Comparación de dos procesos cromatográficos para la purificación de lactoferrina a partir de suero de queso

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1 Comparación de dos procesos cromatográficos para la purificación de lactoferrina a partir de suero de queso MartínezGarcía M. J., GuzmánPartida, A. M., VázquezMoreno, L y RamosClamont M. G*. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria Km 0.6 Hermosillo, Sonora. Coordinación de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax e mail gramos@ciad.mx Resumen El suero lácteo subproducto de la elaboración de queso cuya Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBQ) es de 50,000 ppm se descarga contaminado las aguas y suelos mexicanos. La recuperación de sus nutrientes, entre ellos, las proteínas, disminuye la DBQ hasta en un 95%. Las proteínas del suero pueden utilizarse en las industrias alimentaria y farmacéutica, como la Lactoferrina (Lf), proteína con funciones antibacterianas, antioxidantes e inmunomodulatorias. Se compararon dos procesos para la purificación de Lf, las cromatografías de intercambio iónico (IEC) y de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). En la IEC se utilizó SulfopropilSefarosa, la adsorción de proteínas se promovió con solución de fosfatos (PBS), ph 6.7 y la elución aplicando un gradiente de NaCl (0.1 a 1 M). La matriz aceptó hasta 800 mg de proteína de suero obteniéndose 3.29 ±1.4 mg de Lf. Para IMAC se utilizó SefarosaIDACu ++, la adsorción de las proteínas se promovió con TrisAc. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, ph 5 y la elución con la misma solución a ph de 4 y 3. La matriz aceptó hasta 80 mg de proteína de suero obteniéndose 0.08 mg de Lf contaminada con inmunoglobulinas. En conclusión IEC fue más efectiva que IMAC para la purificación de lactoferrina. Abstract Whey is a byproduct of the cheese making process with a biological oxygen demand (BOD) of 50, 000 ppm. Whey represents an environmental problem for Mexico because is disposed in water and lands. However the nutrient recovery of whey can reduce DOD in 95%. Whey proteins have potential applications in food and clinical industries. One of them, Lactoferrin (Lf) is know to act as antibacterial, antioxidant and immunomodulator factor. A comparison of two chromatography process for lactoferrin purification was done. For LF purification with Ion Exchange Chromatography (AEC) a SulphopropylSepharose matrix was used. Protein adsorption was promoted with PBS buffer, ph 6.7 while elution 1

2 was complete using a NaCl gradient (0.1 a 1 M). Matrix accepted up to 800 mg of whey proteins and eluted 3.29 ±1.4 mg of Lf. Purification of Lf by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) was done using a SepharoseIDACu ++ matrix. Protein adsorption was promoted with 0.05M TrisAcetic acid, 0.5M NaCl, ph 5 while elution was complete using the same solution at ph of 4 y 3 respectively. SepharoseIDACu ++ matrix accepted up to 80 mg of whey protein and eluted 0.08 mg of lactoferrin and immunoglobulins. In conclusion AEC was more effective for Lf purification than IMAC. Introducción La producción de queso en México es una actividad rentable que aumenta año con año. Sin embargo, durante el proceso de elaboración, se genera una gran cantidad (relación 9:1 con respecto al queso) de suero lácteo el cual generalmente se elimina como efluente, constituyendo un problema potencial de contaminación. La Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) del suero es de 50,000 ppm, un programa de recuperación de nutrientes del suero podría reducir hasta en un 95% el valor de la DBO de las aguas residuales de la industria láctea. Esto también aumentaría la rentabilidad de la empresa (CONAMA, 1998). Entre las proteínas del suero que pueden recuperarse se encuentra la lactoferrina (Lf). Esta glicoproteína de 80 kda tiene la capacidad de unir y transportar el hierro a través de la sangre. Además, presenta otras funciones como su actividad bactericida, antioxidante e inmunomodulatoria, que pueden aprovecharse tanto en la industria alimentaria como en la farmacéutica. Las principales fuentes comerciales de Lf son el suero de queso y la leche descremada, ambas de origen bovino (Tomita et al., 2002). Para el 2003, se estimó una producción mundial de 73 toneladas de Lf; Nueva Zelanda es el principal productor, mientras que Asia y Europa la consumen como suplemento alimenticio o como antimicrobiano en cosméticos y pastas de dietes. Recientemente la FDA aprobó el uso de lactoferrina en canales de carne para el control del crecimiento microbiano (Wakabayashi et al., 2006). El aislamiento y purificación de proteínas se basa en estrategias que exploten propiedades físicas químicas y biológicas de la molécula tales como su carga, su tamaño, su solubilidad, o sus propiedades de unión específica a otras moléculas. En base a lo anterior, las proteínas pueden separarse por diversos métodos entre los que destacan la precipitación por salado o con solventes y los métodos cromatográficos. Estos últimos presentan la ventaja de ser más específicos y flexibles en lo que al establecimiento de condiciones se refiere, lo que permite preservar más fácilmente la estabilidad y la actividad biológica de la proteína purificada (Burnouf, 1995). En este 2

