TÉCNICAS INTELIGENTES EN BIOINFORMÁTICA. Modelización de la regulación génica en procariotas El Operón Lactosa

Transcripción

1 TÉCNICAS INTELIGENTES EN BIOINFORMÁTICA Modelización de la regulación génica en procariotas El Operón Lactosa Mario de J. Pérez Jiménez Grupo de investigación en Computación Natural Dpto. Ciencias de la Computación e Inteligencia Artificial Universidad de Sevilla Máster Universitario en Lógica, Computación e Inteligencia Artificial Curso

2 Introducción Cantidad de proteínas que produce un gen activo por unidad de tiempo: varía según las necesidades de la célula. El nivel de expresión de los genes variará según las condiciones ambientales, el nivel de diferenciación de la célula etc. Síntesis de proteínas: alto coste energético (hay que regular este proceso). La regulación se puede dar a nivel de la transcripción o de la traducción Lo más directo es regular su tasa de transcripción del gen en moléculas de RNAm, por parte de la RNA-polimerasa. Diferencias importantes entre los sistemas de regulación de genes: En células procariotas varios genes pueden ser codificados por un único RNAm (policistrónicos). En células eucariotas un RNAm sólo puede codificar un gen (monocistrónicos). 2 / 51

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4 Sistemas de regulación Positivo: una molécula efectora activa un promotor (no hay que anular ningún inhibidor). Negativo: un inhibidor (represor) puede evitar la transcripción y, para la transcripción, es necesario inhibir al inhibidor (mediante un inductor); todas las órdenes de regulación son negativas. Un sistema pueder estar regulado, a la vez, positiva y negativamente. 4 / 51

5 Concepto de operón Un operón es un conjunto de genes cuya expresión está regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y los mismos genes. Elementos que constituyen un operón: Los genes estructurales: son los genes cuya expresión está regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales (policistrónicos). Los operones eucarióticos suelen contener un sólo gen estructural (monocistrónicos). El promotor (P): es un elemento de control, una región del DNA que es reconocida por la RNA polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. El operador (O): es otro elemento de control, una región del DNA con una secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. Está situado entre la región promotora y los genes estructurales. El gen regulador: secuencia de DNA que codifica la proteína reguladora. Suele estar situado cerca de los genes estructurales del operón pero no inmediatamente al lado. Proteína reguladora: proteína codificada por el gen regulador y suele unirse al operador del operon. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes estructurales. Un operón se transcribe en una sóla cadena de RNAm a partir de un único promotor. 5 / 51

6 Promotores de un operón El inicio de la transcripción puede estar regulado por una proteína represora. Ejemplo: la síntesis del triptófano en la bacteria E. coli. La proteína represora necesita al triptófano para unirse al operador e inhibir el proceso. Promotores de un operón: Fuerte: en ausencia del represor, la tasa de unión de la RNA-polimerasa es muy alta. Débil: en ausencia del represor, no son capaces de iniciar la transcripción por sí solos de forma efectiva. Necesitan una proteína activadora. 6 / 51

7 El Operón Triptófano Tiene cinco genes estructurales: trpe-trpd-trpc-trpb-trpa ( en este orden!). Las enzimas codificadas por estos cinco genes actúan en la ruta metabólica de síntesis del triptófano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma. El promotor y el operador están al lado de los genes estructurales Primero el promotor y después el operador. El gen regulador (trpr) codifica para la proteína reguladora. Este gen se encuentra en otra región del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del operón. Existe un represor: el propio triptófano (correpresor). El inductor del sistema es la lactosa El operón lactosa también está bajo control positivo, ya que existe otra proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales. 7 / 51

8 Estrutura del Operón Triptófano 8 / 51

9 En ausencia del triptófano (o cuando hay muy poco), la proteína reguladora no es capaz de unirse al operador de forma que la RNA-polimerasa puede unirse a la región promotora y se transcriben los genes del operón triptófano. 9 / 51

10 En presencia del triptófano, éste se une a la proteína reguladora o represora cambiando su conformación, de manera que ahora sí puede unirse a la región operadora y como consecuencia la RNA-polimerasa no puede unirse a la región promotora y no se transcriben los genes del operón triptófano. 10 / 51

11 El Operón Lactosa Los genes estructurales del operón lactosa son los siguientes: El gen z+: codifica la β-galactosidasa (Lac Z) que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa más galactosa. El gen y+: codifica la galactósido permeasa (Lac Y) que transporta b-galactósidos al interior de la célula bacteriana. El gen a+: codifica la transacetilasa (LacA) que no parece estar relacionada con el metabolismo de la lactosa. El promotor y el operador están al lado de los genes estructurales Primero el promotor y después el operador. El gen regulador es el gen i que codifica la proteína reguladora (en este caso, represora): LacI compuesta de 300 aminoácidos. El inductor del sistema es la lactosa (en realidad es la alolactosa, un derivado) La alolactosa inhibe la acción de la proteína represora: se une a una región del LacI cambiando su conformación. 11 / 51

