Dna mini-stool (debido a la presencia de inhibidores de PCR en la glándula digestiva del abulón). Se recomienda el tejido post-esofágico porque las infecciones son siempre más intensas que en la glándula digestiva. Siempre debe incluirse un control positivo de la reacción en la PCR y debe consistir en un ADN genómico extraído de un individuo que se conoce que está infectado o en la utilización de un plásmido que contenga una inserción del producto amplificado. Si se usa un plásmido como control positivo, se recomienda añadir un inserto de ~100 pb al inserto clonado para evitar preocupaciones de contaminación por ADN de plásmidos en el aire. También hay que incluir en cada PCR un control negativo que contenga la mezcla maestra sin la adición del molde o templado. Todas las reacciones se realizan por duplicado. La observación de una banda de 160 pb en las muestras de tejido y en el control positivo, así como la inexistencia de esa banda en los controles negativos de la reacción, caracterizan a una prueba positiva bien realizada. La sensibilidad y especificidad de este proceso están siendo formalmente determinadas (Moore & Friedman, datos no publicados). Estas pruebas no están actualmente disponibles en forma comercial. Los cebadores para PCR desarrollados para detectar X. californiensis amplifican específicamente un segmento de 160 pb del patógeno que se parece a Rickettsia. Los cebadores se designan en la actualidad como: RA 5-1 (5 -GTT-GAA-CGT-GCC-TTC- AGT-TTA-C-3 ) y RA 3-6 (5 -ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3 ). Complementan el ADN de la subunidad menor del ribosoma y son sensibles y específicos para este patógeno (1). La amplificación por PCR se realiza en un volumen de reacción estándar de 25 µl que contiene 1 tampón de PCR, 1,5 mm de MgCl 2, 400 ng/ml BSA, 200 µm de dntps, 0,5 mm de cada cebador, 0,8 unidades de polimerasa Taq, y 100 ng de ADN molde o templado. Las mezclas de reacción se someten a un termociclador. El programa para la reacción de amplificación es: desnaturalización inicial a 95 C durante 5 minutos, 40 ciclos a 95 C durante 1 minuto, 62 C durante 30 segundos, y 72 C durante 30 segundos, con una extensión final a 72 C durante 10 minutos. De cada reacción de PCR se toma una alícuota para comprobar el producto de amplificación de 160 pares de bases, mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Esta prueba no está disponible en el mercado. Hibridación in-situ La hibridación in-situ es el método de elección para confirmar la identificación porque permite visualizar una sonda específica que hibrida con la diana del organismo. Las sondas de ADN deben ser cuidadosamente probadas en cuanto a especificidad y validadas mediante estudios comparativos antes de que puedan ser usadas para la identificación confirmativa. La hibridación in-situ se ha desarrollado recientemente para detectar procariotas del tipo de las Rickettsiales en cortes de tejidos (2). Las sondas oligonucleotídicas marcadas específicamente hibridan con el ARN de la subunidad menor del ribosoma de la Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

7 bacteria. Esta hibridación se detecta por un anticuerpo conjugado que reconoce las sondas marcadas. Se añade un substrato para el anticuerpo conjugado, generando una reacción colorimétrica que posibilita visualizar las hibridaciones entre las sondas y el ADN del parásito. Aunque este método no ha sido validado formalmente, las pruebas de especificidad realizadas con varios organismos tipo rickettsia de bivalvos y de peces sugieren que esta prueba es específica para X. californiensis (2). El procedimiento de la hibridación in-situ se lleva a cabo del siguiente modo. Se deben incluir en el proceso controles positivos (tejidos infectados comprobados) y negativos (no infectados o infectados por una bacteria diferente). i) Después de retirar la concha, se realiza un corte transversal (3 5 mm) que contenga la parte posterior del esófago (post-esófago), la glándula digestiva, y el músculo del pie, y se coloca horas en fijador AFA de Davidson (glicerina [10%], formalina [20%], etanol al 95% [30%], H 2 O destilada [30%], ácido acético glacial [10%]); luego se transfiere a etanol al 70% hasta que se procese por procedimientos histológicos (paso ii). La relación no debe superar 1 volumen de tejido por cada 10 volúmenes de fijador. ii) A continuación las muestras se incluyen en parafina mediante procedimientos histológicos convencionales. Se preparan cortes de 5 6 µm y se colocan en portas cargados positivamente o en portas recubiertos de 3-aminopropil-trietoxilano. Los cortes histológicos se secan después en una estufa a 40 C durante toda la noche. iii) Los cortes se desparafinan durante 10 minutos por inmersión en xileno u otro agente similar menos tóxico. El solvente se elimina por inmersión en dos baños sucesivos de etanol absoluto durante 10 minutos en cada caso, y se procede a la rehidratación por inmersión en una serie gradual de etanol. Luego, los cortes se lavan dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos. iv) Los cortes se tratan con proteinasa K, 50 µg/ml en PBS, a 37 C durante 15 minutos. La reacción se detiene después lavando los cortes en PBS con 0,2% de glicina durante 5 minutos. Se colocan luego los cortes en 2 SSC (citrato salino estándar) durante 10 minutos. v) Los cortes se prehibridan durante 1 hora a 42 C en tampón de prehibridación (4 SSC, 50% formamida, 5 solución de Denhardt, 0,5 mg/ml tarn de levadura, y 0,5 mg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado por calor). vi) A continuación la solución de prehibridación se reemplaza por tampón de prehibridación que contiene 2 ng/µl de las sondas oligonucleótidicas marcadas con digoxigenina. Las secuencias de las sondas llamadas RA 5-1, RA 3-6, RA 3-8 y RA 5-6 (2) son, respectivamente: 5 -GTT-GAA-CGT-GCC-TTC-AGT-TTA-C-3, 5 - ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3, 5 -CCA-CTG-TGA-GTG-GTT- ATC-TCC-TG-3, y 5 -GAA-GCA-ATA-TTG-TGA-GAT-AAA-GCA-3. Los cortes se cubren con cubres de plástico para hibridación in-situ y se colocan en un bloque de calor a 90 C durante 12 minutos. Los portas se enfrían luego en hielo durante 1 minuto antes de hibridar durante toda la noche a 40 C en una cámara húmeda. vii) Se lavan los cortes durante 5 minutos en 2 SSC a temperatura ambiente, dos veces durante 5 minutos en 1 SSC a temperatura ambiente, y dos veces durante 10 minutos en 0,5 SSC a 40 C. Luego se colocan los cortes en Tampón 1 (100 mm Tris, ph 7.5, 150 mm NaCl) durante 1 2 minutos. viii) Los cortes se colocan en Tampón 1 (véase paso vii) suplementado con 0,3% de Tritón X-100 y 2% de suero ovino durante 30 minutos. El anticuerpo antidigoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina se diluye 1/500 (o según las recomendaciones del fabricante) en Tampón 1 suplementado con 0,3% de Tritón X-100 y 1% de suero ovino y se aplica a los cortes de los tejidos. Los cortes se 376 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

8 cubren con cubres para hibridación in-situ y se incuban durante 3 horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda. ix) Los portas se lavan dos veces en Tampón 1 durante 5 minutos cada vez (véase paso vii) y dos veces en Tampón 2 (100 mm Tris, ph 9,5, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2 ) durante 5 minutos cada vez. Después se colocan los portas en solución para el desarrollo del color (337,5 µg/ml de nitroazul de tetrazolio, 175 µg/ml de sal 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato p-toluidina, 240 µg/ml de levamisol en Tampón 2) durante 2 horas en la oscuridad. La reacción de color se detiene lavando en tampón TE (10 mm de Tris, ph 8,0, 1 mm de EDTA [ácido etiléndiamino tetraacético]). x) Después los portas se lavan en H 2 O destilada. Los cortes se tiñen para contraste con marrón Bismarck Y, se lavan en H 2 O destilada y se aplican cubres con un medio de montaje acuoso. La presencia del patógeno se demuestra por el marcaje morado oscuro de las células del parásito. Esta prueba no está disponible en el mercado. Métodos indirectos de detección Métodos serológicos: no son aplicables. 4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN LA FINALIDAD Los métodos actualmente disponibles para la vigilancia, detección y diagnosis de X. californiensis se presentan en el cuadro 1. Las designaciones que aparecen en el cuadro indican: A= el método es recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, especificidad y sensibilidad diagnóstica; B= el método es un método estándar con buena sensibilidad y especificidad de diagnóstico; C= el método tiene aplicación en algunas situaciones, pero su coste, exactitud y otros factores limitan notablemente su aplicación; y D= el método no se recomienda actualmente para este propósito. Estas designaciones son algo subjetivas ya que la adecuación incluyen aspectos de seguridad, sensibilidad, especificidad y utilidad. Aunque no todas las pruebas asignadas a la categoría A o B han pasado por una estandarización y validación formales, su naturaleza rutinaria y el hecho de que se han usado ampliamente sin resultados dudosos, las hace aceptables. Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico para Xenohaliotis californiensis Método Vigilancia Larvas Juveniles Adultos Presuntivo Confirmativo Síntomas manifiestos D C C C D Bioensayo D D C C C(A) 1 Frotis tisular-tinción Giemsa D C C B B(A) 2 Histopatología D B B A A 3 MET D D D B C Sondas de ADN in situ D C C A A PCR D A A A C(A) 4 Secuenciación de SSU radn D D D A A 1 En el caso de existencias valiosas, es posible usar la PCR en las heces como primer análisis y, si es negativo, usar después el método de bioensayo junto con histología (véase la sección 6). 2 Para confirmar el agente se deben usar frotis tisulares junto con la PCR y posiblemente secuenciación. 3 En casos nuevos, como el de una nueva localización geográfica, se recomienda la PCR y la secuenciación para confirmar la identidad de la bacteria. 4 La PCR aislada no es confirmativa pero en combinación con la histología, puede considerarse confirmativa. MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; SSU radn = ADN de la subunidad menor del ribosoma. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

9 5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO De acuerdo con el Código de animales acuáticos, cualquier caso en otra especie debe ser comunicado inmediatamente a un laboratorio de referencia de la OIE apropiado para su confirmación, independientemente de que se presenten o no síntomas clínicos asociados. a) Definición de un caso sospechoso Un caso sospechoso de infección por X. californiensis y de enfermedad clínica asociada (síndrome fulminante) puede incluir la observación de síntomas clínicos evidentes (debilidad, letargia, anorexia, atrofia del pie, glándula digestiva moteada) y mortalidad asociada a condiciones de agua caliente, particularmente dentro de la zona geográfica conocida de existencia de la enfermedad. En los abulones cultivados, la anorexia puede ser el primer signo de enfermedad. Estos síntomas clínicos, junto con observaciones microscópicas del músculo atrofiado del pie, los cuerpos de inclusión en el epitelio gastrointestinal o evidencia por PCR también representan un caso sospechoso. b) Definición de un caso confirmado La confirmación de una infección por X. californiensis se basa en la observación del agente mediante histología y/o hibridación in-situ. Los síntomas manifiestos y los frotis de tejido no pueden usarse solos para el diagnóstico confirmativo y deben ser apoyados por pruebas histológicas, hibridación in-situ o PCR. La confirmación del síndrome fulminante requiere tanto la presencia del agente como la presencia de lesiones microscópicas de la enfermedad. Como mínimo, la metaplasia de la glándula digestiva o la degeneración tienen que acompañar a la infección por X. californiensis para diagnosticar el síndrome fulminante a nivel clínico. 6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓN El método de vigilancia dirigido a declarar la ausencia de X. californiensis es la histología en combinación con la PCR. Dada la naturaleza crónica de la enfermedad y la influencia de la temperatura, se recomienda que los animales en el criadero y en el engorde se examinen durante la estación local de agua caliente. Los abulones mantenidos en aguas más frías pueden estar infectados crónicamente sin mostrar síntomas de enfermedad. También se recomienda usar un análisis de heces por PCR o un bioensayo de abulones pequeños (por ejemplo, 1 4 cm) mezclados con el resto de la producción durante al menos 6 semanas a >17 C. REFERENCIAS 1. ANDREE K.B., FRIEDMAN C.S., MOORE J.D. & HEDRICK R.P. (2000). A polymerase chain reaction for detection of genomic DNA of a Rickettsiales-like prokaryote associated with Withering Syndrome in Black Abalone (Haliotis cracherodii). J. Shellfish Res., 19, ANTONIO D.B., ANDREE K.B., MOORE J.D., FRIEDMAN C.S. & HEDRICK R.P. (2000). Detection of Rickettsiales-like prokaryotes (RLPs) by In situ hybridization in black abalone Haliotis cracherodii with Witheirng Syndrome. J. Invertebr. Pathol., 75, BRAID B.A. (2004). Biochemical and histologic changes in red abalone (Haliotis rufescens) subjected to eight different treatment combinations of exposure to the agent of withering syndrome, water temperature, and food availability. M.S. Thesis, University of California, Davis, 111pp. 4. BRAID B.A., MOORE J.D., ROBBINS T.T., HEDRICK R.P., TJEERDEMA R.S. & FRIEDMAN C.S. (2005). Health and survival of red abalone, Haliotis rufescens, under varying temperature, food supply and exposure to the agent of withering syndrome. J. Invertebr. Pathol. 89, Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

10 5. FRIEDMAN C.S., ANDREE K.B., BEAUCHAMP K.A., MOORE J.D., ROBBINS T.T., SHIELDS J.D. & HEDRICK R.P. (2000). Candidatus Xenohaliotis californiensis a newly described pathogen of abalone, Haliotis spp., along the west coast of North America. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 50, FRIEDMAN C.S., BIGGS W., SHIELDS J.D. & HEDRICK R.P. (2002). Transmission of Withering Syndrome in black abalone, Haliotis cracherodii Leach. J. Shellfish Res., 21 (2), FRIEDMAN C.S. & FINLEY C.A. (2003) Evidence for an anthropogenic introduction of Candidatus Xenohaliotis californiensis, the etiological agent of withering syndrome, into northern California abalone populations via conservation efforts. Can J. Fish Aquat Sci, 60, FRIEDMAN C.S., THOMSON M., CHUN C., HAAKER P.L. & HEDRICK, R.P. (1997). Withering syndrome of the black abalone, Haliotis cracherodii (Leach): Water temperature, food availability, and parasites as possible causes. J. Shellfish Res., 16, FRIEDMAN C.S., TREVELYAN G., MULDER E.P. & FIELDS R. (2003). Development of an oral administration of oxytetracycline to control losses due to withering syndrome in cultured red abalone Haliotis rufescens. Aquaculture, 224 (1 4), GARDNER G.R., HARSHBARGER J.C., LAKE J., SAWYER T.K., PRICE K.L., STEPHENSON M.D., HAAKER P.L. & TOGSTAD H.A. (1995). Association of prokaryotes with symptomatic appearance of withering syndrome in black abalone Haliotis craherodii. J. Invertebr. Pathol., 66, HAAKER P.L., PARKER D.O., TOGSTAD H., RICHARDS D.V., DAVIS G.E. & FRIEDMAN C.S. (1992). Mass mortality and withering syndrome in black abalone Haliotis cracherodii, in California. In: Abalone of the World, Shepard S.A., Tegner M.J. & Guzman del Proo S.A., eds, Blackwell Scientific, Oxford, UK, KISMOHANDAKA G., ROBERTS W., HEDRICK R.P. & FRIEDMAN C.S. (1995). Physiological alterations of the black abalone, Haliotis cracherodii Leach, with withering syndrome. J. Shellfish Res., 14 (1), MOORE J.D., CHERR G.N. & FRIEDMAN C.S. (2001). Detection of Candidatus Xenohaliotis californiensis (Rickettsiales-like procaryote) inclusions in tissue squashes of abalone (Haliotis spp.) gastrointestinal epithelium using a nucleic acid fluorochrome. Dis. Aquat. Org., 46, MOORE J.D., ROBBINS T.T. & FRIEDMAN C.S. (2000). Withering syndrome in farmed red abalone Haliotis rufescens: Thermal induction and association with a gastrointestinal rickettsia-like prokaryote. J. Aquat. Anim. Health, 12, MOORE J.D., ROBBINS T.T., HEDRICK R.P. & FRIEDMAN, C.S. (2001) Transmission of the Rickettsiales-like procaryote Candidatus Xenohaliotis californiensis and its role in withering syndrome of California abalone Haliotis spp. J. Shellfish Res., 20 (2), RAIMONDI P.T., WILSON C.M., AMBROSE R.F., ENGLE J.M. & MINCHINTON T.E. (2002). Continued declines of black abalone along the coast of California: Are mass mortalities related to El Nino events? Mar. Ecol. Prog. Ser., 242, STEINBECK J.R., GROFF J.M., FRIEDMAN C.S., MCDOWELL T. & HEDRICK R.P. (1992). Investigations into mortality among populations of the California black abalone, Haliotis cracherodii, on the central coast of California, USA. In: Abalone of the World, Shepard S.A., Tegner M.J. & Guzman del Proo S.A., eds. Blackwell Scientific, Oxford, UK, Taylor R.H., Falkinham J.O. III, Norton Ch.D. & LeChevalleir M.W. (2000). Chlorine, chloramines, chlorine dioxide and ozone susceptibility of Mycobacterium avium. Appl. Environ. Microbiol., 66 (4), TINAJERO M.D.C.A., CACERES-MARTINEZ J., & AVILES J.G.G. (2002) Histopathological evaluation of the yellow abalone Haliotis corrugata and the blue abalone Haliotis fulgens from Baja California, Mexico. J. Shellfish Res., 21 (2), Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos

11 20. VANBLARICOM, G.R., RUEDIGER, J.L., FRIEDMAN, C.S., WOODARD, D.D. & HEDRICK R.P. (1993) Discovery withering syndrome among black abalone populations at San Nicolas Island, California J. Shellfish Res., 12 (2), * * * NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la infección por Xenohaliotis californiensis (véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE: Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006