DETERMINACIÓN DE VPH POR LA TÉCNICA DE ARRAYS

Transcripción

1 DETERMINACIÓN DE VPH POR LA TÉCNICA DE ARRAYS Dr José Javier Gómez Román Dpto Anatomía Patológica Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Santander

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3 PATÓLOGO (Microscopium observare homini) NUEVA TÉCNICA (Facilitatum patologo vitae)

4 Guión 1. La importancia real del problema 2. El tipo de técnica 3. Indicaciones de la técnica de detección molecular de VPH 4. Y después de la vacuna qué?

5 Tasa de infección n por VPH en mujeres vírgenes tras inicio de relaciones sexuales 24 Meses 56 Meses Dinamarca (S.K. Kjaer et al. 2001) 35.4 % USA (L.Koutsky 2003) 40.0 % 70.0 %

6 La importancia real del problema Mortalidad en España en 2005 Mujeres Todas las causas: Tumores malignos: (19,4%) Cáncer de cérvix: 591 (0,3%)

7 Historia natural Duración media de la infección: 6 meses-2 años Persistencia: Detección n del mismo tipo viral en dos o más m s ocasiones durante uno a dos añosa 25% de las mujeres con infecciones transitorias: 100 Cambios citopáticos de bajo grado 25 Remiten el 60% espontáneamente a los 12 meses 15 Mujeres jóvenes Persisten el 30% 7 Progresan el 10% 2 Invaden el 1% 1 El aclaramiento de VPH precede a la remisión citológica

8 La importancia real del problema Citología por por año año Citología anormal 5% 850 casos/año 2500 determinaciones VPH en 2008 ASCUS ASCUS LG-SIL LG-SIL HG-SIL HG-SIL Carcinoma 3% 510 1% 170 0,5% 85 0,5% ? Datos del HUMV. Año

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10 Guión 1. La importancia real del problema 2. El tipo de técnicat 3. Indicaciones de la técnica de detección molecular de VPH 4. Y después de la vacuna qué?

11 Métodos de cribado Citologia Papanicolau (1936) (1936) Sensibilidad Sensibilidad limitada limitada (51%) (51%) Basados en en técnicas moleculares Sin Sin PCR PCR PCR PCR FISH FISH RNA RNA Detection Detection Otras Otras p16 p16 HCII HCII VPH VPHGenotipado Citología líquida Tiras Tiras Microarray Microarray Basado Basado en en gel gel Sólo dos subtipos hterc Sólo 16/18 Alto / Bajo riesgo

12 BR Comensales BR BR AR Árbol filogenético de VPH BR AR AR AR BR

13 Genoma de VPH Banda amplificada en ClinicalArrays -HPV:450 bp

14 Genoma de VPH y tipos E6 E2 E5 L1 E7 E1 E4 L2 UTR Región 291bp Clasificación Tipos oncogénicos nicos (alto riesgo): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68,73, 82 Tipos no oncogénicos nicos (bajo riesgo): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108 Probable alto riesgo: 26, 53 y 66

15 Genoma de VPH y cebadores E6 E2 E5 L1 E7 E1 E4 L2 UTR Región 291bp Clasificación 188 bp CPI/II 450 bp MY09/11 PGMY 150 bp GP5+/6+ 65 bp SPF10

16 MY09/MY11 E6 E2 E5 L1 E7 E1 E4 L2 UTR MY09: 5 CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC 3 MY11: 5 GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG 3 M=A ó C R=A ó G W=A ó T Y=C ó T 450 bp MY09/11 PGMY

17 Cebadores diagnósticos de VPH Carcinomas epidermoides Adenocarcinomas Controles MY09/MY11 95% 90,7% 73% 13,4% GP5/GP6 67% 96,6% (GP5+/6+) 50% 15,6% (GP5+/6+) CpI/CpIIG 88% 93% --- SPF10 >90% 100% 38% Karlsen et al. Eur J Cancer 1995;31: Muñoz et al. N Eng J Med 2003;348:518-27

18 Análisis del producto de PCR Amplificación de una región común (450 pb en L1) Electroforesis de las muestras Identificación de la banda esperada (Casos positivos)

19 Patrones de restricción n para RsaI VPH 6 VPH 11 VPH 16 VPH 18 VPH VPH

20 FISH hterc 3q

21 CLART HPV2 Genotipado de Papillomavirus Humano mediante identificación genómica para diagnóstico in vitro

22 PLATAFORMA DIAGNÓSTICA ARRAY TUBE: AT 1 tubo 1 muestra MICROARRAY ARRAY STRIP: AS Hasta 96 muestras

23 HIBRIDACIÓN N Y VISUALIZACIÓN AT/AS 120 puntos en el microarray Hibridación específica del producto amplificado y marcado con biotina. Microarray incubado con el conjugado, el cual se une a la biotina de los productos amplificados. Adición del revelado produce un precipitado en el microarray, que será visualizado por el lector.

24 CLART Esquema de Trabajo Tipos de Muestras Tejido incluido en parafina Torunda Extracción y Purificación Extracción purificación ADN Amplificación Visualización (Genotipados) Suspensiones celulares

25 SOFTWARE ESPECÍFICO

26 TIPO VPH 6 VPH 11 VPH 16 VPH 18 VPH 26 VPH 31 VPH 33 VPH 35 VPH 39 VPH 40 VPH 42 VPH 43 VPH 44 VPH 45 VPH 51 VPH 52 VPH 53 VPH 54 RIESGO ONCOGÉNICO * Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo TIPO VPH 56 VPH 58 VPH 59 VPH 61 VPH 62 VPH 66 VPH 68 VPH 70 VPH 71 VPH 72 VPH 73 VPH 81 VPH 82 VPH 83 VPH 84 VPH 85 VPH 89 RIESGO ONCOGÉNICO * Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo * Clasificación riesgo Dunne et al. (2007).

27 CONTROLES Control genómico Amplifica el ADN genómico del paciente # * # # * * Indica Tamaño 892 pb (vph 450 pb) Calidad de la muestra Integridad del ADN Evita falsos negativos por degradación Control Genómico* Control de amplificación (#) VPH

28 CONTROLES Control de amplificación Amplifica un plásmido incluido en la reacción # * # # * * Indica Amplificación correcta de la técnica Evita falsos negativos por fallo químico o mecánico-eléctrico Control Genómico* Control de amplificación (#) VPH

29 Distribución n de tipos virales sobre 2362 positivos ( ) 06) 2% 10% 20% % % 4% 5% Burgos León Santander 5% 6% 6% 8% 8% Otros Gomez-Roman J, Echevarria C, Salas S, González-Morán MA, Perez-Mies B, García- Higuera I, Nicolás M; Val-Bernal JF. A study of Human Papillomavirus prevalence based in low density arrays in three different Spanish regions. APMIS 2009;117:22-27

30 Importancia de genotipar J Med Virol 75: (2005) Barras rojas genotipos no incluidos en HCI. Flechas genotipos no incluidos en HCII.

31 Distribución n de tipos virales sobre 2362 (2005 y 2006) VPH 35 0,1 VPH 59 1,35 VPH 44 0,08 VPH 82 1,23 VPH 89 0,04 VPH 84 3,6 VPH 43 0,08 VPH 81 2,24 VPH 40 0,21 VPH 33 5,25 VPH 39 1,23 VPH 61 3,22 VPH 85 0,34 VPH 11 2,88 VPH 62 0,55 VPH 18 4,02 VPH 71 0,47 VPH 31 4,78 VPH 72 0,47 VPH 70 3,34 VPH 45 0,93 VPH 51 6,44 VPH 54 0,93 VPH 66 6,14 VPH 68 0,51 VPH 6 8 VPH 83 1,02 VPH 58 7,66 VPH 52 1,31 VPH 53 11,26 VPH 56 1,48 VPH 16 19,18

32 Infecciones múltiplesm 2362 infecciones virales 520 infecciones múltiples (22,4%) 386 infecciones dobles 80 infecciones triples 35 infecciones cuádruples 12 infecciones quíntuples 6 infección séxtuples 1 infección séptuple

33 Distribución n de tipos virales sobre 5952 casos CLART 603 casos de citología a normal 2% 13% 23% % 5% 10% % 2% 6% 6% 9% 6% 56 Otros

34 Distribución n de tipos virales sobre 5952 casos CLART 671 casos positivos con lesiones citológicas 12% 2% 32% % 5% % % 3% 9% 6% 3% 9% 56 Otros

35 Clasificacion filogenetica y epidemiologica del VPH Munoz, N. et al. N Engl J Med 2003;348:

36 Tipos de bajo riesgo? Low-risk Unknown risk High-risk HPV HPV Lesion CIN I CIN II CIN III INVASIVE CANCER Journal of medical Virology 75: (2005) CA in situ

37 Bajo riesgo asociado a lesiones Asociados a CIN2 VPH72 VPH54 VPH81 VPH61 (dos casos) VPH70 VPH44 Asociados a CIN3 VPH61 VPH42 VPH70

38 Por qué genotipar? Algunos genotipos tienen mayor agresividad Detección de coinfecciones y control posttratamiento Algunos tipos de bajo riesgo están presentes en lesiones de alto grado Emigración Conocimiento para las vacunas

39 Ventajas de la técnica t AT Evitamos manipulación de la muestra Contaminación Eliminamos la elaboración de geles Bromuro de Etidio Técnica objetiva y semicuantitativa: Positivos vs negativos Tipado de virus Es una técnica de PCR El adiestramiento permite incorporar otras técnicas similares

40 Virus de la familia Herpes humano

41 Ventajas de la técnica t AT (II) Facilita el diagnóstico de las infecciones múltiples Mayor número de controles Menor tiempo de procesado Se elimina la digestión con enzimas Automatización CE, FDA, EFQM, ISO

42 Inconvenientes Es una técnica de PCR Laboratorios poco equipados Personal poco adiestrado Exige infraestructura y cuidado Áreas pre y post-pcr Contaminación Funciona El volumen de trabajo exige dedicación por parte de un patólogo (al menos)

43 PCR marca ACME

44 Guión 1. La importancia real del problema 2. El tipo de técnica 3. Indicaciones de la técnica t de detección n molecular de VPH 4. Y después de la vacuna qué?

45 Protocolo de Cribado: Consenso Español 2006 Prog Obstet Ginecol 2006; 49 Supl 2: ª Citología a los 3 años de la 1ª R.S. Citología anual 2 años: si ambas valorables y negativas, control trienal. Citología +: ASCUS: Test de VPH : Negativo, Citología al año Positivo, Colposcopia Resto: Colposcopia, excepto LSIL < 25 años: Control citológico en 6 meses. 35 añosa os: Citología (C) y Test de VPH C - / Test - : Control en 5 añosa C - / Test + : CC y test al añoa C + : ASCUS, mismo protocolo. Resto, colposcopia Si se ha seguido el programa adecuadamente, finalización a los 65 añosa os. No citologías a mujeres histerectomizadas por procesos benignos

46 Mujeres menores de 30 añosa Citología --- Citología ASCUS Citología LSIL Citología > LSIL LSIL >25 años >25 años. VPH <25 años <25 años ---- VPH 3 años +++ Repetir citología 12 meses Colposcopia Colposcopia

47 Indicaciones de tipificación de VPH 1. Cribado en mujeres mayores de 35 añosa 2. Selección: 1. Evaluación de citologías con ASCUS 2. Valoración pronóstica y de seguimiento de LSIL en post-menopausia 3. Seguimiento 1. Control de curación post-tratamiento 2. Pacientes con CIN1 tras colposcopia

48 Cribado poblacional? 1384 casos Citología normal VPH positivas 40 colposcopias 1264 VPH negativas 125 colposcopias 15 CIN2/3 1,08% 3 CIN2/ casos: Sin lesiones en el seguimiento 3 casos (0,22%): Lesiones en la biopsia

49 Indicaciones de tipificación de VPH 1. Cribado en mujeres mayores de 35 años 2. Selección: 1. Evaluación de citologías con ASCUS 2. Valoración pronóstica y de seguimiento de LSIL en post-menopausia 3. Seguimiento 1. Control de curación post-tratamiento 2. Pacientes con CIN1 tras colposcopia

50 Valoración pronóstica y de seguimiento de LSIL en post- menopausia 403 casos de LSIL 92 en pacientes mayores de 45 años 27 casos fueron positivos (29,3%) 6 VPH16 (22,2%) 1 VPH6 y 2VPH11 1 VPH18 (3,7%) 311 en pacientes menores de 45 años 189 casos fueron positivos (60,8%) 59 VPH16 (31,2%) 14 VPH18 (7,4%)

51 Indicaciones de tipificación de VPH 1. Cribado en mujeres mayores de 35 años 2. Selección: 1. Evaluación de citologías con ASCUS 2. Valoración pronóstica y de seguimiento de LSIL en post-menopausia 3. Seguimiento 1. Control de curaci Control de curación post n post-tratamiento tratamiento 2. Pacientes con CIN1 tras colposcopia

52 Control de curación n post- tratamiento El tratamiento de las displasias de alto grado no va dirigido contra VPH Es recomendable incluir la determinación de VPH si se conocía el status previo al tratamiento Posibilidad de recidiva VPH negativo tras el tratamiento: Recidiva 3% VPH positivo tras el tratamiento: Recidiva 33% Permite distinguir recidivas de neoinfecciones

53 Con los mejores deseos Fdo. Tu gerente

54 Guión 1. La importancia real del problema 2. El tipo de técnica 3. Indicaciones de la técnica de detección molecular de VPH 4. Y después s de la vacuna qué?

55 Y después s de la vacuna qué? 1. Tenemos suficiente información sobre el cribado en España? 2. Es necesario disponer en un programa de cribado de cáncer de útero bien organizado y periódicamente evaluado antes de iniciar la vacunación? 3. Será necesario establecer dispositivos para el seguimiento de la infección por el VPH?

56 Y después s de la vacuna qué? 1. Se incrementará la prevalencia de los genotipos del VPH no incluidos en la vacuna? 2. Es necesario genotipar? 3. Los tipos de bajo riesgo lo son en realidad? 4. Cuál es la duración de la respuesta inmune? se necesitarán refuerzos?, quién los financiará? 5. Cuál será el impacto de la vacuna en los programas de cribado?

57 Esto fue todo