12 Estrutura del Operón Lactosa (I) 12 / 51

13 Estrutura del Operón Lactosa (II) 13 / 51

14 Control de expresión de genes en el Operón Lactosa Añadiendo un nuevo sustrato al cultivo se puede inducir la formación de enzimas capaz de matabolizar este sustrato. Por ejemplo, en un cultivo de E. coli alimentado por glucosa cuando se transfiere algunas células a un medio conteniendo lactosa tiene lugar una serie de eventos reveladores. En primer lugar, las células están quiescentes (no metabolizan lactosa, se ralentizan otras actividades metabólicas y la división celular se detiene) pero están produciendo tres enzimas: LacY (galactósido permeasa) que transporta la lactosa desde el cultivo al interior de la célula a través de la membrana plásmica, LacZ (β-galactosidasa) que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa, y LacA (transacetilasa) cuya función no es conocida aún. Sin embargo, el cultivo empieza a crecer y la lactosa es consumida rápidamente 14 / 51

15 El Operón Lactosa. Represión La proteína represora del operón lactosa se llama LacI. Parte de la molécula LacI se une al operador impidiendo la unión de la RNA-polimerasa al promotor. El inductor del sistema es la alolactosa, un derivado de la lactosa: represor del represor. La alolactosa inhibe la acción de la proteína represora: se une a una región del LacI cambiando su conformación e impidiendo que LacI se una al operador. 15 / 51

16 El Operón Lactosa. Activación La inhibición del represor LacI es condición necesaria pero no suficiente para la transcripción de los genes estructurales. El complejo proteínico CRP-cAMP es un activador que propicia la unión de la RNA-polimerasa al promotor. La presencia de glucosa en el medio inhibe la síntesis de dicho complejo proteínico: represión catabólica. La molécula EIIA P: Ayuda al transporte de la glucosa por el interior de la bacteria (en ese transporte, la glucosa es fosforilada). Activa la enzima AC que, a su vez, regula la producción de camp. Inhibe a la enzima LacY que transporta lactosa al interior de la bacteria. En medios ricos en glucosa, los niveles de camp son bajos. Para que se transcriban los genes del operón lactosa es necesario niveles alto de camp: cuando no hay glucosa en el medio, la molécula EIIA P está libre y se sintetiza camp. Cuando la E. coli crece en un medio sin glucosa pero rica en lactosa, los niveles de camp son altos: El camp se une al receptor CRP y el complejo proteínico CRP-cAMP 2 propicia la unión de la RNA-polimerasa al promotor, estimulando la transcripción de los genes estructurales. 16 / 51

17 Estrutura del Operón Lactosa (III) 17 / 51

18 Operón Lactosa en E. coli Mediante la degradación de la lactosa, las bacterias obtienen energía. La bacteria E. coli es capaz de seleccionar la fuente de energía cuando tiene varias a su alcance. En un medio que contiene glucosa, la E. coli prefiere a ésta como fuente de energía. Los operones que producen las enzimas necesarias para obtener energía de otros azúcares, están bloqueados. El Operón lactosa está sujeto simultáneamente a un control negativo y a un control positivo: Control negativo: la proteína reguladora Lac I (producto del gen i) es un represor que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del inductor. Control positivo: existe un complejo proteínico (CRP-cAMP2 ) que estimula la transcripción de los genes estructurales. 18 / 51

19 Operón Triptófano versus Operón Lactosa Operón Triptófano: La proteína represora sólo se puede unir al operador cuando previamente está unido al triptófano. El promotor es fuerte ya que la transcripción está regulado por un represor (Lac I), un activador de éste (lactosa) y por un represor de éste (triptófano). Operón Lactosa: La proteína represora sólo se puede unir al operador en ausencia de lactosa. El promotor es débil ya que la transcripción está regulado por un represor (Lac I) y un complejo activador (CRP-cAMP 2 ). La presencia de glucosa en el medio inhibe la síntesis del complejo activador. 19 / 51

20 En ausencia de la lactosa, la proteína represora se encuentra unida al operador e impide la unión de la RNA-polimerasa a la región promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales (ahorro energético). 20 / 51

21 En presencia de la lactosa, ésta se une a la proteína reguladora que cambia su conformación y se suelta de la región operadora dejando que la RNA-polimerasa se una a la región promotora y se transcriban los genes estructurales. 21 / 51

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23 Transcripción del Operón Lactosa en E. Coli (I) Caso 1: Ausencia de glucosa y lactosa. Existirán muchos complejos CRP-cAMP 2 que asistirán a la RNA-polimerasa para que se una al promotor del operón pero NO se activará la transcripción ya que el represor Lac I impedirá esa unión. Caso 2: Presencia de glucosa y ausencia de lactosa. Existirá un bajo número de complejos CRP-cAMP 2 pero NO se activará la transcripción ya que el represor Lac I impedirá esa la unión del complejo al operador. Caso 3: Presencia de glucosa y presencia de lactosa. Existirá un bajo número de complejos CRP-cAMP 2 pero ahora SÍ se activará la transcripción ya que el represor Lac I está inhibido por la presencia de la lactosa. Se producirá, pues, un nivel bajo de transcripción (en este caso, no se necesita degradar lactosa para obtener energía). Caso 4: Ausencia de glucosa y presencia abundante de lactosa. Existirán muchos complejos CRP-cAMP 2 que asistirán a la RNA-polimerasa para que se una al promotor del operón y SÍ se activará la transcripción ya que el represor Lac I está inhibido. Se producirá, pues, un nivel alto de transcripción. 23 / 51

24 Transcripción del Operón Lactosa en E. coli: Modelo basado en sistemas P En una bacteria E. coli existen dos regiones relevantes: La superficie celular de la bacteria que contiene un conjunto de proteínas que controlan el movimiento de las moléculas y detectan señales. El lumen bacteriano o interior acuoso de la bacteria donde una serie de proteínas están involucradas en procesos celulares específicos. En nuestro modelo vamos a considerar tres membranas La primera está etiquetada con s y representa la superficie celular. Los objetos que describen las entidades moleculares asociadas a la membrana piel se localizarán en esta región, así como las reglas que especifican los procesos de selección de sustancia del entorno y de señalización (receptor-señal). La segunda está etiquetada con c, está contenida en la membrana s y describe el medio acuoso del interior de la bacteria. Contiene los objetos y cadenas que especifican las proteínas y otras entidades moleculares situadas en dicho medio. Las reglas describen las interaccions que tienen lugar dentro de la bacteria. La tercera membrana está etiquetada por e, contiene a la membrana s y describe el medio cultivo. Dependiendo de los recursos de azúcares, la E. coli exhibirá un comportamiento diferente. En nuestro modelo usaremos esta región para codificar esos recursos a través de la multiplicidad de ciertos objetos. La membrana e delimitará la frontera de nuestro sistema. 24 / 51

25 Entidades moleculares Las proteínas y enzimas involucradas en la selección de azúcares del medio y en su metabolismo, serán representadas por símbolos de un alfabeto: O prot. Por ejemplo, se puede considerar que las moléculas EIICB y β galactosidasa son entidades individuales sin estructura interna. El alfabeto O prot es el siguiente conjunto: {EIIA, EIIA P, EIICB, EIICB EIIA P, EIICB P, Gluc, Gluc P, EIICB P Gluc, Lact, LacY, Lact-LacY, AC, AC EIIA, AC EIIA P, ATP, AC EIIA P ATP, LacY-EIIA, β Galac, Lact, β Galac Lact, Allolact, LacI, LacI Alloct, CRP, CRP camp, CRP camp 2, RNAP} 25 / 51

26 Symbol Molecule EIICB EIICB P Glucose Transporter Enzyme IICB and its phosphorylated state EIIA EIIA P Glucose Transporter Enzyme IIA and its phosphorylated state EIICB EIIA P Complex transporter enzymes IICB and phophorilated IIA Gluc Gluc P Glucose and its phosphorylated state EIICB P Gluc Complex transporter IICB phosphorylated and glucose Lact Lactose LacY Lactose permease Lact-LacY Complex lactose permease and lactose LacY-EIIA Complex lactose permease and transporter enzyme IIA ATP camp Adenosine triphosphate and cyclic adenosine monophosphate AC Adelynate Cyclase AC EIIA AC EIIA P ATP and AC complexes with and ATP AC EIIA P ATP β Galac β Galac Lact β Galactosidase and its complex with lactose Allolact Allolactose, the inducer LacI LacI Alloct The lac repressor and its complex with allolactose CRP camp Receptor Protein, the activator, CRP camp its complex with camp and its dimer CRP camp 2 RNAP RNA polymerase Más tarde se detallarán las funciones de estas proteínas cuando se analice la especificación de los procesos celulares en el sistema de regulación del operón lactosa usando reglas de reescrituras. 26 / 51

27 Representación de genes, RNAm y sitios Los genes que intervienen aparecen en una estructura lineal en donde el orden es esencial (orden en el que los genes son expresados). La estructura lineal de los genes y del RNAm serán especificadas a través de cadenas. Los sitios relevantes en el operón lactosa y en el RNAm serán representados usando símbolos de los alfabetos O dna y O rna, resp. El alfabeto Odna es el siguiente conjunto: {cap, cap CRP camp 2, op, op LacI, lacz s, lacz m, lacz e, lacy s, lacy m, lacy e, laca s, laca m, laca e } El alfabeto Orna es el siguiente conjunto: {Rib, op, lacz s, lacz m, lacz e, lacy s, lacy m, lacy e, laca s, laca m, laca e } 27 / 51

28 Símbolos que indican los sitios relevantes Symbol Site cap Free CAP site where the activator CRP-cAMP 2 binds cap CRP camp 2 CAP site occupied by the activator CRP-cAMP 2 binds op Free operator site where the repressor LacI binds op LacI Operator site occupied by the repressor LacI binds lacz s Sites marking the start point of the lacz, lacy and lacy s laca gene respectively laca s lacz m Sites located in the middle of the lacz, lacy and lacy m laca gene respectively laca m lacz e lacy e Sites located in the final point of the lacz and lacy gene respectively. laca e Site marking the end of gene laca which coincides with the transcription termination site of the lac operon op Site marking the starting point of the mrna transcript lacz s lacz e Sites marking the beginning and end of the reading frames lacy s lacy e in the mrna for the genes lacz, lacy and laca respectively laca s laca e lacz m Sites located in the middle of reading frames of lacz, lacy and lacy m laca gene respectively laca m 28 / 51

29 La cadena s 3 representa el operón lactosa en E. coli: {}}{{}}{{}}{ cap. op. lacz s.lacz m..lacz m.lacz e. lacy s.lacy m..lacy m.lacy e. laca s.laca m..laca m.laca e La RNA polimerasa ocupa alrededor de 100 nucleótidos y, por ello, cada símbolo lacz i, lacy i y laca i with i = s, m, e, representa una sucesión de 100 nucleótidos del correspondiente gen, en lugar de sólo uno. Por tanto, tenemos únicamente 30 sitios lacz, 12 lacy y 6 laca que representan los 3000, 1200 y 600 nucleótidos de los correspondientes genes. El lugar de enlace de CAP y el operador es representado por cap y por op. 29 / 51

30 Reglas que describen el transporte de glucosa La recepción de glucosa desde el entorno comienza con el reclutamiento de la proteína EIIA P del citoplasma a través de al proteína transmemmbrana EIICB (regla r 1 ). Este proceso es reversible: EIIA P puede ser enviada al citoplasma (regla r 2 ). r 1 : EIICB [ EIIA P ] c c 1 EIICB EIIA P [ ] c, c 1 = molec 1 sec 1 r 2 : EIICB EIIA P [ ] c c 2 EIICB [ EIIA P ] c, c 2 = sec 1 Una vez que la proteína EIIA P ha sido reclutada, puede interactuar produciendo la fosforilización de EIICB en la superficie celular y enviar EIIA al citoplasma (regla r 3 ). r 3 : EIICB EIIA P [ ] c c 3 EIICB P [ EIIA ] c, c 3 = sec 1 Una vez que la proteína EIICB P está presente en la superficie celular la glucosa comienza a ser transportada al interior de la célula enlazando con EIICB P (regla r 4 ). Ahora bien, esta interacción es reversible (regla r 5 ). Por otra parte, la glucosa puede ser transportada al interior de la bacteria y enviada al citoplasma (regla r 6 ). En este proceso, la glucosa es fosforilada, Gluc P. r 4 : Gluc [ EIICB P ] s c 4 [ EIICB P Gluc ] s, c 4 = molec 1 sec 1 r 5 : [ EIICB P Gluc ] s c 18 Gluc [ EIICB P ] s, c 5 = sec 1 r 6 : EIICB P Gluc [ ] c c 6 EIICB [ Gluc P ] c, c 6 = sec 1 30 / 51

31 Reglas que describen el transporte de lactosa El transporte de la lactosa en el interior de la bacteria se especifica por el mismo tipo de reglas que con la glucosa, si bien ahora el transporte es más simple ya que no implica transferencia de un grupo fosforilo. La entrada de la lactosa al interior de la bacteria necesita la presencia de LacY en la superficie celular. Aunque LacY es sintetizada en el citoplasma, ella se mueve a la superficie celular (regla r 7 ). r 7 : [ LacY ] c c 7 LacY [ ] c, c 7 = 0.02sec 1 La recepción de la lactosa, Lact, presente en el entorno se lleva a cabo en dos pasos. En el priemro, la lactosa enlaza con la permeasa (regla r 8 ) y, entonces, la permeasa es transportada y enviada al citoplasma (regla r 9 ). r 8 : Lact [ LacY ] s c 8 [ Lact-LacY ] s, c 8 = molec 1 sec 1 r 9 : Lact-LacY [ ] c c 9 LacY [ Lact ] c, c 9 = sec 1 La recepción de la lactosa es inhibida por EIIA que enlaza a LacY produciendo el complejo LacY-EIIA (regla r 10 ). La lactosa no puede enlazar a este complejo sobre la superficie celular bloqueando el transporte de la lactosa por el interior de la célula. El complejo LacY-EIIA se puede disociar en sus componentes (regla r 11 ). r 10 : LacY [ EIIA ] c c 10 LacY-EIIA [ ] c, c 10 = 10 4 molec 1 sec 1 r 11 : LacY-EIIA [ ] c c 11 LacY [ EIIA ] c c 11 = 10 3 sec 1 Estas interacciones moleculares son importantes en la represión catabólica: un alto número de EIIA no fosforilada en el citoplasma es consecuencia de la presencia de glucosa en el entorno. Durante su transporte, la glucosa es fosforilada con un grupo fosforilo que es transferido desde EIIA P a EIIBC y, finalmente, a la glucosa. Por tanto, en presencia de glucosa, EIIA P es consumida en el citoplasma y EIIA se produce en alto número, lo que inhibe la permeasa LacY y la recepción de lactosa. 31 / 51

32 Reglas que describen la actividad de la β Galactosidasa La β galactosidasa escinde la lactosa en glucosa y galactosa. La producción de la glucosa a partir de la lactosa no es crucial en la regulación de la expresión de los genes en el operoón lactosa. La producción de la alolactosa es un paso importante en la regulación ya que actúa como inductor. La alolactosa se obtiene de la interacción entre la β galactosidasa y la lactosa. Es una enzima que en primer lugar forma un complejo con la lactosa (regla r 12 ) y después interactúa con él para producir alolactosa (regla r 13 ). r 12 : [ β Galac + Lact ] c c 12 [ β Galac Lact ] c, c 12 = molec 1 sec 1 r 13 : [ β Galac Lact ] c c 13 [ β Galac + Allolact ] c, c 13 = molec 1 sec 1 La β Galactosidasa se degrada en el citoplasma a través de la maquinaria celular (regla r 14 ). r 14 : [ β Galac ] c c 14 [ ] c, c 14 = sec 1 32 / 51

33 Reglas que describen la actividad de la Alolactosa La Alolactosa es una señal de la presencia de lactosa en el entorno. Actúa como inductor del sistema de regulación de genes del operón lactosa mediante la inhibición del represor, LacI, con una interacción directa (regla r 15 ). Un cambio de conformación se induce en el represor cuando la alolactosa se enlaza a él, impidiendo su enlace con el operador del sistema. La alolactosa se degrada también en el citoplasma (regla r 16 ). r 15 : [ LacI + Allolact ] c c 15 [ LacI-Allolact ] c, c 15 = 0.01molec 1 sec 1 r 16 : [ Allolact ] c c 16 [ ] c, c 16 = sec 1 33 / 51

34 Reglas que describen la actividad de la Adenylate Cyclasa La Adenylate Cyclase (AC) regula la producción de las moléculas de camp, cuyo número es inversamente proporcional al número de moléculas de glucosa en el entorno. Para la síntesis de camp, la AC recluta del citoplasma a la fosforilada EIIA P (regla r 17 ). Esta interacción es reversible (regla r 18 ). r 17 : AC [ EIIA P ] c c 17 AC EIIA P [ ] c, c 17 = molec 1 sec 1 r 18 : AC EIIA P [ ] c c 18 AC [ EIIA P ] c, c 18 = 0.01sec 1 El complejo AC EIIA P recluta ATP del citoplasma (regla r 19 ) y lo transforma en camp que es enviado al citoplasma (regla r 20 ). r 19 : AC EIIA P [ ATP ] c c 19 AC P EIIA P ATP [ ] c, c 19 = molec 1 sec 1 r 20 : AC EIIA P ATP [ ] c c 20 AC P EIIA P [ camp ] c, c 20 = 0.02sec 1 Como hemos indicado, el número de moléculas no fosforiladas de EIIA es un indicador de la presencia de glucosa en el entorno. Como parte del mecanismo de represión catabólica, EIIA inhibe la producción de camp mediante el enlace con AC en la membrana celular (reglas r 21 y r 22 ). Esto inhibe la activación del operón lactosa mediante la represión de la actividad del AC y, por tanto, de la producción de camp y el activador CRP-cAMP 2. r 21 : AC [ EIIA ] c c 21 AC EIIA [ ] c c 21 = molec 1 sec 1 r 22 : AC EIIA [ ] c c 22 AC [ EIIA ] c, c 22 = 0.02sec 1 34 / 51

35 Reglas que describen la formación del activador CRP-cAMP 2 La proteína CRP no puede enlazar con el promotor a menos que interactúe con camp para producir el complejo CRP-cAMP que, a su vez, formará un dímero CRP-cAMP 2 (regla r 23 y r 24 ). Este dímero es capaz de enlazar con el promotor e incrementar la tasa de transcripción de los genes codificados en el operón lactosa. r 23 : [ CRP + camp ] c c 23 [ CRP-cAMP ] c, c 23 = molec 1 sec 1 r 24 : [ CRP-cAMP + CRP-cAMP ] c c 24 [ CRP-cAMP 2 ] c, c 24 = molec 1 sec 1 35 / 51

36 Reglas que describen la activación y represión del operón lactosa La tasa de transcripción del operón lactosa viene determinada por el estado del lac operon switch. Este switch lo integra el CAP site, cap, donde enlaza el activador y el operador, op, en donde enlaza el represor. El switch tiene cuatro posibles configuraciones que dependen de la ocupación del CAP site y del operator: cap.op, cap.op LacI, cap CRP camp 2.op y cap CRP camp 2.op LacI. Estas configuraciones se alcanzan mediante enlaces y disociación de las reglas de factores de transcripción. En ausencia de lactosa el represor LacI se activará y enlazará con el operador inhibiendo la transcripción del operón lactosa (regla r 25 ). No obstante, ocasionalmente LacI se cae del operador permitiendo la producción basal de proteínas (regla r 26 ). r 25 : [ LacI + op ] c c 25 [ op LacI ] c, c 25 = 0.2molec 1 sec 1 r 26 : [ op LacI ] c c 26 [ LacI + op ] c, c 26 = 5sec 1 En ausencia de glucosa existe un gran número de moléculas camp que producirán un elevado número de activadores, CRP-cAMP 2. El activador enlaza reversiblemente con el CAP site cap (reglas r 27 y r 28 ). r 27 : [ CRP-cAMP 2 + cap ] c c 27 [ cap CRP camp 2 ] c, c 27 = 0.01molec 1 sec 1 r 28 : [ cap CRP camp 2 ] c c 28 [ CRP-cAMP 2 + cap ] c, c 28 = 5sec 1 36 / 51

37 Reglas que describen el comienzo de la transcripción en el operón lactosa El primer paso en la transcripción del operón lactosa consiste en el enlace de la RNA polimerasa (RNAP) al lac operon switch. La afinidad entre el lac operon switch y la RNAP depende de la configuración del. Por una parte, cuando el CAP site está libre, cap, la RNAP rara vez enlaza con el lac operon switch produciendo una tasa de transcripción basal (rule r 29 ). Por otra parte, cuando el activador CRP-cAMP 2 ocupa el CAP site, cap CRP camp 2, se produce un incremento en la tasa de transcripción de aproximadamente 40m veces (regla r 30 ). r 29 : [ RNAP + cap ] c c 29 [ cap.rnap ] c, c 29 = molec 1 sec 1 r 30 : [ RNAP + cap CRP camp 2 ] c c 30 [ cap CRP camp 2. RNAP ] c, c 30 = 0.02molec 1 sec 1 La RNAP inicia la transcripción produciendo los nucleótidos complementarios del sitio del operador op (regla r 31 ). El sitio op marca el comienzo de la transcripción de un mrna. Obsérvese que tras la aplicación de la regla r 31 la subcadena op queda libre y, entonces, otra RNAP puede comenzar la transcripción incluso antes de que la primera RNAP acabe de transcribir el operón. Por tanto, estamos simulando la transcripción por diferentes polimerasas como un proceso concurrente. r 31 : [ RNAP.op ] c c 31 [ op. op. RNAP ] c, c 31 = 2sec 1 37 / 51

38 Reglas que describen la elongación del mrna en el operón lactosa Durante las primeras etapas de la elongación del mrna, la RNAP se mueve a lo largo del gen lacz transcribiéndolo en mrna. La RNAP comienza transcribiendo los primeros nucleótidos del gen lacz representado por lacz s y une los ribonucleótidos complementarios especificados por lacz s al mrna, op (regla r 32 ). La subcadena lacz s representa el RBS (ribosome binding site) para este gen. Una vez producido este sitio, una regla de enlace de ribosoma puede ser aplicada y la traducción puede comenzar antes de que finalice la transcripción. Por ello, en nuestra simulación, los procesos de transcripción y traducción tienen lugar en paralelo. r 32 : [ op. RNAP. lacz s ] c c 32 [ lacz s.op.lacz s.rnap ] c, c 32 = 2sec 1 Durante la transcripción se produce una cadena complementaria de mrna que es descrita por la producción del RNA site lacz m que se une al mrna representado por la subcadena op.w, w Orna, mientras el DNA transcrito lacz m se queda atrás (regla r 33 I. r 33 : [ op.w.rnap.lacz m ] c c 33 [ lacz m.op.w.lacz m.rnap ] c, c 33 = 2sec 1 Cuando la RNAP alcanza el final del gen LacZ une al sitio lacz e a la subcadena op.w, w O rna, que describe el crecimiento del mrna (regla r 34 ). La cadena lacz e representa un sitio de terminación de la traducción. Luego cuando los ribosomas alcanzan este sitio, se disocian dejando la proteína codificada por le gen lacz, β-galactosidasa. r 34 : [ op.w.rnap.lacz e ] c c 34 [ lacz e.op.w.lacz e.rnap ] c, c 34 = 2sec 1 Las siguientes reglas describen la transcripción de los genes lacy y laca, de forma similar al caso del gen lacz. r 35 : [ op.w. RNAP. lacy s ] c c 35 [ lacy s.op.w.lacy s.rnap ] c, c 35 = 2sec 1 r 36 : [ op.w. RNAP. lacy m ] c c 36 [ lacy m.op.w.lacy m.rnap ] c, c 36 = 2sec 1 r 37 : [ op.w. RNAP. lacy e ] c c 37 [ lacy e.op.w.lacy e.rnap ] c, c 37 = 2sec 1 r 38 : [ op.w. RNAP. laca s ] c c 38 [ laca s.op.w.laca s.rnap ] c, c 38 = 2sec 1 r 39 : [ op.w. RNAP. laca m ] c c 39 [ laca m.op.w.laca m.rnap ] c, c 39 = 2sec 1 38 / 51

39 Regla que describe el final de la transcripción del operón lactosa La transcripción del operón lactosa finaliza cuando la RNAP alcanza el sitio de terminación de la transcripción, al final del gen laca. Este sitio está representado por la cadena laca e. Cuando la RNAP alcanza este sitio, enlaza los ribonucleótidos, laca e al mrna op.w., w O rna, y lo disocia del operón, liberando el mrna (regla r 40 ). r 40 : [ op.w.rnap.laca e ] c c 40 [ RNAP + laca e ; op.w.laca e ] c, c 40 = 2sec 1 39 / 51

40 Reglas que describen el inicio de la traducción La traducción comienza cuando los ribosomas, Rib, reconoce el RBS de los genes lacz, lacy y laca, representados por las cadenas lacz s, lacy s y laca s (reglas r 41, r 42 y r 43 ). r 41 : [ Rib + lacz s ] c c 41 [ Rib.lacZ s ] c, c 41 = 0.16molec 1 sec 1 r 42 : [ Rib + lacy s ] c c 42 [ Rib.lacY s ] c, c 42 = 0.16molec 1 sec 1 r 43 : [ Rib + laca s ] c c 43 [ Rib.lacA s ] c, c 43 = 0.16molec 1 sec 1 40 / 51

41 Reglas que describen la traducción y la disociación de los ribosomas Durante la traducción, los ribosomas se mueven a lo largo de los sitios en el mrna representado por las subcadenas lacz m, lacy m y laca m (reglas r 44, r 45, r 47, r 48, r 50 y r 51 ). Cuando los ribosomas alcanzan el lugar de terminación, lacz e, lacy e or laca e, se disocian del the mrna abandonando las proteínas β-galactosidase, LacY or LacA (reglas r 46, r 49 y r 52 ). r 44 : [ Rib.lacZ s ] c c 44 [ lacz s.rib ] c, c 44 = 0.3sec 1 r 45 : [ Rib.lacZ m ] c c 45 [ lacz m.rib ] c, c 45 = 0.3sec 1 r 46 : [ Rib.lacZ e ] c c 46 [ β Galac + Rib + lacz e ] c, c 46 = 0.3sec 1 r 47 : [ Rib.lacY s ] c c 47 [ lacy s.rib ] c, c 47 = 0.3sec 1 r 48 : [ Rib.lacY m ] c c 48 [ lacy m.rib ] c, c 48 = 0.3sec 1 r 49 : [ Rib.lacY e ] c c 49 [ LacY + Rib + lacy e ] c, c 49 = 0.3sec 1 r 50 : [ Rib.lacA s ] c c 50 [ laca s.rib ] c, c 50 = 0.3sec 1 r 51 : [ Rib.lacA m ] c c 51 [ laca m.rib ] c, c 51 = 0.3sec 1 r 52 : [ Rib.lacA e ] c c 52 [ LacA + Rib + laca e ] c, c 52 = 0.3sec 1 41 / 51

42 Reglas que describen la degradación del mrna El mrna se degrada cuando ciertas enzimas enlazan con el RBS, lacz s, strlacy s y laca s, eliminándolos a fin de evitar que nuevos ribosomas inicien la traducción (reglas r 53, r 54 y r 55 ). r 53 : [ lacz s ] c c 53 [ r 54 : [ lacy s ] c c 54 [ r 55 : [ laca s ] c c 55 [ ] c, c 53 = 0.2sec 1 ] c, c 54 = 0.2sec 1 ] c, c 55 = 0.2sec 1 42 / 51

43 Un modelo basado en sistemas P en donde: Π lac = (O, {e, s, c}, [ [ [ ] 3 ] 2 ] 1, M 1, M 2, M 3, R e, R s, R c ) (1) El alfabeto O contiene los objetos que representan las entidades moleculares, proteínas, lugares del DNA y RNA involucrados en el sistema del operón lactosa. O = O prot O dna O rna Las etiquetas {e, s, c} identifican los tipos de compartimentos definidos por la estructura de membranas en Π lac : entorno, superficie celular y citoplasma. Las estructura de membranas consta de tres membranas que definen las tres regiones relevantes en el sistema: la membrana 1 representa el entorno, la membrana 2 representa la superficie celular y la mambrana 3 representa el citoplasma. Los multiconjuntos iniciales M1, M 2 y M 3 son parte de los parámetros de nuestro sistema de especificación Π lac. La etiqueta e se asocia a la membrana 1, la etiqueta s se asocia a la membrana 2 y la etiqueta c se asocia a la membrana 3. Los conjuntos de reglas de reescrituras sobre multiconjuntos de objetos y de cadenas, Re, R s y R c, están asociados a las regiones relevantes. Estas reglas describen las interacciones moleculares que tienen lugar en los compartimentos especificados. R e = {r 4, r 8 } R s = {r 2, r 3, r 5, r 6, r 9, r 11, r 18, r 20, r 22 } R c = {r 1, r 7, r 10, r 12, r 13, r 14, r 15, r 16, r 17, r 19, r 21, r 23,..., r 55 } 43 / 51

44 Parámetros del sistema Parámetros de nuestro sistema de especificación P(Π lac ): los multiconjuntos iniciales y las constantes estocásticas asociadas a las reglas. P(Π lac ) = (M 0 (Π lac ), C(Π lac )) En nuestro caso, las constantes estocásticas tendrán unos valores fijos (de un conjunto C). Se han detrerminado gracias a que el sistema del operón lactosa es el ejemplo canónico de regulación de genes en procariotas. Los multiconjuntos iniciales constituyen los parámetros actuales del sistema: especificaremos el número de objetos y cadenas presentes inicialmente en cada compartimento. Obviamente, diferenetes escenarios serán representados a través de diferentes multiconjuntos iniciales. Para los multiconjuntos iniciales del sistema (M 1, M 2, M 3 ), consideraremos cuatro posibles escenarios iniciales en el entorno {M 1 1, M2 1, M3 1, M4 1 }, y un único escenario inicial en la superficie celular {M 2 } y en el citoplasma {M 3 }. Ausencia de glucosa y de lactosa en el entorno: M1 1 = (e, λ, λ). Abundante glucosa y ausencia de lactosa en el entorno: M1 2 = (e, Gluc300000, λ). Ausencia de glucosa y abundancia de lactosa en el entorno: M1 3 = (e, Lact300000, λ). Abundancia de glucosa y de lactosa en el entorno: M1 4 = (e, Gluc Lact , λ). 44 / 51

45 Para la superficie celular hay un único escenario inicial: M 2 = (s, EIICB EIICB P AC LacY 3000 }, λ) Para el citoplasma hay un único escenario inicial: M 3 = (c, w 3, s 3 ), en donde w 3 representa los objetos iniciales w 3 = RNAP Rib EIIA EIIA P ATP β Galac LacI CRP y s 3 la cadena inicial que representa el operón lactosa: {}}{{}}{{}}{ cap. op. lacz s.lacz m..lacz m.lacz e. lacy s.lacy m..lacy m.lacy e. laca s.laca m..laca m.laca e Estos parámetros producen una familia, F lac (Π lac ; (M 0, C)), que consiste de cuatro diferentes sistemas P que corresponden a los distintos escenarios considerados. 1. PSM 1 = (Π lac ; (M 1 1, M 2, M 3 ), C) 2. PSM 2 = (Π lac ; (M 2 1, M 2, M 3 ), C) 3. PSM 3 = (Π lac ; (M 3 1, M 2, M 3 ), C) 4. PSM 4 = (Π lac ; (M 4 1, M 2, M 3 ), C) 45 / 51