3 trabajo se comparan dos tipos de cromatografías IEC e IMAC para la purificación de lactoferrina a partir de suero de queso. Materiales y Métodos Materiales Los ensayos de inmunodetección se realizaron con antilf bovina producida en cabra y anti IgG de cabra ligada a peroxidasa producida en conejo de los Laboratorios Bethyl Labs (Montgomery, TX, EUA). La matriz cromatográfica SulfopropilSefarosa se adquirió en GE Healthcare (Upsala, Suecia). La matriz cromatográfica SefarosaIDA se sintetizó en la Universidad de Arizona según Porath y Olin (1995). El resto de los reactivos utilizados se adquirieron de SigmaAldrich (St. Louis, MO, EUA). El suero se obtuvo de la elaboración de queso fresco por el método tradicional. Purificación de lactoferrina La purificación se llevó a cabo en un equipo ÄKTA Purifier (GE Healthcare, Suecia). Para la IEC se utilizó una matriz de SulfopropilSefarosa empacada en una columna XK16 a un volumen de cama (VC) de 10 ml. La matriz se equilibró con 5 VC de pbs 10 mm, ph 6.7 (Solución A). El suero ( mg de proteína total), se aplicó a la columna y se promovió la adsorción de sus proteínas en presencia de la solución A, misma que se utilizó como fase móvil y solución de lavado. Las proteínas débilmente unidas se eliminaron con solución A con NaCl 0.1 M. La elución se promovió desarrollando un gradiente de M de NaCl. La columna se regeneró con 5 VC de NaCl 1 M, 2 VC de NaOH 1 M y 10 VC de agua Milli Q. Para la purificación de Lf por IMAC se utilizaron 10 ml de VC de SefarosaIDA Cu ++. La matriz se equilibró con 5 VC de TrisAc. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, ph 5 (Solución B). Las proteínas del suero (2080 mg) se aplicaron a la columna, se promovió la adsorción con solución B y la elución fue con la misma solución a distinto ph (4 y 3). La matriz se regeneró con 5 VC de Guanidina 4M, 5 VC de EDTA 10 mm y 10 VC de agua MilliQ. En ambos casos la proteína se estimó por el método de Bradford (1970) utilizando una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA). La caracterización de las fracciones cromatográficas de IEC e IMAC se realizo por electroforesis SDSPAGE en geles de poliacrilamida al 10% tiñendo con plata (Laemmli, 1970) y por inmunodetección con antilactoferrina bovina con Western Blot con el sistema avidinaperoxidasa (Towbin et al., 1979). 3

4 Resultados y Discusión En la figura 1 se muestra el cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por cromatografía de intercambio iónico. El pico 1 muestra la fracción de lavado obtenida con 16 VC, los picos restantes son las eluciones de las proteínas adsorbidas. Las proteínas que no se adsorbieron específicamente (pico 2), fueron retiradas de la matriz con 7 VC de la solución A conteniendo NaCl 0.1 M. Posteriormente se realizó un gradiente de NaCl de 0.11 M en solución A y se obtuvieron otros dos picos de elución (picos 3 y 4). El pico 3 eluyó con 12 VC a una concentración entre M de NaCl a mientras que el pico cuatro se obtuvo entre M de NaCl con 12 VC. Las alturas máximas de los picos 3 y 4 se obtuvieron a 0.24 M y 0.75 M de NaCl, respectivamente. Se cargaron desde 200 hasta 1600 mg de proteínas de suero a la matriz cromatográfica, pudiéndose trabajar a un flujo de fase móvil de 5 ml/min. Los balances de materia mostraron que la columna se satura al aplicar 800 mg de proteínas de suero y que la capacidad de la matriz es de 0.33 mg de lactoferrina /ml de matriz cromatográfica. Sin embargo, la lactoferrina más pura (1.60 ± 0.12 mg) se obtiene aplicando 400 mg de proteína a la matriz. La cantidad obtenida corresponde al contenido reportado en la literatura. La duración del proceso fue de 4 h. 4, ,5 kda 0.8 absorbancia (280 nm) 3 2,5 2 1,5 1 0, NaCl (M) ,5 fracciones 0 Figura 1. Cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por intercambio iónico. La adsorción de proteínas se promovió en presencia de PBS ph 6.7 (pico 1). Las proteínas que no se unieron de manera específica fueron desprendidas con NaCl 0.1 M (pico 2). Posteriormente se eluyó con un gradiente de 0.11 M de NaCl (picos 3 y 4). En el extremo izquierdo se muestra la electroforesis del pico 4 en el que se obtuvo la Lf (carril 2) y la 4

