ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Transcripción

1 ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de pollo PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

2 Las proteínas se purifican mediante métodos de fraccionamiento que son una serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés y que se usan para separarlas de manera progresiva de otras moléculas.

3 Para qué queremos purificar proteínas? Conocer secuencias de aminoácidos. Establecer relaciones evolutivas. Investigar la función biológica. Establecer relaciones estructura-función. Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

4 GUÍA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA Definir los objetivos de la purificación Pureza, actividad y cantidad. Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas. PM, pi, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a las proteínas (ej proteasas). Seleccionar la fuente de proteína. Organismo, tejido, localización celular. Desarrollar una técnica de análisis. Para una detección rápida de la pureza, actividad y/ o contenido total de la proteína de interés.

5 Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad biológica. Minimizar el uso de aditivos. Usar lo mínimo necesario. Eliminar los contaminantes. Por ejemplo, las proteasas. Usar una técnica diferente en cada paso. Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra en el proceso de separación. Reducir el número de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificación.

6 Seleccionar la fuente de proteína La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como: a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y c) cualquier propiedad peculiar de la proteína de interés, que ayudará en su estabilización y su aislamiento.

7 Definir las Propiedades de la Proteína de Interés Masa Molecular Punto Isoeléctrico La información es útil para detectar la proteína a través de SDS- PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método de filtración en gel. El conocer el valor del pi puede ser utilizado con diferentes propósitos: precipitación isoeléctrica, selección de columna de intercambio iónico, ph de trabajo. Solubilidad Afectada por temperatura, ph, fuerza iónica. Esto debe ser considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína. También útil para separación. Polaridad Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interacción hidrofóbica. Unión Específica Ligandos útiles para separar la proteína por cromatografía de afinidad. Estabilidad En términos de actividad, agregación y composición de subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína son importantes a lo largo del proceso.

8 Técnicas de purificación/separación de acuerdo a las propiedades de las proteínas Características Procedimiento Solubilidad 1. Salting in 2. Salting out Carga iónica 1. Cromatografia de intercambio iónico 2. Electroforesis Polaridad 1. Cromatografía de adsorción 2. Cromatografía en papel 3. Cromatografía en fase reversa 4. Cromatografía interacción hidrófoba 1. Dialisis y ultrafiltración Tamaño molecular 2. Electroforesis en gel 3. Cromatografía de filtración en gel 4. Ultracentrifugación 1. Cromatografía de afinidad Especificidad de unión

9 Fases de la Purificación 1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. (Homogenización, centrifugación) 2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus. (Precipitación selectiva) 3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible. (Métodos cromatográficos)

10 FASE I. Métodos de baja resolución Homogenización, filtración, centrifugación FASE II. Métodos de baja resolución FASE III. Métodos de alta resolución Precipitación con sales, solventes, temperatura o ph Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante

11 Ruptura de la Célula Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente a temperaturas elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25 C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0 C o temperaturas cercanas. MÉTODOS Suaves: Lisis celular (choque osmótico) Digestión enzimática (lisozima) Lisis química (detergentes) Homogenización manual Molienda Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.

12 Ruptura de la Célula Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD MÉTODOS Moderados: Homogenización con cuchillas Molienda abrasiva Congelamiento Vigorosos: Ultrasonicación Homogenizador Manton-Gaulin Prensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

13 Buffer de Lisis Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la proteína. ph Mantener un ph en el cual la proteína es estable y se previene la precipitación isoeléctrica. Fuerza Iónica Mantener una concentración de sales adecuada para reducir las pérdidas por precipitación Aditivos Son componentes que previenen la degradación y mejoran la estabilidad. Se deben agregar solo si es necesario.

14 Aditivos

15 Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial Eliminar contaminantes o clarificar la muestra Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.

16 Homogenización del tejido Centrifugación Diferencial Baja velocidad de de centrifugación (1 000 g, g, 10 ) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación media ( g, 20 ) Tejido homogenado Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación alta ( g, 1 h) Pellet, contiene células completas, núcleos, membranas plasmáticas Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación muy alta ( g, 3 h) Pellet, contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas Sobrenadante contiene proteínas solubles Pellet, contiene microsomas (fragmentos de RE), vesículas pequeñas Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas grandes

17 Remover contaminantes y/o concentrar la muestra Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos: Ultrafiltración Precipitación selectiva

18 Precipitación selectiva Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Debido a que la proteína contiene varios grupos cargados, la solubilidad es sensible a la temperatura, el ph, la fuerza iónica. Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína. El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH 4 ) 2 SO 4. Sin embargo, también hay otros métodos Precipitación con solventes orgánicos. Precipitación isoeléctrica. Precipitación térmica.

19 Log (S/S ) Precipitación Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Fuerza Iónica

20 Precipitación por salado Solubilidad Capa de Hidratación Salting in Salting out Concentración de sal

21 Precipitación por salado Salting in: La solubilidad de una proteína, a una concentración baja de iones, aumenta a medida que se incrementa la concentración de la sal. Salting out: Las interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la proteína precipita. La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out varía de acuerdo a las características de la proteína

22 Precipitación por salado

23 Concentración inicial de sulfato de amonio (%) Concentración final de sulfato de amonio (%) Gramos de sulfato de amonio que hay que añadir a 1 L de solución

24 En la práctica Purificación de la lactato deshidrogenasa

25 Investigar: Propiedades de LDH de Gallus gallus Número de aminoácidos Peso molecular (Da) Punto isoeléctrico Promedio general de hidropaticidad (GRAVY) Localización celular Forma activa Superfamilia Tipo de enzima Cofactor LDH A LDH B

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27 Cómo vamos a purificar a la LDH de Gallus gallus? Importante: Anotar los volúmenes de las fracciones

28 Homogenización 1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo) 2) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.) 3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0) 4) Centrifugar a 7,000 rpm 4 C 10 min. 5) Decantar sobrenadante y tomar fracción 1 ml (F1) 6) Guardar fracciones a -20 C Precipitación por salado 1) 25 ml del sobrenadante en vaso de pp. 2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de saturación) 3) Centrifugar a 4 C a 10,000 rpm 10 min. 4) Registrar volumen y tomar 1 ml fracción 2 (F2) Guardar a -20 C 5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3 6) Descartar el sobrenadante 7) Resuspender botón o pellet en 1 ml de agua 8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 ml. Guardar a -20 C