46 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (I) PSM 1 : comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno Cuando la glucosa no está presente en el entorno, EIIA P no es consumido y, por ello, se activa AC sobre la superficie celular. Una vez activado el AC se produce un elevado número de moléculas de camp, como muestr la figura siguiente. camp enlaza con la proteína CRP y produce el complejo CRP-cAMP que por dimerización produce el activador CRP-cAMP camp time 46 / 51

47 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (I) PSM 1 : comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno El CAP site será ocupado por moléculas CRP-cAMP 2 que asistirán a la RNA polymerase para que enlace con el promotor. No obstante, como no hay lactosa en el entorno, no se producirá alolactosa en el citoplasma y, por tanto, el represor estará activo y colapsará el operador. En estas condiciones un estado característico del operón lactosa (representado por una cadena) se obtiene en nuestro simulador. cap-crp-camp 2 RNAP op-laci lacz s lacz m op Rib lacz s lacz m RNAP lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m op Rib lacz s lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m RNAP lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz m lacz e lacy s lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy m lacy e laca s laca m laca m laca m laca m laca e (2) Obsérvese que el CRP-cAMP 2 está en el CAP site asistiendo a la RNAP para enlazar al promotor del operón lactosa. Una vez enlazado, la RNA está lista para la transcripción siempre que el represor libere al operador, si no bloquerá el inicio de la transcripción. En resumen, la configuración del lac operon switch en este escenario, cap CRP-cAMP 2.RNAP.op LacI, produce un leve incremento en la expresión de genes codificados en el operón lactosa: sin azúcar en el entorno la bacteria procede a la producción basal de lactosa. 47 / 51

48 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (II) PSM 1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y sin lactosa en el entorno Al no haber lactosa en el entorno, no se producirá lactosa en el citoplasma y el represor estará activo enlazándose al operador del operón. En estas condiciones la configuración del switch será cap.op LacI que únicamente permite la transcripción del operón lactosa a muy bajos niveles como puede observarse en el bajo numero de RNAP transcribiendo el operón que aparece en la siguiente figura Active RNAP time Al estar presente la glucosa en el entorno hay poca necesidad de metabolizar lactosa. 48 / 51

49 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (III) PSM 1 : comportamiento del sistema sin glucosa pero con abundante lactosa en el entorno En estas condiciones: Por una parte, la ausencia de glucosa en el entorno permite que el enzima EIIA P interactúe con AC para sintetizar un elevado número de camp, lo que producirá un alto número de activadoras CRP-cAMP 2. Por ello, el CAP site será ocupado propiciando el reclutamiento de RNAP, lo cual potenciará la transcripción. Por otra parte, puesto que la lactosa es abundante en el entorno será transportada por LacY, expresada a nivel basal, en el citoplasma. La β-galactosidasa también está presente en el citoplasma a nivel basal permitiendo la escisión de la lactosa en galactosa y glucosa, dando lugar a la alolactosa que actuará como inductor enlazando al represor LacI. En la siguiente figura se observa cómo los represores activos son inhibidos rápidamente cuando la lactosa es abundante. Bajo estas condiciones, el operón lactosa será, a la vez, inducido (ningún represor se unirá al operador) y activado (el activador se enlazará al CAP site). Por tanto, la configuración del switch será cap CRP-cAMP 2.op y los genes codificados en el operón se transcribirán masivamente, como se deduce del número de RNAP que están transcribiendo el operón (figura izq.). Esto provocará un incremento en el número de moléculas de β galactosidasa y LacY (figura der.) Active Repressors Active RNAP time time 49 / 51

50 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (IV) PSM 1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno La presencia de glucosa produce un bajo número de activadores y el operón lactosa no será activado. Por tanto, incluso conla presencia de lactosa, los genes codificados por el operón serán transcritos a muy bajos niveles. También existirá poca absorción de lactosa desde el entorno y el LacY será inhibido. Obsérvese en la siguiente figura que el número de moléculas de glucosa en el entorno decrece mientras que la lactosa permanece casi constante, lo cual indica que pocas moléculas de lactosa son transportadas al interior de la bacteria Number of molecules Glucose Lactose time 50 / 51

51 Análisis de la regulación de genes en el operón lactosa (IV) PSM 1 : comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno No obstante, alguna lactosa estrá presente ne el citoplasma y producirá alolactosa, inhibiendo al represor permitiendo la transcripción a bajos niveles. Así pues, en estas condiciones, la configuración del lac operon switch será cap.op. Luego el operón lactosa será inducido pero ningún activador CRP-cAMP 2 se unirá al CAP site: no habrá transcripción o se producirá a bajos niveles como puede verse en la siguiente figura donde el número de moléculas de galactosidasa y LacY comienza a crecer muy lentamente Galactosidase Cytoplasmic LacY time time En tanto que la bacteria puede metabolizar glucosa, tiene poca necesidad de metabolizar lactosa. No obstante, puesto que la lactosa está presente, la bacteria no ignorará completamente ese azúcar adicional. 51 / 51