5 confirmación por inmunodetección con antilactoferrina (carril 3). En el extremo derecho de la figura 1 se muestra la migración electroforética del pico 4 (carril 2) al aplicar 400 mg de proteína de suero de queso. Se observa una banda de 80 kda correspondiente a la masa molecular de la Lf bovina (Levay y Viljoen, 1995). No se observa contaminación con alguna otra proteína. La inmunodetección con antilactoferrina bovina (carril 3), confirmo la presencia de la proteína. La figura 2 presenta el cromatograma típico y la electroforesis de las fracciones obtenidas por IMAC para la purificación de Lf. En el cromatograma se observan 3 picos correspondientes al lavado (Solución B, ph 5) y a las eluciones con solución B a ph 4 y 3, respectivamente. La matriz aceptó desde 20 a 50 mg de proteínas de suero saturándose con 40mg. La velocidad máxima de la fase móvil fue de 1 ml/min. La capacidad de la matriz fue de 0.1 mg de proteína /ml de matriz, obteniéndose un máximo de 0.08 mg de proteína en un proceso de 4 h. Sin embargo, la Lf no pudo obtenerse pura en este tipo de cromatografía como indica el carril 4 de la figura 2B en el que se observa una banda de 80 kda correspondiente a la Lf y otras bandas de 66, 55 y 25 kda correspondientes a la albúmina sérica y a las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, respectivamente. Debido a esta contaminación, fue necesario acoplar una columna de SefarosaHeparina a IMAC, con el fin de aplicarle la elución a ph 4 y obtener la Lf pura añadiendo 4 h más al proceso (Datos no mostrados). En el Cuadro 1 se resumen los aspectos más relevantes de la comparación de ambos procesos cromatográficos. Como puede observarse la cromatografía de intercambio iónico requiere de la mitad del tiempo de proceso (4 h) para obtener de 18 a 20 veces más lactoferrina que la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. En este último proceso debe además, acoplarse una cromatografía de afinidad por heparina para obtener la lactoferrina pura, ya que, como se observó en los patrones electroforéticos de la figura 2, la Lactoferrina obtenida por IMAC se encuentra contaminada con albúmina e inmunoglobulinas. Otro aspecto importante es que, debido a que la matriz de intercambio iónico acepta mayores flujos de la fase móvil sin comprimirse (5 ml/min) y acepta una mayor cantidad de proteínas sin saturarse, tiene capacidad de escalamiento del proceso 5

6 Figura 2. Purificación de lactoferrina de suero de queso por IMAC. A) Cromatograma típico. La adsorción se promovió en presencia de solución Tris Ac. Acético, ph 5 (pico 1. La elución de las proteínas adsorbidas se realizó con la misma solución pero a ph 4 y 3 (picos 2 y 3), respectivamente. B SDSPAGE al 10% de las fracciones cromatográficas. Carril 1 estándares de masa molecular, carril 2 suero de queso, carril 3 fracción de lavado (pico1), carril 4 fracción de elución a ph 4 (pico 2), carril 5 fracción de elución a ph 3. La tabla 1 resume los aspectos más relevantes en la comparación de los dos procesos de purificación. Cuadro 1. Comparación de los dos procesos cromatográficos para purificación de lactoferrina de suero de queso Tipo de cromatografía Intercambio Iónico Afinidad por Metales Inmovilizados Matriz cromatográfica SulfopropilSefarosa SefarosaIDACu++ Cantidad de proteína mg 3540 mg que acepta la matriz Velocidad de flujo 510 ml/min 0.51 ml/min Capacidad de la 0.33 mg de Lf/ml de matriz 0.1 mg proteína/ml de matriz matriz Lactoferrina obtenida Pura Contaminada, se requiere acoplamiento con cromatografía en SefarosaHeparina Lactoferrina/corrida 1.60 a 3.29 mg 0.08 a 0.14 mg 6

7 Referencias Bibliográficas Bradford, M.M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindyebinding. Anal. Biochem. 72: Burnouf, T Chromatography in plasma fraction: benefits and future trends. J. Chromatogr. B. 664:315. CONAMA Guía para el control y la prevención de la contaminación industrial. Productos Lácteos. Comisión Nacional del Medio Ambiente. Chile Laemmli, U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227: Levay, P.F., and Viljoen, M Lactoferrin: a general review. Acta Haematol. 80: Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76: Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., and Hayasawa, H Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochem. Cell Biol. 80: